Hepatoprotektive Wirkungen von Chitosan auf Thioacetamid-induzierte Lebertoxizität bei männlichen Albino-Ratten

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Abstrakt: Chitosan, ein aus Chitin gewonnenes Naturprodukt, hat aufgrund seiner einzigartigen biologischen Aktivitäten als vielversprechende Polysaccharidverbindung viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Diese Studie wurde entwickelt, um das mögliche Verbesserungspotenzial von Chitosan, als natürliches Meeresprodukt, weiter zu untersuchenRegeneration der Leberbei durch Thioacetamid induzierter Hepatotoxizität bei männlichen Albino-Ratten. Fünfzig Tiere wurden in 5 Gruppen eingeteilt, einschließlich der Kontrollgruppe; eine Gruppe, der intraperitoneal eine Einzeldosis Thioacetamid (300 mg/kg Körpergewicht) zur Induktion von Lebertoxizität injiziert wurde; eine Gruppe, die 14 Tage lang eine Diät mit 5 Prozent Chitosan erhielt; Eine Gruppe erhielt 14 Tage lang eine Diät mit 5 Prozent Chitosan, dann wurde ihnen einmal Thioacetamid (300 mg/kg Körpergewicht) injiziert, und der letzten Gruppe wurde dann einmal Thioacetamid (300 mg/kg Körpergewicht) injiziert eine Diät mit 5 Prozent Chitosan für 14 Tage. Die biochemischen Ergebnisse zeigten, dass die Einnahme von Chitosan vor oder nach einer Thioacetamid-Vergiftung die Lebermarker (ALAT, ASAT, GGT, ALP, Albumin) und die Nierenfunktionen sowie Plasma-TNF- verbesserte. Die QRT-PCR-Analyse zeigte, dass Chitosan die quantitative Genexpression von TNF-, Survivin und c-Myc in der Leber herunterregulierte. Darüber hinaus verbesserte Chitosan das histologische Bild der Leber. Diese Studie zeigte die vielversprechende Wirkung von Chitosan bei der Leberregeneration.

Schlüsselwörter: Thioacetamid; Chitosan; Leberregeneration; Überleben; c-myc; Tumor-Nekrose-Faktor- .

1. Einleitung

Leberkrankheitensind die lebensbedrohlichsten Erkrankungen weltweit, insbesondere in Ägypten [1]. In Ägypten sind Lebererkrankungen die Hauptursache für jährliche Todesfälle [2, 3]. Die Leber ist aufgrund ihrer Rolle im Metabolismus der meisten Xenobiotika, wie Arzneimittel und Fremdverbindungen, stark anfällig für Toxizität. Glücklicherweise könnte die Zellproliferation der Leber helfen, sich nach einem großen Zellverlust zu regenerieren [4,5]. Folglich sind alternative Behandlungen wesentliche Anforderungen, die die derzeitigen Therapien ersetzen oder parallel zu ihnen eingesetzt werden müssen. Chitosan ist eine vielversprechende natürliche Polysaccharidverbindung. Es konnte aus den Schalenabfällen von Krabben, Garnelen und Langusten und der Zellwand von Pilzen gewonnen werden.

Chitosan ist eine gute Quelle für Ballaststoffe [6,7]. Es hat zahlreiche gesundheitliche Vorteile wie Immunregulierung, Antitumoraktivität, Leberschutz, Antidiabetikum und Antioxidans[8]. antibakterielle, hypolipidämische, entzündungshemmende [9], Wundheilungsaktivitäten [10,11] und hepatoprotektive Wirkung [12I. Die Ungiftigkeit und die gute biologische Abbaubarkeit machen Chitosan zu großen Vorteilen bei der Verwendung bei der Bewältigung von oxidativem Stress [13].

Kontaminierte Lebensmittel und die Exposition gegenüber Umwelt- oder chemischen Stoffen bei der Arbeit sind mögliche Quellen für toxische Verbindungen. Von diesen toxischen Verbindungen ist Thioacetamid (TAA), eine weit verbreitete schwefelhaltige Verbindung, die in der Umwelt als organische Schwefelverbindungen vorkommt und in vielen technischen Anwendungen verwendet wird [14]. Es wird auch verwendet, um Leberfibrose bei Ratten zu induzieren, um die therapeutische Wirkung von Antifibrotika zu untersuchen [15]. Normalerweise zielt TAA auf die Leber ab und induziert daher eine Leberschädigung, indem es reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produziert [16,17]. Die Thiosulfatgruppe von TAA wird durch das Oxidasesystem weiter verstoffwechselt, um Acetamid und TAA-S-Oxid zu bilden [18]. Danach. Es wird TAA-S-Dioxid gebildet, das sich kovalent an die Makromoleküle der Leber bindet und eine Leberschädigung auslöst. Diese Schädigung erfolgt in Form einer zentrilobulären Nekrose [19] und einer ROS-Bildung, die zusammen den Zelltod durch oxidativen Stress verursachen [10,20]. Da eine Einzeldosis von TAA Hepatozytendegeneration, entzündliche Zellinfiltration verursacht und das Niveau von ALP, ALT und AST erhöht [21].

