Hyperosid mildert Entzündungen in HT22-Zellen durch Upregulation von SIRT1 zu Aktivitäten Wnt / β-Catenin- und Sonic Hedgehog-Signalwege Teil 1

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Neuroinflammation spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und dem Fortschreiten der veränderten Neuroentwicklung, des sensorineuralen Hörverlusts und bestimmter neurodegenerativer Erkrankungen. Hyperosid (Quercetin-3-O-β-D-Galactosid) ist ein Wirkstoff, der aus Hypericum-Pflanzen isoliert wird. In dieser Studie untersuchen wir die schützende Wirkung von Peroxid auf Neuroinflammation und seinen möglichen molekularen Mechanismus. Lipopolysaccharid (LPS) und Hyperosid wurden zur Behandlung von HT22-Zellen eingesetzt. Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels MTT-Assay gemessen. Die Zellapoptoserate wurde mittels Durchflusszytometrie-Assay gemessen. Die mRNA-Expressionsniveaus von Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin-6(IL-6), Interleukin-8(IL-8) und Tumornekrosefaktor-α(TNF-a) wurden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion bestimmt. Die Konzentrationen der oxidativen Stressindizes Superoxiddismutase (SOD), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Katalase (CAT), Glutathion (GSH) und Malondialdehyd (MDA) wurden von den Kits gemessen. Die Expression des neurotrophen Faktors und die Beziehung zwischen Hyperosid, stiller Paarungstyp-Informationsregulation 2 Homolog-1 (SIRT1) und Wnt/β-Catenin und dem Schalligel wurde durch Western Blotting untersucht. In den LPS-induzierten HT22-Zellen fördert Hyperosid das Überleben der Zellen; verringert den Gehalt an IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, ROS, MDA, Bax und Caspase-3; und erhöht die Expression von CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB und NGF. Darüber hinaus regulierte hvperosid die Ausprägung von SIRT1 nach oben. Weitere mechanistische Untersuchungen zeigten, dass Hyperosid LPS-induzierte Entzündungen, oxidativen Stress und Apoptose linderte, indem es SIRTl hochregulierte, um Wnt/β-Catenin- und Schalligelbahnen zu aktivieren. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass Hyperosid als Beschützer bei Neuroinflammation wirkt.

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1. Einleitung

Neuroinflammation ist eine chronische Entzündung des Hirngewebes, die eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und dem Fortschreiten der veränderten Neuroentwicklung, des sensorineuralen Hörverlusts und bestimmter neurodegenerativer Erkrankungen spielt[1-5]. In den frühen Stadien des zentralen Hörweges sind lärmbedingter Hörverlust und Schallleitungsschwerhörigkeit mit Neuroinflammation verbunden [6]. Darüber hinaus trägt die Neuroinflammation zum neuronalen Tod und zur neurologischen Verschlechterung bei, indem sie die Produktion von proinflammatorischen Faktoren und oxidativem Stress erhöht[7]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Hippocampus-Neuronen anfällig für Neuroinflammation sind und neurologische Komplikationen verursachen [8]. Es gibt jedoch noch keine wirksamen Mittel oder Methoden, um neuronale Schäden, die durch Neuroinflammation verursacht werden, wiederherzustellen und zu verhindern. Daher ist die Identifizierung wirksamer entzündungshemmender Schutzkandidaten von entscheidender Bedeutung.

Hyperosid (Quercetin3-O-β-D-Galactosid) ist ein Wirkstoff, der aus Hypericum-Pflanzen isoliert wird. Es hat antioxidative und entzündungshemmende Aktivitäten, verringert die Kalziumüberladung und hemmt die Apoptose [9, 10]. Frühere Studien haben bestätigt, dass Hyperosid neurologische Komplikationen, die durch Neuroinflammation verursacht werden, wirksam verhindert. Im Hyperglykämie-induzierten Modell für oxidativen Stress und Entzündung bei akutem Diabetes verhinderte die Verabreichung von Hyperosid kognitive Dysfunktion, Neuroinflammation und oxidativen Stress, der durch DM verursacht wurde, über den TNF-α/NF-Bx/Caspase-3-Signalweg [11]. Bei Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit wirkt Hyperosid als Schutzmittel, indem es die LPS-induzierte Aktivierung von Mikroglia abschwächt [12]. Bisher gibt es nur wenige Studien über die schützende Wirkung von Hyperosid auf Neuroinflammation, und der Mechanismus wurde nicht vollständig aufgeklärt.

Lipopolysaccharid (LPS) wird häufig verwendet, um das angeborene Immunsystem zu aktivieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass LPS normalerweise verwendet wird, um Neuroinflammationsmodelle vorzubereiten, die durch Entzündungsreaktionen induziert werden [13,14]. In dieser Studie haben wir HT22-Zellen LPS ausgesetzt, um ein zelluläres Modell der Neuroinflammation nachzuahmen. Gleichzeitig wurde die schützende Wirkung von Hyperosid auf die Neuroinflammation und ihr möglicher molekularer Mechanismus durch dieses Modell untersucht. Wir fanden heraus, dass Hyperosid HT22-Zellen vor LPS-induzierten Entzündungen schützt; Oxidativer Stress und Apoptose stehen in engem Zusammenhang mit dem SIRT1-Spiegel. Weitere Analysen zeigten, dass Hyperosid LPS-induzierte Entzündungen, oxidativen Stress und Apoptose linderte, indem SIRT1 hochreguliert wurde, um Wnt/β-Catenin- und Schalligelbahnen zu aktivieren.

