HydroZitLa hemmt die Bildung von Calciumoxalatsteinen bei nephrolithischen Ratten und fördert die Langlebigkeit bei Nematoden Caenorhabditis Elegans Teil 2

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch Thymin-Radikalanionen.

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Basierend auf unseren aktuellen Erkenntnissen übte HydroZitLa die antipathogene Funktion über mindestens zwei Wege aus. Erstens reduzierte es die Oxalatausscheidung im Urin, verringerte die CaOx-Kristallisationskapazität im Urin und lieferte Citrat. Zweitens enthielt es pflanzliche Polyphenole, die oxidativen Stress und Entzündungen abschwächen und so die CaOx-Lithogenese hemmen konnten. Grundsätzlich wird Oxalat endogen in der Leber synthetisiert, wobei Glyoxylat als wichtiger Vorläufer dient41. Glyoxylat wird durch das Enzym Glykolatoxidase (GO) aus Glykolat synthetisiert und durch die Laktatdehydrogenase (LDH) weiter in Oxalat umgewandelt. Wir fanden heraus, dass HydroZitLa die Oxalatausscheidung im Urin bei mit EG behandelten Ratten signifikant reduzierte. Wir vermuteten, dass HydroZitLa den Oxalatsyntheseweg in der Leber durch die Herunterregulierung von Leberenzymen, die am Glyoxylatstoffwechsel beteiligt sind, insbesondere LDH und GO, hemmt. Die vorherige Studie von Kailash und Varalakshmi zeigte, dass Bananenstammextrakt die GO- und LDH-Spiegel in der Leber bei Ratten mit Natriumglykolat-induzierter Hyperoxalurämie senkte27. Poonguzhali und Chegu berichteten auch, dass Rohextrakt aus Bananenstielen Oxalat, Glykolsäure und Glyoxylsäure im Urin bei Ratten mit Glykolat-induzierter Hyperoxalursäure reduzierte30. Kürzlich haben Patankar et al. zeigten, dass ihre Kräuterformulierung namens Herbmed Plus (die Bananenstängel enthält) die LDH-Aktivität im Leber- und Nierengewebe reduzierte42. Um unsere Vermutungen zu überprüfen, sollte die Expression von Leber- und Nierenenzymen, die an der Oxalatsynthese bei mit HydroZitLa behandelten EG-Ratten beteiligt sind, weiter untersucht werden.

Mehrere Belege belegen nachdrücklich, dass oxidativer Stress, Entzündungen und Nierentubulusschäden entscheidend an der CaOx-Lithogenese beteiligt sind3,4,15,43–45. Durch Oxalat- und/oder CaOx-Kristalle induzierter oxidativer Stress führt zu einer Schädigung der Nierentubuli, die die Stellen für Kristallkeimbildung, Adhäsion, Retention, Aggregation und schließlich eine Nidusbildung schafft43,46,47. Darüber hinaus aktiviert oxidativer Stress die Entzündungsreaktion, die wiederum den lithogenetischen Prozess beschleunigt4,47,48. Dabei ist Phytomedizin mit antioxidativen und entzündungshemmenden Eigenschaften eine vielversprechende Maßnahme zur Vorbeugung der Nierensteinbildung24. Aggarwal et al. zeigten im EG-induzierten nephrolithischen Rattenmodell, dass Bergenin (aus Bergenia ligulata isolierte bioaktive Phenolverbindung) eine starke antipathogene Wirkung hat, um oxidativen Stress zu mildern, mitochondriale Dysfunktion zu verbessern und tubuläre Verletzungen und Entzündungen zu verringern49. Es wurde gezeigt, dass Rutin und Curcumin (bekannte einheimische Phytochemikalien mit antioxidativen und entzündungshemmenden Eigenschaften) tubulointerstitielle Schäden und Kristallablagerungen bei EG-induzierten nephrolithischen Ratten hemmen50. Es wurde auch gezeigt, dass Polyphenole aus Traubenkernen die intrarenalen CaOx-Kristallablagerungen bei Ratten mit EG-induzierter Lithiasis hemmen, was plausibel auf ihre antioxidative Aktivität zurückzuführen ist51. Es wurde gezeigt, dass eine Ayurveda-Kräuterformulierung Herbmed entzündliche Verletzungen und Kristallablagerungen in den Nieren von EG-induzierten nephrolithischen Ratten reduziert42. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass HydroZitLa intrarenalen oxidativen Stress, Entzündungen und CaOx-Kristallablagerungen verringert, was darauf hindeutet, dass HydroZitLa antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen ausübt, um die Bildung von CaOx-Nierensteinen zu verhindern.