Apoptose ist ein normalerweise auftretender Zelltodmechanismus, der verwendet wird, um gesundes Gewebe zu entwickeln und zu erhalten [22]. Viele Krankheiten könnten aufgrund einer fehlregulierten Apoptose entstehen, wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Immunschwächekrankheiten. Interessanterweise könnte die Apoptose selbst die Zellproliferation und Geweberegeneration in einem Mechanismus stimulieren, der als Apoptose-induzierte Proliferation bekannt ist. Darüber hinaus könnte der apoptotische Prozess durch eine Gruppe von Familienproteinen blockiert werden, die als Inhibitor von Apoptoseproteinen (IAPs) bekannt sind, indem sie die Caspase-Aktivität hemmen. Es gibt acht identifizierte Mitglieder der IAP-Familie im Säugetiergenom [23]. Das wichtigste Protein in dieser Familie ist Survivin, das kleinste Mitglied dieser Familie. Es wird vom BIRC5-Gen kodiert, das sich auf Chromosom 17 in Band 17q25 befindet.3.c-myc-Protein wurde festgestellt, dass es beim Regenerationsprozess der Leber stark erhöht ist [24-26]. TNF- könnte durch zwei entgegengesetzte Mechanismen wirken. Es könnte als Initiator des Zelltods wirken; alternativ könnte es die Zellproliferation verstärken. Folglich spielt es eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von Virushepatitis und alkoholischen und nichtalkoholischen Lebererkrankungen [27,28].

Die vorliegende Studie untersuchte die Potenz von Chitosan bei der Verbesserung der Geweberegeneration gegen durch TAA induzierte Lebertoxizität bei Ratten. Die Wirkung von Chitosan auf Leberfunktionen und Nierenfunktionen wurde untersucht. Außerdem wurden die Messungen des entzündungsfördernden Zytokins TNF- im Plasma und die quantitative Analyse der Lebergewebe-Genexpressionsspiegel von Survivin, c-Myc-Genen und TNF- durchgeführt. Zusätzlich wurde das histologische Merkmal der Leber untersucht.

Cistanchekann die Ultrastruktur von Leberzellen anpassen, die Proteinsynthese fördern und die Leber schützen.Gesamtglycoside von Phenylethanolkann die Menge an Leberglykogen erhöhen,Echinacosidkann die Sodenaktivität verbessern, und Verbascosid kann freie Radikale abfangen und die Apoptose von Stammzellen reduzieren. Cistanche kann auch das Kreislaufsystem regulieren und folgende Wirkungen haben: ischämisches Myokard schützen; Blutfette senken, Atherosklerose widerstehen und Thrombose widerstehen; den peripheren Gefäßwiderstand verringern, periphere Blutgefäße erweitern und den Blutdruck senken; Schützen Sie die Leber und widerstehen Sie einer Fettleber.

2. Materialien und Methoden

2.1.Chemikalien.

TAA wurde von Aldrich Chem Co., England, als reine Kristalle bezogen; es wurde in Kochsalzlösung gelöst und vor jeder Injektion frisch zubereitet.

Chitosan (CS) wurde von Sigma-Aldrich bezogen (Molekulargewicht =100 KDa). Chitosan, ein wichtiges Polysaccharid marinen Ursprungs, wird aus Schalen von Krebstieren gewonnen und aufgrund seiner intrinsischen Sicherheit bei oraler Einnahme als neue Ballaststoffquelle in der Arzneimittelentwicklung eingesetzt [29].

2.2.Experimentelles Design.

Fünfzig erwachsene männliche Wistar-Albino-Ratten mit einem Gewicht von etwa 120-150 g wurden von der Animal House Colony des National Research Centre, Kairo, Ägypten, bezogen. Die Tiere wurden in Edelstahlkäfigen unter Standardlaborbedingungen mit guter Belüftung und einem 12--Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ± 5 Prozent gehalten, mit freiem Zugang zu handelsüblichem Laborfutter und Leitungswasser.

Vor Beginn des Versuchsprotokolls wurden die Ratten 2 Wochen lang an die Versuchsbedingungen adaptiert. Die menschliche Pflege wurde gemäß den Kriterien der Standardinstitution für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren gemäß der Methode angewendet, die von der Ethikkommission des National Research Center (FWA 00014747) bestätigt wurde, die die Empfehlungen des National Institutes of Health Guide verfolgt for Care and Use of Animals in Laboratory (Veröffentlichung Nr. 85-23, überarbeitet 1985).

Die Tiere wurden nach der Eingewöhnungszeit (jeweils 10 Ratten) wie folgt in fünf Gruppen eingeteilt:

Gruppe (1): normale gesunde Tiere dienten als Kontrollgruppe.

Gruppe (2): (TAA) Gruppe, in der den Ratten TAA (gelöst in 0,9 % normaler Kochsalzlösung) in einer Einzeldosis (300 mg/kg Körpergewicht) nach Mustafa et al. intraperitoneal injiziert wurde. [30] zur Induktion von Lebertoxizität.

