Hämodialyse erhöht trotz verbesserter Biokompatibilität den oxidativen Stress durch kohlenstoffzentrierte Radikale

Leukozytenaktivierung und die daraus resultierendeoxidativen Stressverursacht durchbioinkompatible MaterialienwährendAuswirkungen der Hämodialysedie Prognose der Patienten. Trotz mehrfacher Fortschritte inHämodialyse-Dialysatoren, DiePrognose der HämodialysePatienten mit Komplikationen, die eng damit verbunden sindoxidativen Stress, wie zum BeispielDiabetes mellitus bleibt schlecht. Daher haben wir die Auswirkungen von neu bewertetHämodialyseEntwicklung mehrerer reaktiver Sauerstoffspezies unter Verwendung elektronenspinresonanzbasierter Methoden zur weiteren VerbesserungBiokompatibilitätInHämodialyse. Wir haben 31 Patienten in stabilem Zustand aufgenommen, die sich einer Hämodialyse mit High-Flux-Polysulfon-Dialysatoren unterzogen. Die Auswirkungen der Hämodialyse auf reaktive Sauerstoffspezies wurden mit zwei Methoden bewertet: MULTiS, das die Serumabfangaktivitäten gegen mehrere hydrophile reaktive Sauerstoffspezies bewertet, und i-STrap, das lipophile Kohlenstoffzentrumsradikale erkennt. Ähnlich wie in früheren Studien stellten wir fest, dass sich die Aktivität zum Abfangen von Hydroxylradikalen im Serum nach der Hämodialyse deutlich verbesserte. Im Gegensatz zu früheren Studien stellten wir fest, dass die Fängeraktivität gegen Alkoxylradikale danach deutlich verringert warHämodialyse. Darüber hinaus zeigten Patienten mit Diabetes mellitus nach der Hämodialyse eine Abnahme der Serumabfangaktivität gegen Alkylperoxylradikale und einen Anstieg lipophiler Kohlenstoffzentrenradikale. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz umfassender Verbesserungen bei Dialysatormembranen die Formen vonreaktive Sauerstoffspeziesdie während der Dialyse eliminiert werden können, sind begrenzt und mehrere reaktive Sauerstoffspezies verbleiben während der Hämodialyse in erhöhten Mengen.

Schlüsselwörter:Hämodialyse, Biokompatibilität, Alkylperoxylradikal-Elektronenspinresonanz, MULTiS, i-STrap

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Chronisches Nierenleiden(CKD) ist bekanntermaßen mit verbundenhoher oxidativer Stress. (-4)Ansammlung von urämischem Toxins mit prooxidativen Eigenschaften, die dazu führenMikroentzündungverursacht durch dieErhöhung des proinflammatorischen Zytokinssist das Hauptmerkmal vonCKD-Pathophysiologie. (s-, Hämodialyse (HD), eine weit verbreitete Nierenersatztherapie, wirkt als zweischneidiges Schwert zur Reduzierung von oxidativem Stress bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung. Aktivierung polymorphkerniger Leukozyten durch Kontakt mit der Membran oder anderen künstlichen Oberflächen in Huntington-Kreisläufen , ist die Hauptursache für oxidativen Stress, der durch die Huntington-Krankheit verursacht wird. s-) Umgekehrt kann die Entfernung prooxidativer urämischer Toxine, insbesondere niedermolekularer hydrophiler Verbindungen wie Trimethylamin-Noxid oder Guanidinoverbindungen, die antioxidative Natur der Huntington-Krankheit verbessern. Dies führt zu einer langfristigen Verbesserung der Überlebensrate und LebensqualitätPatienten mit CKD. (2,13) ​​Darüber hinaus führt die Korrektur der Azidose zur Reaktivierung antioxidativer Enzyme und zur Verringerung der Volumenüberlastung, was zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen führt. Gefäßkomplikationen sind antioxidative Mechanismen. (4 Daher ist es für HD-Materialien notwendig, die Leukozytenaktivierung zu minimieren und die antioxidative Wirkung zu maximieren. Um dieses Problem zu lösen, wurden antioxidative und biokompatible HD-Materialien entwickelt, wie beispielsweise der mit Vitamin E beschichtete Dialysator. (si7) Trotz der zahlreichen Fortschritte bei HD-Dialysatoren Die Prognose von Huntington-Patienten bleibt unbefriedigend, insbesondere von Patienten mit Diabetes mellitus (DM), einer Krankheit, die einen stark oxidativen Zustand fördert. (8) Diese Bedenken sind teilweise darauf zurückzuführen, dass die Details in vivo sehr unterschiedlich und komplex sindoxidative stressbedingte Reaktionenwurden nicht ausreichend analysiert. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Wirkung von HD auf die Dynamik reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als vorgelagerte Ereignisse oxidativer Stressreaktionen zu klären, basierend auf dem Konzept, dass jeder Zielort oxidativer und antioxidativer Reaktionen im Körper biochemisch beschrieben werden muss in einer bestimmten Zeit und an einem bestimmten Ort. Eine Erklärung hierfür ist aMangel an detaillierter Analyseder vorgelagerten Seite oxidativer stressbedingter Reaktionen, die diese zellulären Reaktionen stimulieren. Die Identifizierung von ROS, die als Stimulatoren oxidativer Stressreaktionen oder Wechselwirkungen zwischen ROS zur Erzeugung oxidativer Stimulatoren wirken, ist aufgrund der hohen Reaktionsgeschwindigkeiten und komplexen Reaktionsketten schwierig. Da ROS nicht einheitlich sind und einzelne ROS bei In-vivo-Reaktionen spezifische Eigenschaften aufweisen, ist eine Analyse mehrerer ROS erforderlich. (9-2n Um die Biokompatibilität basierend auf der Verwendung von antioxidativen und biokompatiblen Materialien zu verbessern, muss man daher die durch die Huntington-Krankheit verursachten Veränderungen in der ROS-Dynamik verstehen.