Mehrere pflanzliche Polyphenole haben sich experimentell als vorteilhaft für die Verlängerung der Lebensdauer und die Verzögerung des Alterns erwiesen52. Resveratrol ist die am besten charakterisierte lebensverlängernde Polyphenolverbindung. Es wirkt hauptsächlich durch die Aktivierung von Sirtuin und die Abschwächung von oxidativem Stress53. Der im C. elegans-Modell getestete Langlebigkeitseffekt von Resveratrol variiert zwischen den Studien, wobei die mittlere Lebenserwartung zwischen 10 und 65 Prozent zunimmt 54,55. HydroZitLa verlängerte die Lebensdauer von Wildtyp-C. elegans deutlich um bis zu 34 Prozent ohne Anzeichen von Toxizität, was darauf hindeutet, dass die lebensdauerverlängernde Wirkung von HydroZitLa mit der von Resveratrol vergleichbar war. Ernährungseinschränkungen sind ein bekanntermaßen wichtiger Mechanismus für die Langlebigkeit56. Die pharyngealen Pumpraten im Vergleich zwischen HydroZitLa-Würmern und Kontrollwürmern waren vergleichbar, was darauf hindeutet, dass die Verlängerung der Lebensdauer durch HydroZitLa nicht auf eine Ernährungseinschränkung zurückzuführen war.

HydroZitLa verringerte die Anreicherung des autofluoreszierenden Alterspigments Lipofuscin in C. elegans deutlich, was auf eine Anti-Aging-Wirkung schließen lässt. ROS und oxidativer Stress sind bekannte Auslöser von SIPS, und oxidativer Stress beschleunigt die Verkürzung der Telomere57. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Oxalat, COM und Urin von Patienten mit CaOx-Steinen durch oxidativen Stress vorzeitige Seneszenz, p16-Hochregulierung und Telomerabrieb in Nierentubuluszellen hervorrufen 58. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass HydroZitLa die Telomerabnutzung, die p16-Hochregulierung usw. hemmt vorzeitige Seneszenz in HK-2-Zellen, die H2O2, Oxalat und COM ausgesetzt sind. Obwohl der molekulare Mechanismus für diesen Anti-Aging-Effekt nicht geklärt wurde, wurde vorgeschlagen, dass HydroZitLa eine vorzeitige Seneszenz durch Hemmung der Telomerverkürzung und Herunterregulierung der p16-Expression mechanistisch verhindert.