Gruppe (3): Chitosan-Gruppe, in der die Tiere mit Chitosan-Mischgrundnahrung in einem Verhältnis von 5 Prozent (50 g plus 950 g Grundnahrung) nach AboZaid et al. gefüttert wurden. [9] für 14 Tage.

Gruppe (4): Chitosan, dann TAA-Gruppe, in der die Tiere 14 Tage lang eine Diät erhielten, die 5 Prozent Chitosan 9] enthielt, und dann intraperitoneal eine Einzeldosis TAA (300 mg/kg Körpergewicht) wie oben erwähnt injizierten.

Gruppe (5): TAA, dann Chitosan-Gruppe, in der den Tieren intraperitoneal eine TAA-Einzeldosis (300 mg/kg Körpergewicht) wie oben erwähnt injiziert wurde, und dann 14 Tage lang mit einer Diät gefüttert wurde, die 5 % Chitosan enthielt.

Das Körpergewicht jedes Tieres wurde jede Woche und am Ende des Experiments aufgezeichnet, um die Veränderung des Körpergewichts zu überwachen. Am Ende des Versuchszeitraums fasteten die Tiere 12 Stunden lang. Dann wurden sie durch Inhalation von Diethylether betäubt; Blutproben wurden aus dem retroorbitalen Venenplexus in Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von heparinisierten sterilen Glaskapillaren entnommen.

Zur Abtrennung von Plasma wurde ein Teil aller Blutproben auf EDTA, der andere Teil in einem antikoagulanzienfreien Röhrchen zur Abtrennung des Serums aufbereitet. Sowohl Serum- als auch Plasmaproben wurden durch Kühlzentrifugation bei 3000 U/min für 15 Minuten bei 4 Grad getrennt. Aliquots von Plasma und Serum wurden bei -20 Grad für die biochemische Analyse aufbewahrt.

Sobald das Blut gesammelt wurde, wurden die Tiere durch Zervikalenthauptung getötet

Die Leber jeder Ratte wurde entfernt und gründlich unter Verwendung von isotonischer Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und in zwei Abschnitte geteilt; der erste Abschnitt wurde direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren und vor der RNA-Isolierung für die Genexpressionsanalyse bei -80 Grad konserviert. Im Gegensatz dazu wurde die zweite Portion in formaler Kochsalzlösung (10 Prozent) fixiert, um bei der histopathologischen Untersuchung verwendet zu werden.

2.3.Biochemische Analyse.

Serum-Aspartat-Aminotransferase (ASAT), Alanin-Aminotransferase (ALAT), alkalische Phosphatase (ALP) und Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) sowie Albumin

Harnstoff- und Kreatininspiegel wurden spektrophotometrisch unter Verwendung von Reagenzien-Kits abgeschätzt, die von Bio-Diagnostic Co., Ägypten, bezogen wurden. Die Plasma-Tumor-Nekrose-Faktor-alpha(TNF-a)-Konzentration wurde mittels ELISA-Technik unter Verwendung eines Ratten-TNF-ELISA-Kits abgeschätzt, das von Glory Science Co., Ltd., USA, bezogen wurde.

2.4. Genexpressionsanalyse.

Mittels quantitativer Analyse (Real-Time PCR) wurde die Expression von Survivin-, c-Myc- und TNF-Genen in Lebergewebeproben bestimmt.

2.4.1. RNA-Isolierung, Aufreinigung und quantitative Echtzeit-RT-PCR.

RNA wurde aus einer 100-mg-Lebergewebeprobe durch Qiazol-Puffer (Qiagen, USA) isoliert; RNA wurde anschließend unter Verwendung des RNAeasy Mini-Kits (Qiagen, USA) aufgereinigt; RNA wurde revers transkribiert und die resultierende cDNA wurde dann amplifiziert. -Actin-, Survivin-, c-myc- und TNF-alpha-Genkopienzahlen wurden unter Verwendung des QuantiFast Sybergreen RT-PCR-Kits (Qiagen, USA) quantifiziert. Alle Proben wurden dreifach getestet und die Kopienzahlen wurden auf 100 000 Kopien des Housekeeping-Beta-Actin-Gens normalisiert. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die RT- und anschließenden PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 50 Grad für 10 Minuten, 95 Grad für 5 Minuten, 95 Grad für 15 Sekunden, dann 60 Grad für 30 Sekunden, die Anzahl der Zyklen betrug 40 Zyklen . MiniOpticonTM Bio-Rad Real-Time Thermal Cycler wurde für die Genexpressionsquantisierung verwendet.

2.5. Histopathologische Untersuchung.

Nach der Fixierung von Lebergeweben in 10-prozentiger formaler Kochsalzlösung für 24 Stunden wurden Gewebeproben in fließendem Leitungswasser gewaschen; dann einer Dehydratisierung mit Ethyl (Reihenverdünnungen aufwärts bis zu absolutem Ethyl) unterzogen. Die Proben wurden in Xylol geklärt und bei 56 Grad in einem Heißluftofen für 24 Stunden in Paraffin eingebettet. Die Wachs-Gewebe-Blöcke wurden zum Schneiden mit einer Dicke von 4 Mikrometern mit einem Schlammmikrotom präpariert. Die Schnitte wurden entparaffiniert, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und schließlich lichtmikroskopisch untersucht [31].

