Gossypitrin, ein natürlich vorkommendes Flavonoid, dämpft eiseninduzierte neuronale und mitochondriale Schäden: Teil 2

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2.5. Nachweis von Gos-Fe(I)-Komplexen

Eine plausible Hypothese zur Erklärung der obigen Ergebnisse ist, dass Gos einen transienten Komplex mit Fe(ll) bildet, der seine Oxidation durch Sauerstoff erleichtert. Dieser Übergangskomplex könnte seine Elektronen leichter abgeben als Fe()-Citrat und einen stabileren Komplex mit Fe(III) erzeugen. Abbildung 6A zeigt ein typisches Spektrum von Gos mit maximaler Absorption bei 276, 332 und 38 0 nm (schwarze Linie). Die Zugabe von Fe() induzierte eine konzentrationsabhängige Abnahme der maximalen Absorptionsspitzen und das Erscheinen einer neuen nahe 500 nm (Abbildung 6A). Das Auftreten einer Reihe von Spektren, die aus dem Gos-Spektrum stammen, wurde durch das Vorhandensein eines isosbestischen Punkts bei λiso=405 nm bestätigt (siehe schwarze Punkte), was auf ein chemisches Gleichgewicht (Komplexierung) zwischen freiem und komplexiertem Gos hinweist. Der Einschub (Abbildung 6A) zeigt die Bildung eines Komplexes mit einer Stöchiometrie von 2:1 (Gos-Eisen). Die Stöchiometrie solcher Gos-Eisen-Komplexe wurde durch das Job-Verfahren bestimmt, das einen Bruchpunkt bei einem Molverhältnis von 0,5 zeigt.

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Weitere Beweise für die Korrelation zwischen Eisen und Gos wurden durch IR-Spektroskopie erhalten (Abbildung 6B). Für das freie Gos und seinen Eisenkomplex wurde die im Bereich von 3000-4000 cm-liegende Breitbandbreite als Streckung von Wasserstoff- gebundene Hydroxylgruppen aufgrund der Anwesenheit von Wassermolekülen. Die v(C=O)-Streckschwingung des freien Gos tritt bei 1654 cm-I auf, die bei der Komplexbildung in Richtung 1636 cm-I verschoben wurde. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Fe(Ⅱ) mit Carbonylsauerstoff korreliert [31]. Darüber hinaus bestätigt das Vorhandensein der v(Fe-O)-Streckschwingung bei 630 cm-I die Bildung des Eisen-Gos-Komplexes, da freies Gos keine solche Bande aufweist.

Abbildung 6.(A)Effekte von Fe(II) auf das UV-VIS-Spektrum von Gos (200-600 nm). Inkubationsmischung mit 125 mM Saccharose, 65 mM KCl, 1 0 mM HEPES-Puffer (pH 7,2), 2 mM Citrat und Gos 1,6 μM. Die Konzentrationen von Fe（I） von den oberen bis unteren Spuren waren {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64, 0,8, 0,96 und 1,12 μM.Einschub∶ Job-Plot für den Gos-Fe（II）-Komplex bei konstanter Gesamtkonzentration 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1,6 μM. Der schwarze Punkt zeigt den isosbestischen Punkt an. Die Abwärts- und Aufwärtspfeile zeigen eine Abnahme bzw. Zunahme der Extinktionswerte bei 380 bzw. 500 nm an. Experimente wurden bei 28 Grad durchgeführt. Die Scangeschwindigkeit betrug 2 nm/s. Eine Basislinie wurde mit der Inkubationsmischung plus 1,6 μM Fe (I) erstellt. (B) Infrarotspektren von Gos und Gos-Fe (I). Typische Beispiele werden gezeigt.

2.6. Gos verhinderte die Fe(III)-Reduktion durch Ascorbat

Der durch Gos geförderte Eisen(III)-Zustand von Eisen stellt einen plausiblen antioxidativen Mechanismus dar, da er die katalytische Aktivität von Fe(II) behindert. Dennoch konnte Fe(III) durch natürliche Reduktionsmittel wie Ascorbat wieder in seine Eisenform reduziert werden. Letzteres könnte biologische Systeme wieder mit Fe(II) beladen, das an Fenton-Haber-Weiss-Reaktionen teilnimmt und das äußerst reaktive OH-Radikal erzeugt. Um diese Möglichkeiten zu untersuchen, haben wir 1,10-Phenanthrolin verwendet, um die Niveaus der Fe(II)-Bildung aus einer Gos-Lösung (100 μM) zu messen, die mit 2 mM Ascorbat und verschiedenen Fe(II)-Konzentrationen behandelt wurde ({{6}). } μM）. Abbildung 7 zeigt, dass die Abwesenheit von Gos eine maximale Reduktionsrate von Fe(II) zu Fe(II) ermöglichte (schwarze Linie mit einer Steigung von 5,85 × 10-3); dieser Prozess wurde jedoch durch das Vorhandensein von Gos verlangsamt (1- min Inkubation, grüne Linie), und nach 5 min Inkubation mit Gos nahm die Reduktionsrate von Fe(I) durch Ascorbat fast um das Dreifache ab (rote Linie mit einer Steigung von 2,04× 10-3). Dieses Ergebnis zeigt die Fähigkeit von Gos, die Ascorbat-vermittelte Fe()-Reduktion zu Fe(I) zu hemmen.