Obwohl pflanzliche Heilmittel und Phytomedizin immer beliebter werden und weltweit akzeptiert werden, müssen wissenschaftliche Beweise für Wirksamkeit und Sicherheit vorgelegt werden, die nicht gefährdet werden dürfen. Die Wechselwirkung zwischen Kräutern und Arzneimitteln lässt sich kaum vorhersagen, da sie von Person zu Person sehr unterschiedlich ist und von mehreren Faktoren wie Polymorphismen des Cytochrom-P450-Enzyms und Arzneimitteltransportern sowie bestehenden Erkrankungen abhängt59. Unerwünschte Wirkungen der gleichzeitigen Verabreichung von Kräutern und Medikamenten müssen genau überwacht werden, um mögliche Wechselwirkungen zwischen Kräutern und Medikamenten zu erkennen. Zu den bekanntesten Kräutern, die ernsthafte Wechselwirkungen mit Medikamenten hatten, gehören Knoblauch, Baizhi, Danggui, Ginseng, Ginkgo, Lakritze, Johanniskraut, Kava, schwarzer und langer Pfeffer, Danshen, Huangqin und Mariendistel59. Nach unserem Kenntnisstand wurden für den Bananenstiel, die blaue Erbsenblume des Schmetterlings und das Sappanholz keine schwerwiegenden Nebenwirkungen oder Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln gemeldet. In Thailand werden Bananenstängel als Lebensmittelzutat verzehrt. Das Trinken von zu viel (übermäßigem Verzehr) von Bananenstielsaft kann Allergien, Bauchschmerzen und Erbrechen verursachen, daher wird ein mäßiger Verzehr empfohlen. Die blaue Erbsenblüte wird häufig in Lebensmitteln als natürlicher Farbstoff und auch zur Teezubereitung verwendet. Über die Nebenwirkungen eines übermäßigen Konsums von Schmetterlings-Blauerbsenblütentee, beispielsweise Magenbeschwerden, Übelkeit und allergische Reaktionen, wird selten berichtet. Sappanholz wird auch häufig als natürlicher Lebensmittelfarbstoff verwendet und in Gemeinden (einschließlich Gemeinden in Thailand) häufig als gesundes Getränk konsumiert. Die empfängnisverhütende Funktion (Antifruchtbarkeit bei Männern) von Sappanholzextrakt wurde jedoch in einem Rattenmodell nachgewiesen, da es die Spermatogenese stört60. Andererseits wird das Kernholz von Caesalpinia sappan L. zur medizinischen Behandlung gynäkologischer Symptome, einschließlich Oligomenorrhoe und Amenorrhoe, verwendet61. Daher muss die Sicherheit der langfristigen Einnahme von HydroZitLa beim Menschen noch in der klinischen Studie ermittelt werden.

Diese Studie weist einige Einschränkungen auf. Die genauen Wirkstoffe, die für die Hemmfunktion von CaOx-Steinen verantwortlich sind, wurden nicht identifiziert und charakterisiert. Die genauen Mechanismen von HydroZitLa zur Hemmung der CaOx-Steinbildung bei Ratten wurden nicht umfassend untersucht. Die dosisabhängige antipathogene Wirkung von HydroZitLa wurde nicht untersucht. Die Dosis von HydroZitLa, die den Citratspiegel im Urin bei nephrolithischen Ratten signifikant erhöhen könnte, wurde nicht untersucht. Das Phenolprofil von HydroZitLa sollte weiter untersucht werden. Der Mechanismus der Langlebigkeitsförderung durch HydroZitLa in C. elegans wurde nicht intensiv erforscht. Schließlich wurden spezifische Verbindungen in HydroZitLa, die für Langlebigkeit und Anti-Aging verantwortlich sind, nicht identifiziert und charakterisiert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass HydroZitLa entwickelt wurde, um durch die Bereitstellung von Flüssigkeit, Citrat und natürlichen Antioxidantien gleichzeitig die Risikofaktoren für die Bildung von CaOx-Steinen zu normalisieren. Experimentell hemmte HydroZitLa die intrarenale CaOx-Ablagerung bei nephrolithischen Ratten. Die CaOx-Steinhemmwirkung von HydroZitLa entsprach der des derzeit verwendeten Kaliumcitrats (Uralyt-U). HydroZitLa hat oxidativen Stress sowohl in vitro als auch in vivo wirksam abgeschwächt. Bemerkenswerterweise verlängerte HydroZitLa die Lebensdauer und verzögerte den Beginn der Alterung bei C. elegans. Darüber hinaus hemmte HydroZitLa die Telomerverkürzung, die p16-Expression und die vorzeitige Seneszenz in menschlichen Nierenzellen erheblich. Diese präklinischen Ergebnisse legen nahe, dass HydroZitLa eine klinisch vielversprechende Alternative zur CaOx-Nephrolithiasis-Behandlung ist, die mit einer Langlebigkeitsförderung und Anti-Aging-Vorteilen einhergeht. Klinische Studien sind erforderlich, um die therapeutische Wirksamkeit von HydroZitLa beim Menschen zu gewährleisten.