2.6. Statistische Analyse.

Die Datenanalyse erfolgte mit Version 13 des computergestützten Statistikpakets für Sozialwissenschaften. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Signifikanz des Unterschieds wurde unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem LSD-Post-Hoc-Vergleichstest bei p Weniger als oder gleich 0,05, was als statistisch signifikant definiert wurde, bestimmt.

3. Ergebnisse und Diskussionen

3.1.Ergebnisse.

Die in Abbildung 1 dargestellten Daten zeigten, dass die Körpergewichtszunahme der TAA-vergifteten Tiergruppe signifikant verringert war (-308,5 Prozent), während die der Chitosan-nur-Gruppe eine signifikante Veränderung (50 Prozent) zeigte, wenn beide Gruppen es waren im Vergleich zur Kontrollgruppe. Interessanterweise zeigte die Chitosan-dann-TAA-Tiere-Gruppe einen signifikanten Anstieg (289,7 Prozent) der Körpergewichtszunahme; in ähnlicher Weise zeigte die Gruppe der TAA- und dann der Chitosan-Tiere einen signifikanten Anstieg (239,56 Prozent) der Körpergewichtszunahme, wenn beide Gruppen mit der Gruppe der TAA-vergifteten Tiere verglichen wurden.

In Bezug auf Leberfunktionstests beeinträchtigte die Fütterung normaler Ratten mit einer 5-prozentigen Chitosan-Basaldiät für 14 Tage weder die Leber- noch die Nierenfunktionstests, was ihre sichere Wirkung bei dieser Konzentration in der Diät widerspiegelt; Im Gegensatz dazu erhöhte die TAA-induzierte Lebertoxizität bei Ratten die Aktivität der Serum-Aspartat-Aminotransferase (ASAT) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (94,47 Prozent). Allerdings wurde eine signifikante Abnahme (-32 Prozent und -15,4 Prozent) der ASAT-Aktivität im Serum in beiden mit Chitosan gefütterten Regimen (Chitosan-TAA- bzw. TAA-Chitosan-Gruppen) im Vergleich zu der beobachtet TAA-vergiftete Gruppe. Ein signifikanter Anstieg (91,89 Prozent) der Serum-Alanin-Aminotransferase (ALAT)-Aktivität wurde in der TAA-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe verzeichnet. In einer vielversprechenden Wirkung führten die Gruppen Chitosan, dann TAA und TAA, dann Chitosan zu einer signifikanten Abnahme (-40,8 Prozent bzw. 32,3 Prozent) der Serum(ALAT)-Aktivität im Vergleich zur TAA-Gruppe. In ähnlicher Weise wurde ein signifikanter Anstieg (232,9 Prozent) der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) im Serum in der TAA-vergifteten Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt. Vorteilhafterweise führte die Fütterung von Ratten mit einer Chitosan-Mischkost für 14 Tage vor der Intoxikation mit TAA zu einer signifikanten Abnahme (-54,06 Prozent) der Serum-ALP-Aktivität; auch wurde eine signifikante Verringerung (-50,6 Prozent) der Serum-ALP-Aktivität in der Tiergruppe aufgezeichnet, die nach der TAA-Intoxikation eine Chitosan-Mischkost erhielt, wenn beide Tiergruppen mit der nur mit TAA behandelten Gruppe verglichen wurden.

In Bezug auf die Aktivität der Serum-Gamma-Glutamyltransferase (GGT) erhöhte die TAA-induzierte Lebertoxizität die Aktivität der Serum-GGT signifikant (223,5 Prozent), während die nur mit Chitosan behandelte Tiergruppe ihre Aktivität nicht verschlechterte, wenn beide Gruppen damit verglichen wurden der Kontrollgruppe. Interessanterweise füttern die Tiere vorher eine Chitosan-Mischkost

Die TAA-Intoxikation zeigte eine signifikante Reduktion (-50,28 Prozent) der Serum-GGT-Aktivität; ähnlich wurde eine signifikante Abnahme (-41,0 Prozent o) der GGT-Aktivität in der Gruppe der Tiere festgestellt, die mit TAA vergiftet wurden, bevor sie mit einer Chitosan-Mischdiät gefüttert wurden, wenn beide mit der TAA- betrunkene Gruppe. Der Serumalbuminspiegel war nach der TAA-Injektion (TAA-Gruppe) signifikant verringert (-36,58 Prozent), während die Chitosangruppe eine unbedeutende Veränderung (2,4 Prozent o) des Serumalbuminspiegels zeigte, wenn beide Gruppen mit der Kontrollgruppe verglichen wurden . Jedoch zeigte die Fütterung der Tiere mit Chitosan bei unterschiedlichen Dosierungen, entweder vor oder nach der TAA-Intoxikation, eine signifikante Erhöhung (50 Prozent bzw. 38,4 Prozent) der Serumalbuminspiegel, wenn beide mit der TAA-Gruppe verglichen wurden (Tabelle 2).