Um die ROS-Dynamik während der Huntington-Krankheit zu untersuchen, verwendeten wir zwei neu entwickelte Methoden, die auf Elektronenspinresonanz (ESR) basieren. der Multiple Hydrophilic Free-Radical Scavenging Assay (MULTIS) und der Lipophilic Radical Detection Assay an Vollblut (i-STrap). Obwohl die Forschung zur ROS-Fängeraktivität durch ESR nicht umfangreich ist, bleibt sie die einzige verfügbare Methode zur Identifizierung des Typs und zur Untersuchung der Dynamik von ROS. Die Methode kombiniert ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Durchflusssystem mit einem ESR-System und verwendet 5-(2,2-Dimethyl-1.3-Propoxycyclophosphoryl)-5- Methyl-1-pyrrolinNoxid(CYPMPO) als Spinfalle. MULTIS bietet eine höhere Empfindlichkeit und Stabilität für die ROS-Abfangmessung als herkömmliche ESR-Assays.22-24) Einer unserer Co-Autoren hat zuvor über MULTIS-gemessene ROS-Abfangaktivitäten bei Patienten mit CKD im Stadium 5 berichtet. Allerdings haben sie die Wirkung von HD nicht bewertet.e2) Darüber hinaus ist die i-STrap-Methode eine ESR-basierte Methode, die ROS im Vollblut mithilfe von 2-Diphenylphosphinoyl-2-methyl-3 nachweist,{ {20}}Dihydro-2H-Pyrrol-N-Oxid (DPhPMPO) als Spinfalle und misst den ESR nach einer organischen Extraktion, was lipophile ROS widerspiegelt.2s.26 In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Werte mehrerer ROS waren erhöht und durch die Huntington-Krankheit nicht eliminiert, was darauf hindeutet, dass radikalische Kettenreaktionen nach der Huntington-Krankheit immer noch nicht ausreichend kontrolliert werden. Dies kann Auswirkungen auf die habenPrognose von Patienten mit CKD.

Materialen und Methoden

Themen und Einverständniserklärung. Alle an menschlichen Probanden durchgeführten Verfahren wurden nach Einholung individueller schriftlicher Zustimmung durchgeführt. Das verwendete Protokoll wurde vom Ausschuss der Tsukuba University of Technology genehmigt (Autorisierungsnummer 201809). Dies ist eine Beobachtungsstudie; Daher wurden Eingriffe an den Patienten durchgeführt. Insgesamt wurden 31 stabile Huntington-Patienten in die Studie einbezogen. Wir haben für jeden Patienten klinische und demografische Informationen eingeholt und aufgezeichnet. Alle Patienten wurden mit High-Flux-Polysulfon-Membrandialysatoren (Toray Medical Co., Ltd., Tokio, Japan) mit unterschiedlichen Membranoberflächen behandelt, angepasst an die Körperkonstitution jedes Einzelnen. Die Patienten wurden abhängig von der Ursache ihrer Nierenerkrankung im Endstadium in zwei Gruppen eingeteilt: die Nicht-Diabetiker-Gruppe (Nicht-DM-Gruppe, n=17) und die Diabetiker-Gruppe, n=14).