Materialen und Methoden

HydroZitLa-Produktion, Antioxidantiengehalt und Nährwertangaben. HydroZitLa ist ein aus Heilpflanzen gewonnenes Getränkekonzentrat, das vor Ort in Tailand32 erhältlich ist. Das Getränk wird durch Verdünnen von HydroZitLa-Konzentrat (55 ml in einem versiegelten Beutel) mit Trinkwasser (auf das Endvolumen von 500 ml) zubereitet. Es hat eine rosa-violette Farbe und einen köstlichen säuerlich-süßen Geschmack. Die Hauptbestandteile von HydroZitLa waren Wasserextrakt aus Bananenstängeln (Musa sapientum L.) und Zitronensäure (16 mÄq/Beutel). Als natürliche Farbstoffe wurden traditionelle Tai-Heilpflanzen verwendet, darunter Clitoria ternatea L. (Schmetterlings-Blauerbsenblütenpulver) und Caesalpinia sappan L. (Sappanholzpulver). Stevia und Sucralose waren Süßstoffe. Das Produkt wurde am 10. April 2019 von der Tai FDA in der Kategorie Getränke in versiegelten Behältern zugelassen (Lebensmittelserien-Nr. 10–1-02,244–5-0005).

Die gesamte antioxidative Kapazität (TAC) von HydroZitLa betrug 21,87 ± 7,96 mg Vitamin C-äquivalente antioxidative Kapazität pro Beutel (ergänzende Abbildung 8). Der Gesamtphenolgehalt (TPC) betrug 19,99 ±0,83 mg Gallussäureäquivalent/100 g. Der Gesamtfavonoidgehalt (TFC) betrug 4,59 ± 0,31 mg Catechinäquivalent/100 g. Zur Qualitätskontrolle wurden TAC, TPC und TFC als Qualitätskontrollparameter verwendet. Die Konzentrationen von TAC, TPC und TFC in den Extrakten aus Bananenstängeln, Schmetterlingserbsenblüten und Sappanholz unterschieden sich zwischen den Chargen und den Lagerungszeitpunkten nicht wesentlich. Bei der Herstellung von HydroZitLa wurden TAC, TPC, TFC und der Brix-Wert (17 ± 2) als Qualitätskontrollparameter verwendet, um die Konsistenz zwischen den Chargen aufrechtzuerhalten.

Die Gesamtenergie von HydroZitLa pro Beutel (Portion) betrug 25 kcal. Es wurden keine Protein-, Fett- und Cholesteringehalte festgestellt. Die Gesamtkohlenhydratmenge betrug 6 g, Zucker betrug<1 g, and sodium was 10 mg. The potassium content was 240 mg/100 g. Soluble and insoluble dietary fibers were 0.74 and 0.43 g/100 g, respectively. Te pH of  HydroZitLa was 3.4.

Toxizitätsbewertung.Das Vorhandensein von Escherichia coli, Clostridium spp., Salmonella spp. und Staphylococcus aureus in HydroZitLa wurde vom Bureau of Quality and Safety of Food, Ministry of Public Health, Thailand, analysiert. Das Metallprofil von HydroZitLa wurde mittels ICP-OES analysiert.

Die akute In-vivo-Toxizität von HydroZitLa bei Mäusen wurde vom Medicinal Plant Research Institute des thailändischen Ministeriums für öffentliche Gesundheit getestet. HydroZitLa oder Wasser (Kontrolle) wurde Mäusen in einer Dosis von 20 ml/kg (n=10 pro Gruppe) oral verabreicht. Die Mäuse wurden vor der Autopsie 14 Tage lang beobachtet. Grobe Läsionen in viszeralen Organen wurden untersucht und zwischen der HydroZitLa- und der Kontrollgruppe verglichen.

CaOx-Aggregationsassay.Keim-COM-Kristalle wurden hergestellt62 und auf 50 mg/ml in 0.05 M Tris/0.15 NaCl, pH 6,5, verdünnt. HydroZitLa oder BSA oder destilliertes Wasser (Blindwert) (200 µL) wurde zu der frisch zubereiteten COM-Arbeitssuspension (2 ml) gegeben. Nach dem Mischen wurde die Absorption bei 620 nm als Basislinie (AT0) gemessen. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Absorption bei 620 nm erneut gemessen (AT10). Der Aggregationskoeffizient (AC) wurde wie folgt berechnet: AC=((AT0− AT10)/10)×1000. Ein höherer AC-Wert weist auf eine höhere COM-Aggregation hin.