Hinsichtlich der Nierenfunktionstestes (Tabelle 2) wurde ein signifikanter Anstieg (82,67 Prozent bzw. 232,77 Prozent) sowohl der Harnstoff- als auch der Kreatinin-Serumspiegel in der TAA-vergifteten Gruppe beobachtet; währenddessen zeigte die nur mit Chitosan behandelte Gruppe eine unbedeutende Veränderung (19,3 Prozent bzw. -15 Prozent), wenn beide Gruppen mit der Kontrollgruppe verglichen wurden. Vielversprechenderweise zeigte die Gruppe der Chitosan- und dann der TAA-Tiere eine signifikante Abnahme (-36,04 Prozent und -45,2 Prozent) der Serumspiegel von Harnstoff bzw. Kreatinin im Vergleich zur TAA-Gruppe . Darüber hinaus zeigte die Fütterung der Ratten mit einer Chitosan-Mischkost für 14 Tage nach der TAA-Intoxikation eine signifikante Abnahme (-30,6 Prozent und -35,10 Prozent) der Serumspiegel von sowohl Harnstoff als auch Kreatinin. jeweils wenn beide Gruppen mit der Gruppe der mit TAA behandelten Tiere verglichen wurden.

Wie in Abbildung (2) dargestellt, wurde eine signifikante Erhöhung (98,26 Prozent) im Tumornekrosefaktor alfa(TNF-)-Spiegel der Gruppe der mit TAA vergifteten Tiere verzeichnet; während die Chitosan-Gruppe eine unbedeutende Änderung (-2,6 Prozent) im Plasma-TNF-Spiegel zeigte, wenn die Gruppen beider Tiere mit der Kontrollgruppe verglichen wurden. Die Fütterung der Tiere mit einer Chitosan-Mischdiät mit unterschiedlichen Schemata, entweder vor oder nach der TAA-Intoxikation, zeigte auf beliebte Weise eine signifikante Abnahme (-36,6 Prozent bzw. -31,57 Prozent). im Plasmaspiegel von TNF-, wenn beide mit der TAA-Gruppe verglichen wurden.

3.1.1. Genexpression.

Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigte die Gruppe der mit TAA vergifteten Tiere eine signifikante Verringerung (-81 Prozent) der Überlebensleber-Genexpression, während die Gruppe mit Chitosan allein unbedeutende Veränderungen der Überlebensleber-Genexpression aufwies, wenn beide Gruppen verglichen wurden mit der Kontrollgruppe. Unglücklicherweise zeigten sowohl die mit Chitosan, dann TAA, als auch die mit TAA, dann Chitosan behandelten Tiergruppen keine merklichen Veränderungen (1,27 Prozent bzw. -3,2 Prozent) in dieser Genexpression im Vergleich zu den TAA-berauschten Gruppe der Tiere.

In Bezug auf die c-myc-Genexpression zeigte die Chitosan-only-Gruppe eine signifikante Erhöhung (400 Prozent). Jedoch beeinflusste die Gruppe der mit TAA vergifteten Tiere nicht (0,0 Prozent o) die Expression dieses Gens, wenn beide Gruppen mit der Kontrollgruppe verglichen wurden. Außerdem zeigten sowohl die Chitosan-, dann TAA- als auch die TAA-dann-Chitosan-Gruppen einen signifikanten Anstieg (300 Prozent bzw. 700 Prozent) der c-myc-Genexpressionsniveaus im Vergleich zur TAA-Gruppe (Fig. 4).

Die Daten zeigten, dass die mit Chitosan behandelte Tiergruppe nur eine deutliche Erhöhung (73,33 Prozent) des hepatischen TNF-Genexpressionsniveaus verzeichnete; außerdem zeigte die Gruppe der TAA-vergifteten Tiere eine signifikante Erhöhung (368,3 Prozent) im Vergleich beider Gruppen mit der Kontrollgruppe. Diese Erhöhung wurde signifikant (-66,5 Prozent bzw. -57,3 Prozent) bei der Behandlung mit Chitosan, entweder vor oder nach der TAA-Intoxikation, verglichen mit der TAA-Tieregruppe verringert (Fig. 5).

3.1.2.Histologischer Befund.

Die normale Kontrollgruppe zeigte eine normale Lebergewebsarchitektur mit normaler Zentralvene, erhaltenem Pfortadertrakt mit minimalentzündlichZellen und meist normale Hepatozyten (Abbildung 6). Unterdessen zeigten die Untersuchungen der TAA-Gruppe hepatische Verschlechterungen, dargestellt durch vakuolisierte Hepatozytenzellen, erweiterte, verstopfte Zentralvenen, erweiterte, verstopfte Pfortader und mäßige verstreute Entzündungszellen (Abbildung 7). Die Chitosan-Medikamentengruppen zeigten eine normale Lebergewebearchitektur mit einem leicht erweiterten, zentralen, normalen Pfortadertrakt mit minimalen Entzündungszellen und normalen Hepatozyten (Abbildung 8). Die Chitosan- und dann die TAA-Gruppe zeigte eine verzerrte erweiterte Zentralvene, verstreute Entzündungszellen und erweiterte verstopfte sinusförmige Räume, eine deutliche Degeneration von Hepatozyten mit fettigen Veränderungen und eine erhöhte Hepatozytendicke (mehr als 2 Zellen dick) (Abbildung 9). Außerdem zeigte die TAA- und dann die Chitosan-Gruppe verstopfte, dilatierte Zentralvenen, verstreute Entzündungszellen, einen deutlich erweiterten, kongestionierten Pfortadertrakt und verstreute degenerierte Hepatozyten (Fig. 10).