Fig. 7. Gos hemmt die Fe(ⅢI)-Reduktion durch Ascorbat in Abwesenheit von Rattenleber-Mitochondrien. Versuchsbedingungen: 125 mM Saccharose, 65 mM KCl, 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,2), 1 mM Citrat, Gos 100 μM. Experimente wurden bei 28 Grad durchgeführt. Ascorbat (4 mM) und 5 mM 1,10-Phenanthrolin wurden nach 1 min oder 5 min Gos-Fe(I)-Inkubation zugegeben. Die Linien sind repräsentativ für drei Assays.

2.7. Gos schützt vor oxidativem Abbau von 2-Desoxyribose

Um die Fähigkeit von Gos zu dokumentieren, bevorzugt auf Eisen statt auf freie Radikale zu wirken, wurden Konkurrenzstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit von Gos und Zwei-OH-Scavengern (DMSO und Salicylat) beim Schutz von 2,8 oder 28 mM 2--Desoxyribose vor Eisen zu bewerten -vermittelte oxidative Schädigung (Abbildung 8). Die OH-Fänger bei 20 mM schützten 28 mM 2--Desoxyribose deutlich weniger als 2,8 mM 2--Desoxyribose (S<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Abbildung 8. Wirkung der Gos- und OH-Fänger Dimethylsulfoxid (DMSO) und Salicylat auf die oxidative Schädigung von 2,8 oder 28 mM 2--Desoxyribose, induziert durch Fe(II)-EDTA plus Ascorbat. Lösungen wurden für 3 0 min bei 37 Grad inkubiert und enthielten 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 2- Desoxyribose (2,8 oder 28 mM）, 150 μM EDTA und 50 μM Fe（ⅢI） Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von Ascorbat bis zu einer Endkonzentration von 2 mM gestartet.Die Balken zeigen Mittelwerte ±SD (n=3) Kontrollen enthalten nur DMSO (0,001 Prozent), was die Lösungsmittelkonzentration in Gos-Proben ist. Der einseitige t-Test wurde für*p verwendet<0.05, n.s.,="">

3. Diskussion

Das unter mehreren neurodegenerativen Bedingungen freigesetzte Eisen, einschließlich ischämischem und hämorrhagischem Schlaganfall, provoziert die Deregulierung der Eisenhomöostase im Gehirn, was zur Pathophysiologie neurologischer Verletzungen führt [4, 32-34]. Auf subzellulärer Ebene scheint eine mitochondriale Beeinträchtigung am eisenvermittelten neuronalen Tod beteiligt zu sein [10,15,35-38]. Präklinische Beweise unterstützen den Vorteil der Verwendung von Eisenchelatoren, hauptsächlich Deferoxaminmesylat, gegen Neurodegeneration, einschließlich aller Arten von Schlaganfällen [7,16]. Ihre hohen Kosten und Nichtverfügbarkeit sowie das breite Spektrum an nachteiligen Wirkungen klassischer Eisenchelatoren haben jedoch zur Verwendung natürlicher Chelatoren für das Eisenmanagement bei Dyshomöostase geführt [39,40].

