Eine Diät mit hohem Phosphorgehalt induziert eine Hochregulierung der Bmp2- und Spp1-mRNA-Expression in der Rattenniere

Um den Mechanismus der Entwicklung zu klärenNephrokalzinoseinduziert durch aDiät mit hohem Phosphorgehalt (P).Wir konzentrierten uns auf knochenbezogene Proteine ​​wie das knochenmorphogenetische Protein 2 und Osteopontin. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen einer Diät mit hohem Phosphorgehalt auf die mRNA-Expression von Bmp2 und Spp1 in der Rattenniere. Wistar-Ratten wurden in zwei Gruppen eingeteilt und mit einer Kontrolldiät (Kontrollgruppe) oder einer Diät mit hohem P-Gehalt (Gruppe mit hohem P-Gehalt) gefüttert.Nierenkalziumund die P-Konzentrationen waren in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die mRNA-Expression von Bmp2 und Spp1 war in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Ernährung mit hohem Phosphorgehalt eine Hochregulierung von Bmp2 und Spp1 induziertmRNA in der Niere.

Schlüsselwörter:phosphorreiche Ernährung, Nephrokalzinose, Bmp2, Spp1,Niere, Ratte

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Einführung

Nephrokalzinoseist durch Ablagerungen von Kalzium (Ca) im Blut gekennzeichnetNierenparenchym. NahrungsphosphorInsbesondere (P) ist ein entscheidender Faktor bei der Entstehung dieser Störung. Es hat sich gezeigt, dass die Verabreichung einer Diät mit hohem Phosphorgehalt zu einer erhöhten Ca-Konzentration im Körper führtNiereund Ca-Ablagerungen im Nierenparenchym1-6). Obwohl die Auswirkung einer Ernährung mit hohem P-Gehalt auf die Entstehung von Nephrokalzinose im Mittelpunkt laufender Studien steht, ist wenig über den Mechanismus bekannt, der für die Entstehung dieser Erkrankung verantwortlich ist. Daher ist eine zeitnahe Lösung dieses Problems erforderlich.

Wir berichteten, dass bei der histologischen Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie hydroxylapatitartige nadelförmige Kristalle in den Nierentubuli von Ratten beobachtet wurden, denen eine Diät mit hohem Phosphorgehalt verabreicht wurde6, 7). Röntgenmikroanalysen zeigten, dass die durch eine Ernährung mit hohem P-Gehalt verursachten Ca-Ablagerungen hauptsächlich aus Ca und P7 bestehen. Diese Ergebnisse zeigten, dass durch eine Ernährung mit hohem Phosphorgehalt induzierte Ca-Ablagerungen eine Form von Hydroxylapatit sind. Basierend auf diesem Befund postulieren wir, dass die Entwicklung einer Nephrokalzinose durch einen Mechanismus gesteuert wird, der dem der Knochenbildung ähnelt. Daher konzentrierte sich die vorliegende Studie auf knochenassoziierte Proteine ​​wie das Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2). BMP2 ist ein osteogener Faktor, der eine osteogenese-induzierende Aktivität aufweist, 9). Bemerkenswert ist, dass BMP2 als Faktor identifiziert wurde, der die ektopische Knochenbildung induziert10, 11). Daher stellten wir die Hypothese auf, dass, wenn BMP2 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Nephrokalzinose spielt, die Expression dieses Proteins in der Niere durch eine Ernährung mit hohem Phosphorgehalt hochreguliert würde. Ziel der vorliegenden Studie war es herauszufinden, ob eine Ernährung mit hohem P-Gehalt die mRNA-Expression beeinflusstBmp2 in der Niere.

Unterdessen berichtete unsere frühere Studie, dass eine Diät mit hohem Phosphorgehalt die Osteopontin (OPN)-Expression in Nierentubuli mithilfe einer immunhistochemischen Analyse erhöht, was darauf hindeutet, dass OPN möglicherweise an der Entwicklung von Ca-Ablagerungen beteiligt sein könnte, die durch eine Diät mit hohem Phosphorgehalt induziert werden12). Daher untersuchten wir auch die Veränderungen der Spp1-mRNA-Expression in der Niere.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie könnten wertvolle Einblicke in den Mechanismus liefern, der für die Entwicklung einer durch eine Ernährung mit hohem Phosphorgehalt induzierten Nephrokalzinose verantwortlich ist.

Materialen und Methoden

Tiere und Ernährung. Die vorliegende Studie wurde vom Animal Use Committee der Tokyo University of Agriculture genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Universität für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Genehmigungsnummer 300049) gehalten.

Es ist wichtig zu beachten, dass weibliche Ratten leichter eine Nephrokalzinose entwickeln als männliche Ratten13, 14). Darüber hinaus berichteten wir, dass eine Diät mit hohem Phosphorgehalt die OPN-Expression in den Nierentubuli weiblicher Ratten erhöht12). In der vorliegenden Studie wurden dann weibliche Ratten als Versuchstiere verwendet. Vier Wochen alte weibliche Wistar-Ratten (Clea Japan, Tokio, Japan) wurden in einzelnen Drahtkäfigen aus rostfreiem Stahl gehalten. Während des Versuchszeitraums befanden sich die Käfige in einem Raum mit kontrollierter Beleuchtung und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12-h (Licht, 0800-2000h), einer Temperatur von 22 ± 1 Grad und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % 65 %.