3.2.Diskussion.

Die Leber stellt die größte Drüse des Körpers dar und steuert dort viele biologische Prozesse, die Energie benötigen, wie Stoffwechsel, Biosynthese, Ausscheidung, Sekretion und Entgiftung. Dieser große Energiebedarf macht die Leber zu einem stark sauerstoffabhängigen Gewebe. Nach einem massiven Zellverlust hilft die Zellproliferation bei der Leberregeneration. Allerdings kann die Regeneration scheitern, wenn der Verlust bestimmte Grenzen überschreitet, was zu Leberversagen und schließlich zum Tod führen kann 32].

Viele Studien wurden durchgeführt, um die Wirkung von Antioxidantien auf die Linderung von Lebererkrankungen und die Unterstützung einer normalen Leber zu testen. Antioxidantien haben sich als therapeutische Option zur Behandlung und Vorbeugung lebensstilbedingter Krankheiten herauskristallisiert. Es bedarf jedoch weiterer Studien, um seine Wirkungsweise aufzuklären 33,34]. Chitosan (CS) ist ein wertvolles marines Polysaccharid, das aus den Schalen einiger Krebstiere gewonnen wird. Es hat viele bekannte biologische Vorteile wie Immunregulierung, Antitumor, Leberschutz, Antidiabetikum, antibakterielles Mittel, Antioxidans, Antifettleibigkeit, wundheilende Wirkungen und hypolipidämische Wirkung [5].

Die vorliegende Studie untersuchte die schützende und therapeutische Wirksamkeit von Chitosan bei der Verbesserung der Geweberegeneration bei TAA-induzierter Lebertoxizität bei Ratten. TAA wird traditionell verwendet, um Leberschäden in experimentellen Tiermodellen zu induzieren [15,35]. Die toxische Wirkung von TAA beruht auf seinen Metaboliten wie Acetamid, Sulfat und Sulfoxid-abgeleiteten Komponenten. Dieser Metabolit verursacht strukturelle Deformationen der Strukturproteine ​​und Enzyme, was zu deren Inaktivierung führt. Durch seine Rolle verändert der TAA-Metabolit die Zellpermeabilität, erhöht das Kernvolumen, konzentriert intrazelluläres Calcium und hemmt die mitochondriale Aktivität, was folglich zum Zelltod führt. Durch diesen Metaboliten werden die Leukotriene als potente Entzündungsmediatoren, die von den Leberzellen sezerniert werden, beeinträchtigt [36].

In dieser Studie beeinflusste die Behandlung mit Chitosan die Leberenzyme positiv. Im Gegensatz dazu und als erwartete Wirkungen einer TAA-Intoxikation zeigten die Aktivitäten von ASAT, ALAT, ALP und GGT im Serum einen signifikanten Anstieg in der mit TAA behandelten Gruppe im Vergleich zu der normalen Kontrolle. Diese Ergebnisse stimmen mit Baskaran et al. [37], Jain und Singhai [38,39]Osama et al. [40], der die Erhöhung der Aktivitäten der Serumtransaminasen mit dem oxidativen Stress und der Lipidperoxidation in Verbindung brachte, die ein Ergebnis der toxischen Wirkung von TAA ist, wo Lipid, Protein und DNA durch die Wirkung freier Radikale beschädigt werden, was zu einer hepatozellulären Schädigung führt Nekrose. Normalerweise geben nekrotische Zellen ihren Inhalt in den Blutkreislauf ab, was zu einer Erhöhung der Aktivität der Transaminasen führt. Andererseits zeigten mit Chitosan behandelte protektive und heilende Gruppen eine deutliche Herunterregulierung der ALAT-, ASAT-, ALP- und GGT-Aktivitäten, was auf antioxidative, immunmodulierende und/oder Wundheilung und Leberschutz von Chitosan zurückgeführt werden konnte [9]. In ähnlicher Weise war der Serumalbuminspiegel bei TAA-vergifteten Ratten als Ergebnis einer hepatischen Dysfunktion der Proteinsynthese aufgrund des beeinträchtigten endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien von Hepatozyten verringert. Dieses Niveau wurde jedoch durch Chitosan-Behandlung entweder in Schutz- oder Heilgruppen hochreguliert und normalisiert.