Zelllinie, Zytotoxizität und intrazelluläre ROS-Bestimmung.HK{{0}}-Zellen (ATCC, VA, USA) wurden in DMEM, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum und 1 Prozent Pen-Strep, bei 37 Grad, 5 Prozent CO2 und 95 Prozent Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Zytotoxizität von HydroZitLa in HK-2-Zellen wurde mit dem MTT-Assay63 bewertet. HK-2-Zellen wurden ausgesät (200 Zellen/Well), über Nacht in einer 96-Well-Platte gezüchtet und mit unterschiedlichen Konzentrationen von HydroZitLa behandelt (0 als Kontrolle, 1,25 Prozent, 2,5 Prozent, 5 Prozent, 10). Prozent, 20 Prozent, 40 Prozent, 50 Prozent, 80 Prozent und 100 Prozent v/v) für 24 Stunden. Nach dem Waschen wurde die MTT-Lösung zugegeben, 1 Stunde lang inkubiert und dann verworfen. Dimethylsulfoxid wurde hinzugefügt, um Formazankristalle zu solubilisieren. Die Absorption bei 570 nm wurde gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen (Prozent) wurde unter Verwendung unbehandelter Zellen als Kontrolle (100 Prozent Lebensfähigkeit) berechnet.

Die Hemmung der intrazellulären ROS-Produktion durch HydroZitLa wurde durch einen Dichlor-Dihydro-Fluoresceindiacetat-Assay (DCFH-DA) in einer 96-Well-Platte bestimmt 64,65. HK-2-Zellen wurden mit 0,1 M DCFH-DA-Lösung kombiniert und 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit H2O2 oder COM (mit und ohne 1 0 Prozent v/v HydroZitLa) belastet. Die Fluoreszenzintensität (bei 485 nm angeregt und bei 535 nm emittiert) wurde zu Beginn (T0) und 60 Minuten (T60) gemessen. Die willkürliche Fluoreszenzeinheit (AFU), die den Grad der ROS-Erzeugung angibt, wurde wie folgt berechnet: AFU= T60/T0.

Messung der Proteincarbonylierung.Der Proteincarbonylgehalt als Indikator für die Proteinoxidation wurde gemäß unseren früheren Berichten64–66 gemessen. Die behandelten HK-2-Zellen (in der 100-mm-Schale) wurden durch Radioimmunpräzipitationstestpuffer, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt, lysiert. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mittels Bradford-Assay gemessen. Das Zelllysat wurde mit 10 mM Dinitrophenylhydrazin (DNPH)-Lösung oder 2 N HCl 1 Stunde lang im Dunkeln inkubiert. Kalte 20-prozentige Trichloressigsäure wurde zugegeben und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Pellets wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit Ethylacetat:Ethanol (1:1) gewaschen und mit 6 M Guanidin-HCl erneut aufgelöst. Die Absorption (A) bei 375 nm wurde gemessen. Der durch die Gesamtproteinkonzentration normalisierte Proteincarbonylgehalt wurde wie folgt berechnet: ((ADNPH – AHCl)×45,45)/Proteinkonzentration.

Rattenmodell für CaOx-Nephrolithiasis.EG (1 Prozent v/v), ergänzt mit Trinkwasser (freier Zugang ad libitum, für 35 Tage), wurde zur Induktion von CaOx-Nephrolithiasis bei Ratten verwendet. Männliche Wistar-Ratten (6–8 Wochen alt, 180–300 g) wurden in vier Gruppen eingeteilt, nämlich EG (n=6), EG plus HydroZitLa (n=6), EG plus Uralyt-U (n=6) und normale Kontrollgruppen (n=2). Alle Ratten wurden in Edelstahlkäfigen bei 25 Grad und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden gehalten. Zwei Kontrollratten wurden absichtlich nur für den Vergleich von CaOx-Ablagerungen in Rattennieren und für die Immunhistochemie verwendet, nicht für die Urinchemie. HydroZitLa und Uralyt-U wurden zweimal täglich (morgens und abends) mit einer Gesamtcitratdosis von 2 mEq pro Tag zwangsernährt. Diese verabreichte Citratdosis entsprach 60,8 mEq Citrat beim Menschen, berechnet auf der Grundlage der von Reagan-Shaw et al.67 vorgeschlagenen Dosisumrechnung. Am Ende des Eingriffs (Tag 35) wurden 24-h Urinproben unter Verwendung von Thymol als Konservierungsmittel entnommen. Die Ratten wurden mit Isofluran betäubt und getötet. Beide Nieren wurden entnommen, geschnitten und für histologische Untersuchungen in 10-prozentigem neutralem Formalinpuffer fixiert.