Die Zusammensetzung der experimentellen Diäten ist in Tabelle 1 dargestellt. Die experimentellen Diäten wurden in Anlehnung an die AIN-93G-Diät15) erstellt. Die experimentellen Diäten enthielten zwei unterschiedliche P-Konzentrationen (Kontrolldiät, 0,3 %; Diät mit hohem P-Gehalt, 1,5 %). Die P-Konzentration in der Diät mit hohem P-Gehalt wurde auf 1,5 % festgelegt, da unsere früheren Studien beobachteten, dass aP-Konzentration in der Nahrungvon 1,5 % führt zu schwerer Nephrokalzinose6, 7, 12, 14) und hoher OPN-Expression12). Alle experimentellen Diäten hatten die gleiche Ca-Konzentration (0,5 %). Die P- und Ca-Konzentrationen, die durch Analyse der experimentellen Diäten bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Vor Beginn der Studie wurden alle Ratten 7 Tage lang akklimatisiert und hatten während dieser Zeit freien Zugang zur Kontrolldiät und entionisiertem Wasser . Nach der Akklimatisierungsphase wurden die Ratten zufällig in zwei Gruppen mit ähnlichen mittleren Körpergewichten eingeteilt und 14 Tage lang entweder mit der Kontrolldiät (Kontrollgruppe) oder der Diät mit hohem P-Gehalt (Gruppe mit hohem P-Gehalt) gefüttert. Während des gesamten Versuchszeitraums hatten die Ratten freien Zugang zu den zugewiesenen Versuchsfuttermitteln und entionisiertem Wasser. Am Ende des Versuchszeitraums wurden die Ratten durch intraperitoneale Injektion der Anästhesiemischung (Medetomidin, Midazolam und Butorphanol) eingeschläfert und Blut- und Nierenproben zur Analyse entnommen. Blutproben wurden zentrifugiert und Überstände als Serumproben verwendet. Die Nieren wurden entfernt und die Nierenkapsel entsorgt. DerSerum- und Nierenprobenwurden bei -80 Grad gelagert, bis sie für die Analyse benötigt wurden. Die rechte Niere wurde zur quantitativen Analyse von Bmp2- und Spp1-mRNA verwendet, und die linke Niere wurde zur Analyse der Ca- und P-Konzentrationen verwendet.

Mineralanalyse.

Proben der experimentellen Diäten und Nieren wurden 48 Stunden lang bei 550 Grad in einem Muffelofen verascht und Mineralien wurden zur Analyse in 1 mol/l HCl extrahiert. Die Ca-Konzentrationen in den experimentellen Diäten und Nieren wurden durch Atomabsorptionsspektrophotometrie bestimmt16). Die P-Konzentrationen in den experimentellen Diäten und Nieren wurden mit der Methode von Gomori17) analysiert.

Quantitative Analyse von Bmp2- und Spp1-mRNA.

Die Gesamt-RNA wurde aus der homogenisierten Niere unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Life Technologies, CA, USA) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Die Menge und Reinheit der RNA wurden mit einem NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) bewertet. cDNA wurde mit dem SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix für qRT-PCR (Life Technologies) synthetisiert und dann einer quantitativen Echtzeit-RT-PCR mit SYBR Select Master Mix (Life Technologies) unterzogen. Spezifische Primer18-20) wurden für die Analyse von Bmp2 (vorwärts, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; rückwärts, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (vorwärts, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3' ; rückwärts, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') und Gapdh (vorwärts, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3' ; rückwärts, 5'-GCAT CACCCCATTTGATGTT-3 '). Die Echtzeit-PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines StepOne-Echtzeit-PCR-Systems (Applied Biosystems, CA, USA) durchgeführt und die mRNA-Expressionsniveaus wurden auf Gapdh-mRNA-Niveaus normalisiert. Der Wert der Kontrollgruppe wurde mit 1,00 angenommen.

Statistische Analyse.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM für jede Gruppe von 6 Ratten dargestellt. Nach der Durchführung eines F-Tests zur Bestimmung der Homogenität der Varianzen wurde ein Student-T-Test verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu ermitteln. Wenn die Homogenität der Varianzen nicht gleich war, wurde der Welch-T-Test anstelle des Student-T-Tests verwendet. Unterschiede wurden bei p ＜ 0.05 als signifikant angesehen

Ergebnisse

Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Serumanalyse.

Das endgültige Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme waren in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert (Tabelle 2).

Nierengewicht und Mineralstoffkonzentrationen.

Das Nass- und Trockengewicht der Nieren war in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht (Tabelle 3). Auch die Ca- und P-Konzentrationen in den Nieren waren in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht.

Renale Bmp2- und Spp1-mRNA-Expression. Die Bmp2-mRNA-Spiegel in der Gruppe mit hohem P-Gehalt waren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht (Abb. 1A). Die mRNA-Expression von Spp1 war in der Gruppe mit hohem P-Gehalt im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls signifikant erhöht (Abb. 1B).

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