Eine TAA-Intoxikation führte zu einer Niereninsuffizienz, da Serumharnstoff- und Kreatininspiegel erhöht waren; diese Verschlechterung wurde von Begum et al. 41], der über eine tubuläre Verletzung bei akuter tubulärer Nekrose berichtete, ist hauptsächlich für die verminderte glomeruläre Filtration verantwortlich. Es wurde auch vermutet, dass es sich bei den beteiligten tubulären Anomalien um eine Blockierung der Tubuli handelt, die einen Rückfluss des glomerulären Filtrats verursacht. Daher könnten Nierenveränderungen bei mit TAA behandelten Ratten auf die schädlichen Wirkungen von ROS zurückzuführen sein. Dieser Anstieg wurde jedoch bei einer Behandlung mit Chitosan entweder als protektive oder heilende Behandlung umgekehrt. Diese Beobachtung stimmt mit der von Mohamed [42] überein, der berichtete, dass die Einnahme von Chitosan die Harnstoff- und Kreatininspiegel bei Patienten mit Niereninsuffizienz signifikant reduzierte, und diese Wirkung einem oder zwei möglichen Mechanismen zuschrieb: Der erste ist die Aktivierung der Nierenfunktion zur Clearance des Stickstoffmetaboliten, was zu einer Reduzierung von Harnstoff und Kreatinin führt, wohingegen die zweite Möglichkeit darin besteht, dass sich Chitosan mit dem Stickstoffmetaboliten im Verdauungstrakt verbindet und dann ausgeschieden wird, was zu einer Reduzierung von Harnstoff und Kreatinin führt.

In der aktuellen Studie reduzierte die akute Toxizität von TAA die Survivin-Genexpression im Lebergewebe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant. Die Fütterung von Tieren mit einer mit Chitosan gemischten Basaldiät als Arzneimittelkontrolle und als Schutzbehandlung vor TAA-Toxizität führte jedoch zu einer nicht signifikanten Erhöhung der Survivin-Genexpressionsspiegel. Survivin hat eine gut etablierte Funktion in der G2/M-Phase des Zellzyklus; während der Zellteilung beeinträchtigt Survivin eine Untereinheit des chromosomalen Passagierkomplexes [43,44]. Survivin wird in normalen proliferierenden und regenerierenden Geweben exprimiert und es wurde berichtet, dass es die Apoptose unterdrückt und beim Fortschreiten des Zellzyklus hilft [45]. Es wurde festgestellt, dass die Survivin-Expression einen positiven Zusammenhang mit der Anzahl von Hepatozyten in der sich regenerierenden Leber aufweist. Dies kann durch den Befund erklärt werden, dass Survivin an der Trennung der Schwesterchromatiden während der Mitose beteiligt ist 46]; diese Tatsachen können die Verringerung der Survivin-Genexpression hier in der Post-TAA-Intoxikation interpretieren. Hagemannet al. [46] berichteten, dass bei reduzierter Survivin-Expression die Lokalisierung von Mitgliedern des chromosomalen Passagierkomplexes unterbrochen wird und daher bei reduzierter Aurur-B-Aktivität die Phosphorylierung von zentromerischen Zielproteinen und Zytokinese-Prozesse beeinträchtigt werden.

In früheren Studien an Nagetieren war die Survivin-Expression nach partieller Hepatektomie und postoperativ signifikant erhöht. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Survivin-Expression im Transplantat bei einer menschlichen Lebertransplantation erhöht ist. Sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen ist die Survivin-Überexpression mit Proliferation und nicht mit Apoptose verbunden; folglich ist Survivin bei der Hepatozytenproliferation und -mitose wichtig, nicht nur bei der Regeneration, sondern auch während der normalen Entwicklung [46].

Die TAA-induzierte akute Toxizität beeinflusste das c-myc-Genexpressionsniveau im Lebergewebe nicht merklich. Tatsächlich regulierte die Behandlung mit Chitosan als Arzneimittelkontrolle, schützende oder heilende Behandlung das c-myc-Genexpressionsniveau signifikant und dramatisch hoch. Es wurde berichtet, dass Entwicklungs- und mitogene Signale in normalen, nicht transformierten Zellen die c-myc-Expression regulieren [47]. Die Hauptaufgaben von c-myc bestehen darin, die Zellproliferation zu verstärken und die Zelldifferenzierung zu verhindern. Es wurde festgestellt, dass die Zellzyklusprogression durch c-myc verstärkt wird, indem es viele Zellzyklus-kontrollierende Proteine ​​wie Cycline (D, E, A und B1) und Cyclin-abhängige Kinasen (CDK1.2.4,6) reguliert E2F-Transkriptionsfaktoren. Auf der anderen Seite wurde festgestellt, dass c-myc die Aktivität von Zellzyklusblockern wie p15, p21 und p27 in vielerlei Hinsicht unterdrückt [48].

Die Abnahme des Gewichts und des proliferierenden Zellkernantigens ist mit der Abnahme der c-myc-Proteinexpression während der Leberregeneration verbunden. Außerdem wurde das Zellzyklus-regulierende Protein p53 und die Zahl der Zellen in der G2-Phase des Zellzyklus stark reduziert. Folglich wird c-myc als starker positiver Regulator der Zellproliferation angesehen. Außerdem wurde festgestellt, dass c-myc-Antisense die Leberregeneration bei Ratten einschränkt [24,26].