Alle Ratten wurden vom National Laboratory Animal Center, Salaya Campus Mahidol University, Nakhonpathom, Thailand, gekauft. Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für Versuchstiere des National Research Council of Thailand durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee der medizinischen Fakultät der Chulalongkorn-Universität genehmigt (Nr. 022/2560). Unsere Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

CaOx-Ablagerung in Nierenschnitten mittels Polarisationsmikroskopie.Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Rattennierenschnitte wurden mit einem automatischen Gewebeprozessor hergestellt. Die H&E-Färbung wurde gemäß dem Standardverfahren durchgeführt. Doppelbrechende CaOx-Kristallablagerungen in H&E-gefärbten Schnitten wurden unter Verwendung eines Polarisationslichtmikroskops (OLYMPUS BX50, Japan) sichtbar gemacht.

Yasue-Färbung für die CaOx-Histochemie.Nierengewebeschnitte wurden entparaffiniert, rehydriert, 30 Minuten lang in 5-prozentige Essigsäure getaucht, um Calciumphosphat und Calciumcarbonat zu entfernen, und mit destilliertem Wasser gewaschen. 68. Die Schnitte wurden 12 Minuten lang mit 5-prozentigem AgNO3 inkubiert, gewaschen und mit gesättigter Rubansäure inkubiert Säure in 10-prozentigem Ammonium für 1 Minute. Die gefärbten Schnitte wurden mit 50-prozentigem Ethanol gespült, mit destilliertem Wasser gewaschen, dehydriert, geklärt und montiert. Schwarze CaOx-Niederschläge wurden unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht69.

Immunhistochemische Färbung.Nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung erfolgte die Antigengewinnung durch Kochen in Natriumcitratpuffer unter Verwendung einer Mikrowelle. Endogenes H2O2 wurde durch 30-minütige Inkubation mit 0,3 Prozent H2O2 inaktiviert. Die unspezifische Bindung wurde durch 20-minütige Inkubation mit normalem Pferdeserum blockiert. Die Schnitte wurden dann mit 1:1, 000 4-HNE (ab46545, Abcam, Cambridge, UK) oder gespaltenem Caspase-3 (5A1E, Cell Signaling Technology, MA, USA) Primärantikörper bei 4 Grad über Nacht inkubiert. Anschließend erfolgt eine 30-minütige Inkubation mit sekundärem Antikörper bei 37 °C. Nach dem Waschen wurden die Schnitte 30 Minuten lang mit ABC-Reagenz (VECTASTAIN® ABC-Kit) inkubiert, 5 Minuten lang in 1 Prozent Diaminobenzidin-Färbereagenz eingeweicht und 5 Minuten lang mit Hämatoxylin gegengefärbt. Schließlich wurden die Schnitte dehydriert, gereinigt, montiert und unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht.

Messungen von Urincitrat, Oxalat, Harnsäure und iCOCI. Der Citratspiegel im Urin wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (Varian Medical Systems, CA, USA) unter Verwendung einer ROAorganic Acid H plus-Säule (300×7,8 mm) (Phenomenex, CA, USA) bestimmt und eluiert durch 5 mM H2SO4 mit einer Flussrate von 0,5 ml/min. Der Oxalat- und Harnsäurespiegel im Urin wurde durch Kapillarelektrophorese (Beckman Coulter, CA, USA) gemessen, getrennt bei 25 Grad und einer Spannung von –20 kV. Der Urin-iCOCI-Test wurde gemäß unserem vorherigen Bericht 38 durchgeführt.