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Die Schutzwirkung von Gos zeigt sich an HT-22-Zellen und Rattengehirn-Mitochondrien, die mit einer Eisen/Citrat-Mischung inkubiert wurden, wo wir einen starken Schutz gegen eiseninduzierte oxidative Schäden fanden. Maus-Hippocampus-HT-22-Zellen, die einer Eisenüberladung (24 h) ausgesetzt waren, zeigten eine verringerte Lebensfähigkeit, die eng mit der frühen Auflösung des mitochondrialen Membranpotentials und der ATP-Reduktion verbunden war (Abbildung 2A-C). Dies legt nahe, dass eine mitochondriale Beeinträchtigung zur neuronalen Letalität beiträgt. Tatsächlich wird unter unseren Bedingungen erwartet, dass zumindest ein Teil des in Neuronen hochgeladenen Fe(II) die Organellen erreicht, da dem eiseninduzierten neuronalen Tod der Verlust der mitochondrialen Funktion vorausging. Daher wurde gezeigt, dass eine Eisenüberladung den Hippocampus-HT-22-Zelltod der Maus und die Fragmentierung der Mitochondrien induziert [41,42]. Ebenso erhöht eine anhaltende Eisenexposition die mitochondrialen ROS-Spiegel in dopaminergen Neuroblastom-SHSY5Y-Zellen [43]. Weiterhin wurde nach Exposition gegenüber 100 μM Eisen(II) ein umfangreicher Eiseneinstrom in die Neuronen des Hippocampus sowie mitochondriale Schädigung nachgewiesen [36]. Hier beobachteten wir, dass die Gos-induzierte Erhaltung der Lebensfähigkeit der von Eisen betroffenen Hippocampus-Neuronen eng mit der Erhaltung ihres mitochondrialen Membranpotentials und ATP-Spiegels zusammenhängt.

Wie bei intakten Zellen provozierte die direkte mitochondriale Exposition gegenüber Eisen(II) das starke Anschwellen der Organelle, die Dissipation des Membranpotentials und den Verlust von ATP (jeweils Abbildung 3A-C). In diesem Versuchsaufbau konnte Gos die schützen eisenüberladenen Mitochondrien, was sich in der Erhaltung der oben genannten Parameter äußerte. In diesem Sinne wurde beobachtet, dass Mitochondrien, die mit einer mikromolaren Eisenkonzentration beladen waren, eine mitochondriale Permeabilitätsübergangsporenöffnung und eine ΔY-Dissipation auf eine Weise durchmachten, die für Eisenchelat empfindlich ist, aber nicht von der antioxidativen Wirkung der Katalase abhängt |44]. Interessanterweise wurde berichtet, dass das Mito-Tempo-Antioxidans in Hippocampus-Neuronen vor Schäden durch Eisenüberladung schützt, indem es das mitochondriale Superoxid-Anion-Radikal abfängt und die morphologische Integrität und das Membranpotential der Mitochondrien bewahrt [36]. Wir haben kürzlich die antioxidativen Wirkungen dieses Flavonoids und seine Fähigkeit beschrieben, PC12-Zellen vor dem durch chemische Hypoxie induzierten Tod zu schützen [29], woraus der Schluss gezogen wurde, dass die Radikalfänger- und antioxidative Fähigkeit von Gos teilweise am Schutz vor Eisen-vermittelten beteiligt ist HT-22 und mitochondriale Schäden. Die verbesserte Wirksamkeit von Gos gegen eisenvermittelte Lipoperoxidation im Vergleich zu tert-Butylhydroperoxid-vermittelter Lipoperoxidation (Abbildung 4A bzw. B) deutet jedoch stark darauf hin, dass seine Fähigkeit zur Wechselwirkung mit Eisen der Hauptmechanismus gegen eiseninduzierte Schäden ist.

Um die Gos-Fe-Wechselwirkung weiter zu charakterisieren, wurden mehrere zellfreie und mitochondrienfreie Experimente durchgeführt. Wir beobachteten, dass bei gleichzeitiger Inkubation von Polyphenol mit Fe (II) die Konzentration der Metallionen abnimmt, während die Sauerstoffverbrauchsrate entsprechend ansteigt (Abbildung 5A-C). Diese Effekte deuten darauf hin, dass Gos Fe(II) aus dem Citratkomplex entfernt und es in einem Prozess, der O2 als Elektronenakzeptor erfordert, zu einer Eisen(III)-Form oxidiert. Folglich fördert Gos die Abnahme der Fe(II)-Konzentration, die die Hydroxylradikale durch Fenton-Reaktionen behindern kann. Da der Gos-Fe(II)-Komplex die Oxidation relevanter Reduktionsmittel wie Ascorbat ermöglicht, was zur Bildung/Regeneration von Fe(II) führt, konnten wir zeigen, dass Gos die Ascorbat-vermittelte Reduktion von Fe(II) hemmt. zu Fe(II).

Die Hypothese, dass Gos stark mit Eisen interagiert, wurde auch hier durch spektroskopische Techniken bestätigt und bestätigte frühere Ergebnisse, bei denen verschiedene Reihen von

Die Gos-Eisen-Komplex-Stöchiometrie wurde durch Elektronen-Spin-Ionisations-Massenspektroskopie charakterisiert [45].