2. Materialien und Methoden

2.1.Reagenzien und Arzneimittel. LPS, Hyperosid und 3-(4,5-bromiddimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium

(MTT) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält, wurde von Gibco (Carls-bad, USA) gekauft.100U/ml Penicillin und 100mg/ml Streptomycin wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft. LiCl und sonic hedgehog agonist SAg wurden von Merck (San Diego, CA, USA) gekauft. Primäre Antikörper gegen Bcl-2, Bax, Caspase-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wnt1, β-Catenin, Shh, Patch und GAPDH sowie sekundäre Antikörper wurden alle von Cell Signaling (Boston, MA, USA) gekauft. 2.2. Zellkultur und Behandlungen. Die MT22 murine neuronale Zelllinie wurde von der Kunming Cell Bank der Chi-nese Academy of Sciences (Kunming, China) gekauft. HT22-Zellen wurden bei 2×104 Zellen / Well in einer 6-Well-Platte ausgesät und im DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, 100U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin bei 37 ° C in einem 5% CO, befeuchteten Inkubator kultiviert. Als HT22 nach 24 Stunden eine Konfluenz von 70% erreichte, wurde eine Zelltransfektion durchgeführt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Hyperosid und LPS (1 μg / ml) vorbehandelt wurde.

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2.3.Zelllebensfähigkeit. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch MTT-Assay bestimmt.

Kurz gesagt, die HT22-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2×104 Zellen / ml für 24h gesät. Die Zellen wurden über Nacht verhungert und dann 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von Hyperosid vorbehandelt, gefolgt von einer Inkubation mit LPS (1 μg / ml) für weitere 24 Stunden. Das Medium wurde erfrischt und mit 50 μl MTT (5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt) für 4 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Als nächstes wurde die Lösung entfernt und DMSO zu den Platten hinzugefügt. Die Absorption bei 570nm wurde mit einem Plattenleser gemessen.

2.4.Western Blotting.

RIPA-Puffer wurde zu HT22-Zellen hinzugefügt (Invitrogen; USA) das Gesamtprotein zu sammeln; dann wurden die Proteinkonzentrationen mit der BCA-Methode (Invitrogen, USA) bestimmt.

Die Proteinproben wurden mit einem 5-fachen Beladungspuffer vermischt und beim Kochen denaturiert. Die Proteine wurden durch 15% SDS-PAGE getrennt und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Als nächstes wurden die Membranen mit primären Antikörpern (Bcl-2, Bax, Caspase-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, β-Catenin, Shh, Patch und GAPDH) bei 4Covernight inkubiert. Dann, am nächsten Tag, wurden die Membranen mit PBS gewaschen und mit sekundären Antikörpern für 1 h inkubiert. Schließlich wurden die Proteinbanden mit der ImageJ-Software gemessen. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gesammelt.

2.5.qRT-PCR Die Gesamt-RNA der HT22-Zellen wurde mit dem TRIzol RNA Extraction Kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) isoliert, und die isolierte Gesamt-RNA wurde mit einem Reverse-Transkriptionskit in cDNA umschrieben (Takara, Kyoto, Japan). Als nächstes wurde SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kyoto, Japan) verwendet, um eine qRT-PCR-Verstärkung durchzuführen. Die IL-1β-, I-6- und TNF-α-Verstärkungsprimer waren wie folgt:IL-1β,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3'und 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC-3';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGGTAG-3'und 5'-GTCTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T-3'und 5'-CGCGATGCGTGCAGC-3'; und TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'und5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. Die relative Expression von mRNA wurde mit der 2-Act-Methode analysiert.

2.6.SOD-, GSH- und MDA-Assay. Wir haben die Aktivität der Sauerstoffspezies (ROS), Katalase (CAT), Superoxiddismutase (SOD), Glutathion (GSH) und Malondialdehyd (MDA) mit den entsprechenden Assay-Kits (Nanjing Jian-cheng Bio Company, China) gemessen.

2.7.Durchflusszytometrie.

Der Durchflusszytometrie-Assay wurde verwendet, um die Zellapoptoserate gemäß einem früheren Bericht zu messen [15]. HT22-Zellen in jeder Gruppe wurden geerntet und resuspendiert. Die apoptotischen Zellen wurden mit Annexin V-FITC und PI unter Verwendung eines Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskits (Beyotime Biotechnology, China) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln doppelt markiert. Dann wurde die Fluoreszenzintensität der Zellen durch Durchflusszytometrie quantifiziert.

2.8. Statistische Analyse.

In dieser Studie wurde der Unterschied zwischen zwei Gruppen unter Verwendung eines t-Tests verglichen, und der zwischen den Gruppen wurde durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Alle Daten wurden als Mittelwerte dargestellt±

Abbildung 1:Hyperosid linderte Apoptose und Entzündung in den LPS-induzierten HT22-Zellen. Die HT22-Zelllebensfähigkeit wurde mit dem MTT-Assay gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem Mikroskop (100x)(a, b) beobachtet. Die Expression von Bcl-2, Bax und Caspase-3 in HT22-Zellen wurde durch Western Blotting(c) gemessen. Die HT22-Zellapoptoserate wurde mittels Durchflusszytometrie-Assay(d) gemessen. Die Niveaus von IL-1β,IL-6. IL-8 und TNF-αmRNA in HT22-Zellen wurden mittels art-PCR(e);* wurde als signifikant im Vergleich zur Kontrolle angesehen (*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>

Dieser Artikel wurde extrahiert aus Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, Artikel-ID 8706400, 10 Seiten https://doi.org/10.1155/2021/8706400