Stamm und Erhaltung von C. elegans.Der C. elegans-Wildtypstamm Bristol N2 und seine Labornahrungsquelle E. coli OP50 wurden vom Caenorhabditis Genetics Center der University of Minnesota, USA, bezogen. Sie wurden in Nematoden-Wachstumsmedium-Agarplatten mit einem Rasen aus E. coli OP50 bei 20 Grad 70 gezüchtet und gehalten. Alle Experimente wurden an alterssynchronisierten jungen erwachsenen Würmern durchgeführt.

Lebensdauertest.Die Lebensdaueranalyse wurde in flüssigen Medien durchgeführt71. Kurz gesagt, 10 alterssynchronisierte junge erwachsene Nematoden wurden zusammen mit E. coli OP50 und 5-Fuoro-2′-Desoxyuridin in eine 24-Well-Platte mit M9-Puffer überführt, um die Nachkommenproduktion zu verhindern. Verschiedene Konzentrationen von HydroZitLa wurden unter Verwendung von destilliertem Wasser als Vehikelkontrolle zugegeben. Lebende Nematoden wurden alle 24 Stunden gezählt. Nematoden galten als tot, wenn sie nicht auf sanftes Anstoßen mit der Platinschleife reagierten.

Pharyngealer Pumptest.Das pharyngeale Pumpen (ein Indikator für die Nahrungsaufnahmefähigkeit) wurde bei jungen erwachsenen Nematoden (~10) im Vergleich zwischen der Kontrolle und der HydroZitLa-Supplementierung gemessen, indem die pharyngeale Kontraktion alle 24 Stunden 30 Sekunden lang unter dem Stereomikroskop überwacht wurde (SMZ{ {3}}, Motic, China) an den Tagen 0 (vor der Ergänzung), 5, 10 und 1572.

Lipofuscin-Assay.Die Akkumulation von Lipofuscin in den Wildtyp-Nematoden nach 5-tägiger Ergänzung mit verschiedenen Konzentrationen von HydroZitLa (20 Prozent, 30 Prozent, 40 Prozent v/v) wurde überwacht. Als Kontrolle dienten mit E. coli OP50- gefütterte Würmer. Nach dem Eingriff wurden die Würmer mehrmals mit M9-Puffer gewaschen und auf einen Objektträger in einen Tropfen Natriumazid gelegt. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit dem konfokalen Mikroskop ZEISS LSM 700 durchgeführt. Die Bilder wurden mit der Image J-Software weiter analysiert und die Fluoreszenzintensität wurde in willkürlichen Einheiten (AU)72 dargestellt.

Messung der relativen Telomerlänge. Die relative Telomerlänge (RTL) wurde in HK-2-Zellen gemessen, die mit H2O2 (25 µM), Natriumoxalat (NaOx, 900 µM) und COM (25 µg/cm2) mit oder ohne HydroZitLa (10 Prozent v /v). Der RTL wurde durch quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR)73 bestimmt. Sie wird auf der Grundlage des Verhältnisses der Kopienzahl der Telomerwiederholungen zur Kopienzahl eines Einzelkopie-Gens (36B4-Gen) berechnet, das proportional zur durchschnittlichen Telomerlänge ist. Die verwendeten Primer waren wie folgt: Telomer (vorwärts) 5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′, Telomer (rückwärts) 5′-GGC TTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′, 34B4 (vorwärts) 5′-CAGCAAGTGGGAAGGTGT AATCC{{23 }}′ und 36B4 (umgekehrt) 5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′. Die PCR wurde 10 Minuten lang bei 95 Grad amplifiziert, gefolgt von 40 Zyklen bei 15 Sekunden lang bei 95 Grad und 1 Minute lang bei 54 Grad.