Diese Ergebnisse belegen die schützende Wirkung von Gos gegen eisenvermittelte neuronale Schäden, wahrscheinlich durch Wechselwirkung mit Eisen(II)-Ionen, wodurch seine Beteiligung an der katalytischen Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verhindert wird. Darüber hinaus deutet dies auf die Bildung eines transienten Charge-Transfer-Komplexes zwischen Fe(Ⅱ) und Gos hin, der die Fe(II)-Oxidation beschleunigt und die Bildung eines stabileren Fe(III)-Gos-Komplexes, der nicht an der Ausbreitungsphase des Lipids teilnehmen kann Peroxidation. Darüber hinaus war ein biologisch relevantes Reduktionsmittel wie Ascorbat nicht in der Lage, Eisen in Gegenwart von Gos zu reduzieren, was eine prooxidative Eigenschaft bestimmter Flavonoide, die am Recycling von Eisen(II)-Ionen beteiligt sind, einschränkt. [30]. Gos war in mikromolaren Konzentrationen wirksamer als klassische Scavenger bei der Verhinderung der eisenvermittelten Oxidation von 2--Desoxyribose. Diese hohe Wirksamkeit kann der Bildung eines redoxaktiven Gos-Fe(II)/() zugeschrieben werden, wie wir zuvor bei anderen Polyphenolen beobachtet haben, die ihre Leistung als Antioxidantien bei ihrer Wechselwirkung mit Eisen in verschiedenen In-vitro-Paradigmen oxidativer Schäden verbesserten [ 22, 46-48].

Es wurde festgestellt, dass Chelatbildner, die Sauerstoff als Ligand enthalten (Oxo-Ligand, O2-) Eisen chelatieren und die Oxidation von Fe(I), die Stabilisierung von Fe(II) fördern und folglich eine Verringerung von bewirken können sein Reduktionspotential49]. Bei physiologischem pH bilden Brenzcatechine leicht thermodynamisch stabile Biskomplexe mit Eisen(III), begünstigt durch niedrige Konzentrationen der Liganden. Das Vorhandensein einer Catechol-Einheit in der Gos-Struktur lässt auf einen ähnlichen Wechselwirkungsmechanismus mit Eisen schließen, was den erreichten Schutz gegen eiseninduzierte Schäden an neuronalen Zellen und Mitochondrien erklären könnte. In dieser Hinsicht haben wir auch zuvor gezeigt, dass Mangiferin und Guttiferon A die Eisen(III)-Oxidation stimulieren und die Eisen(III)-Reduktion behindern [23,24,26-28].

Die Fähigkeit von Gos, Eisen zu chelatieren, kann auch Signalwege auslösen, die zur Neuroprotektion beitragen. Zum Beispiel wurden Prolylhydroxylasedomänenenzyme (PHD), die klassischen Hypoxie-induzierbaren Faktor-lalpha(HIF-1o)-Hydroxylierungs-modifizierenden Enzyme unter Normoxie, als kritische Ziele von Eisenchelatoren identifiziert, die für viele klinisch vorteilhaft sind neurologische Störungen [50,51]. Es ist verständlich, da PHD von zweiwertigem Eisen als Kopplungsfaktor abhängt [52]. Mehrere Gene, die an der Neuroprotektion beteiligt waren, werden durch HIF-la reguliert, wie eNOS, VEGF und EPO[53]. Darüber hinaus könnte die aus der PHD-Inhibition resultierende HIF-Aktivierung eine durch oxidativen Stress vermittelte mitochondriale Beeinträchtigung und Apoptose verhindern, unabhängig von seiner Rolle als Transkriptionsfaktor [54].

Ferroptose, der kürzlich charakterisierte eisenabhängige regulierte Zelltod, wurde als Mechanismus vorgeschlagen, durch den die Neuronen sterben, die hämorrhagischen Schäden ausgesetzt sind [8]. Eine mitochondriale Dysfunktion wurde kürzlich mit dem Zelltod durch Ferroptose in Verbindung gebracht [55]. Daher könnte die Hemmung der Ferroptose, die die mitochondriale Funktion vor Eisenschäden schützt, auch ein plausibler Mechanismus für die Neuroprotektion gegen eisenvermittelte neurologische Störungen sein, die durch Gos geschützt werden und weitere Aufmerksamkeit verdienen würden. Weitere Untersuchungen zu den mutmaßlichen vorteilhaften Wirkungen von Gos auf In-vivo-Tiermodelle der eisenassoziierten Neurodegeneration müssen durchgeführt werden, um dieses Flavonoid als therapeutische Intervention gegen Hirngewebeschäden vorzuschlagen, die durch eine Deregulierung der Eisenhomöostase induziert werden.