Beispielsammlung. Zu Beginn und am Ende der Dialysebehandlung wurden Blutproben aus der Entnahmestelle auf der arteriellen Seite des HD-Kreislaufs entnommen. Für MULTIS-Messungen wurden die Seren getrennt und in einem Gefrierschrank bei {{0}} Grad gelagert (bis die Messung durchgeführt wurde, für i-STrap-Messungen). Vollblutproben wurden in zugelassenen, mit Heparin beschichteten Röhrchen gesammelt vor den Messungen eine Stunde stehen lassen. Messungen der multiplen Radikalfängeraktivität im Serum. Hydrophile ROS-Fängeraktivitäten wurden mit der MULTIS-Methode unter Verwendung zuvor beschriebener Protokolle mit geringfügigen Modifikationen gemessen.2227) Fängeraktivitäten gegen fünf ROS, nämlich Hydroxylradikal (OH) , Superoxid(0,"), Alkoxylradikal (RO"), Alkylperoxylradikal (ROO") und Singulettsauerstoff ('0,) wurden gemessen. Ein X-Band-ESR-Spektrometer( RR-Xl ESR: Radical Research Inc., Tokio, Japan) mit 100 kHz Feldmodulation und WN-RAD-Betriebssoftware (Radical Research Inc.) wurde verwendet. Die verwendeten ESR-Spin-Trapping-Reagenzien waren CYPMPO für „ OH, O, RO' und ROO' und 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin (TEMP) für 'O. Die typischen Spektrometereinstellungen waren wie folgt: Feldmodulationsbreite 0,1 mT; Mikrowellenleistung, 10 mW; Feld-Scan-Breite und -Rate+7,5 mT/2 min; und Zeitkonstante, 0,1 s. Jeder ROS wurde durch In-situ-Beleuchtung mit UV-/sichtbarem Licht von einem IlluminatorRUVF-203SR UV-Illuminator, Radical Research Inc.) erzeugt, der mit einer 200-W-Mitteldruck-Quecksilber-/Xenon-Bogenlampe ausgestattet war Quarzlichtleiter, verbunden mit dem Resonatorhohlraum. Die zur Herstellung von ROS verwendeten Lichtquellen, Beleuchtungszeiten, Vorläufer und Photosensibilisatoren sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die ROS-Fängeraktivitäten wurden gemäß einer zuvor beschriebenen Methode22) berechnet und in die Einheit umgewandelt, die bekannten reinen Fängern entspricht: Glutathion (GSH) für OH und 'O, Superoxiddismutase (SOD) für O, 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-Carbonsäure (Trolox) für RO' und a -Liponsäure für ROO'MULTIS-Messungen für jeden ROS wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Messung der Lipophilie

Ros-Fängeraktivität im Vollblut mit i-Strap. Die lipophile ROsscavenging-Aktivität wurde mit dem i-STrap ESR-Messgerät ki (Dojin-Glocal/Dojindo, Kumamoto, Japan) basierend auf dem Protokoll des Herstellers und einem früheren Bericht gemessen.2s Diese Methode basiert auf der Konkurrenzreaktion zwischen Antioxidantien im Vollblut und DPhPMPO mit dem tert-Butylhydroperoxid (BuOOH-Radikal). Vollblutproben wurden mit DPhPMPO (1{{10}} mM) und Test-BuOOH (10 mM) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Spin Addukte in der organischen Phase wurden mit Chloroform- und Methanollösungen extrahiert; ESR-Messungen wurden mit diesen organischen Proben durchgeführt. Die Messbedingungen waren die gleichen wie für die MULTIS-Messung, mit Ausnahme der Feldscanbreite und -rate, die auf +5 eingestellt waren. 0,0 mT/2 Min. Es gab keine spezifischen Antioxidantien für die i-STrap-Messung; daher wurde die Abfangaktivität als 10/-1-Wert ausgedrückt, wobei „0“ die Signalintensität ohne Probe und „' das Signal bezeichnet Intensität mit einer Probe. (28)Reagenzien. CYPMPO wurde von RR INC. (Japan) bezogen; Riboflavin, 2,2'-Azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid (AAPH), Text-BuOOH, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Bengalrosa wurden von Sigma-Aldrich Japan (Tokio, Japan) und TEMP gekauft von Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japan). Wasserstoffperoxid und Puffer wurden von WakoChemical Co. (Osaka, Japan) bezogen. Statistische Analyse. Die statistische Analyse wurde mit der Computersoftware Prism 6 für Mac OS gepaarter T-Test. Die Daten wurden als Mittelwerte mit einem 95 %-Konfidenzintervall (95 %-KI) ausgedrückt.