Doppelfärbung von SA‑‑gal und p16.Auf Deckgläsern gezüchtete HK{{0}}-Zellen wurden zur Induktion von SIPS 72 Stunden lang mit H2O2, NaOx und COM mit und ohne 10 Vol.-% HydroZitLa behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen fixiert und 12–16 Stunden lang mit der frisch zubereiteten X-Gal-Lösung (Vivantis, Malaysia) gefärbt, gewaschen und 3 Minuten lang mit 0,1 Prozent Triton X-100 (Amresco, TX, USA) permeabilisiert und für unspezifische Bindung mit 1 Prozent normalem Pferdeserum (Gibco, MA, USA) bei 37 Grad für 1 Stunde blockiert. Die Zellen wurden dann mit 1:10 000 p16-Primärantikörper (ab108349, Abcam) bei 4 Grad über Nacht inkubiert, gefolgt von 1:10 000 konjugiertem Sekundärantikörper ( Cell Signaling Technology) bei 37 Grad für 30 Minuten. Das gefärbte Deckglas wurde mit Fluoroshield-Eindeckmedium mit 4′-6-Diamidino-2-phenylindol (Abcam) montiert. SA- -gal-positive seneszierende Zellen (blau) und p16-exprimierende Zellen (grün) wurden mit dem Bildgebungssystem EVOS FL Auto 2 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) sichtbar gemacht und abgebildet.

Statistische Analyse.Alle Daten wurden je nach Bedarf als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilbereich) dargestellt. Um den Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu testen, wurde ein Zweistichproben-T-Test oder Mann-Whitney-Test durchgeführt. Um den Unterschied zwischen drei oder mehr Gruppen zu testen, wurde eine Einweg-Varianzanalyse oder ein Kruskal-Wallis-Test verwendet, gefolgt von einem Mehrfachvergleichstest. Für Berechnungen und Grafiken wurde GraphPad Prism Software Version 9 (GraphPad Sofware Inc., CA, USA) verwendet. P<0.05 was considered significant.

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Danksagungen

Die Studie wurde finanziell vom Research Gap Fund des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, der National Science and Technology Development Agency (NSTDA) und der Chulalongkorn-Universität (GB-rgf_60_2905_0003 bis CB) sowie von Thailand Science Research und unterstützt Innovation, Industrieabteilung (RDG6150088 an CB) und die medizinische Fakultät der Chulalongkorn-Universität (Matching Fund). NL erhielt den 90. Jahrestag des Chulalongkorn University Fund (Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund). Die Autoren bedanken sich für die Forschungs- und Innovationsunterstützung durch das Chulalongkorn University Technology Center und den Thailand Science Research and Innovation Fund (TSRI) (CU_FRB640001_01_2). Vielen Dank an Frau Natcha Madared für ihre hervorragende Unterstützung. Seien Sie den Mitarbeitern der Tierstation der medizinischen Fakultät der Chulalongkorn-Universität dankbar. Wir danken den Assistenzprofessoren Dr. Sitthichai Ukritchon und Prof. Dr. Manathip Osiri für ihre Unterstützung beim Einsatz der Polarisationsmikroskopie.

Autorenbeiträge

NL: Führte Zell- und Rattenexperimente durch und sammelte Daten. NC: Sammelte Daten und half bei der Konzeption der Forschungsidee und Datenanalyse. MP: Konzipierte und führte das C. elegans-Experiment durch und führte eine C. elegans-Datenanalyse durch. DJ: Hat bei immunhistochemischen Experimenten und Bildgebung geholfen. CM: Hat beim Gewebeschneiden geholfen. KC: Durchführung von Experimenten zur Telomerverkürzung und Seneszenz. AL: Hat es geschafft, Zugang zu einer Tierhaltungseinrichtung für Rattenexperimente zu erhalten. TT: Hat bei der Konzeption und Gestaltung des Experiments mit C. elegans geholfen. CB: Konzipierte und gestaltete die Studie, führte statistische Analysen durch und schrieb das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Konkurrierende Interessen

CB, NC und NL sind Erfinder von HydroZitLa. Die Chulalongkorn-Universität und die Erfinder besitzen das geistige Eigentum für HydroZitLa. Keiner der anderen Autoren hat einen Interessenkonflikt in Bezug auf das vorliegende Werk zu erklären.

Weitere Informationen

Ergänzende AngabenDie Online-Version enthält ergänzendes Material, das auf der Website verfügbar ist.

Korrespondenzund Materialanfragen sind an CB zu richten

Informationen zu Nachdrucken und Berechtigungenist auf der Website verfügbar.

Anmerkung des HerausgebersSpringer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

【Für weitere Informationen:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】