In ähnlicher Weise wurde in Nierengewebe festgestellt, dass das c-myc-Gen in Nierentubuluszellen während der Regeneration und nach Folsäure-induzierter Nierenschädigung in vivo aktiviert wird [49]. Es wurde auch festgestellt, dass C-myc die Proteinbiosynthese fördert, wobei die Proteinsynthese in Fibroblasten, die c-myc überexprimieren, dreimal höher war als in ihren nativen Zelllinien. C-myc übt diese Wirkung aus, indem es die Ribosomen-Transkription und -Biogenese reguliert; außerdem arbeitet c-myc in Koordination mit nukleären RNA-Polymerasen (RNA pol I und III), um die Biogenese und Translation der Ribosomen zu regulieren.

Außerdem wurde die Transkription ribosomaler RNA durch c-myc stimuliert, das die Proteinsynthese aktiviert [50].

In den vorliegenden Untersuchungen führte die akute Toxizität von TAA zu einem signifikanten Anstieg der TNF-Genexpressionsspiegel im Lebergewebe sowie zu erhöhten Plasmaspiegeln, während dieser Anstieg bei einer Behandlung mit Chitosan sowohl als protektive als auch als kurative Behandlung im Vergleich zu TAA- signifikant herunterreguliert wurde. betrunkene Gruppe. Dieser Befund steht im Einklang mit der früheren Beobachtung von Park et al. [51], die über eine verbessernde Wirkung von Chitosan auf den TNF-Spiegel berichteten. Zhanget al. [52] berichteten, dass quervernetztes Carboxymethylchitosan die Aktivitäten der Entzündungsfaktorenzyme zu Beginn der Behandlung erhöhte; Danach werden sie jedoch wieder auf ihr normales Niveau zurückgesetzt. Sie schlugen wundheilende Wirkungen von vernetztem Carboxymethylchitosan durch seine herunterregulierenden Wirkungen auf die Leberenzymaktivität von Ratten vor.

TNF- wird von neuronalen Zellen, Fibroblasten, lymphoiden Zellen, Mastzellen, Endothelzellen und Makrophagen produziert. TNF- vermittelt seine entzündungsfördernden und proapoptotischen Wirkungen durch die Wechselwirkung mit ihren Membranrezeptoren (TNF-R1 und TNF-R2). Beide Rezeptoren vermitteln zwei unterschiedliche Signalwege, wobei die Aktivierung des einen von der Inaktivierung des anderen begleitet wird [51].

Unsere Ergebnisse deuten auf eine positive Rolle von Chitosan bei der Geweberegeneration hin, die mit Shilpa et al. übereinstimmt,[53] die herausfanden, dass die Behandlung von teilweise hepatektomierten Ratten mit Chitosan-Nanopartikeln und Gamma-Aminobuttersäure die Aufnahme von tritiiertem Thymidin im Vergleich zu teilweise hepatektomierten Gruppen ohne Nanopartikel erhöhte Behandlung. Das Gesamtergebnis der Behandlung mit Chitosan-Nanopartikeln in Verbindung mit Gamma-Aminobuttersäure ist die Verbesserung der Hepatozytenregeneration und ein verringerter Zelltod im Vergleich zu hepatektomierten Leberratten. Die aktuellen Ergebnisse stimmen auch mit Chen et al. [54], die berichteten, dass Chitosan-Nanopartikel die Leberregeneration bei Ratten mit akutem Leberversagen verbesserten. Die Matrixbindungsfähigkeit von Chitosan ermöglicht das Wachstum und die Aktivierung von Makrophagen, was für die Geweberegeneration notwendig ist. Eine bei einem mit Chitosan behandelten Hundetier durchgeführte Wunde zeigte nach drei Wochen eine vollständige Heilung. Bei der mit Kochsalz behandelten Kontrollgruppe dauert jedoch nur der Aushärtungsprozess vier Wochen. In der mit Chitosan behandelten Gruppe bildete sich eine Keratinschicht als Beweis für die Regeneration des Bindegewebes. Außerdem wurde ein Netzwerk aus Kollagenfasern gebildet, um die Neovaskulatur der Wunde zu schützen [55].

In der aktuellen Studie zeigte der histologische Befund ein verschlechtertes Lebergewebemuster in der TAA-Gruppe; dieses Muster wurde jedoch in der Chitosan-Schutzgruppe und in gewisser Weise in der heilenden Chitosan-Gruppe stark verbessert.

4. Schlussfolgerung

Es wird der Schluss gezogen, dass Chitosan die Leberregeneration bei TAA-induzierter Lebertoxizität entweder als Heilmittel oder als Proliferativ verbessern kann. Darüber hinaus zeigte es eine entzündungshemmende Wirkung, da es den TNF-Spiegel sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene senkte. Im Gegensatz dazu erhöhte Chitosan die Genexpression von Survivin und c-myc, die Verstärker der Zellproliferation sind. Weitere Studien könnten durchgeführt werden, um den genauen Mechanismus aufzuklären, durch den Chitosan die c-myc-, Survivin- und TNFC-Genexpression beeinflusst. Daher wird Chitosan zur Anwendung bei Lebererkrankungen empfohlen, bei denen eine Geweberegeneration erforderlich ist.