Identifizierung und funktionelle Analyse eines Bifavons als neuartiger Inhibitor transienter Rezeptorpotential-Vanilloid-4-abhängiger atherogener Prozesse

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Mazen O. Alharbi, Bidisha Dutta, Rishov Goswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman

Atherosklerose, eine fortschreitende entzündliche Erkrankung der großen Arterien, leistet weltweit den größten Beitrag zur wachsenden Belastung durch kardiovaskuläre Erkrankungen in Verbindung mit Mortalität und Morbidität1. Das entscheidende auslösende Ereignis, das zu Atherosklerose führt, beinhaltet die Retention von Partikeln aus modifiziertem Lipoprotein niedriger Dichte (oxLDL) in den subendothelialen Intimaräumen der Aorta, hauptsächlich an arteriellen Verzweigungspunkten2. Während der frühen Atherogenese, nach endothelialer Dysfunktion, wandern zirkulierende Blutmonozyten in die Intimabereiche und differenzieren sich zu Gewebemakrophagen3. Im Intimaraum der Aorta erzeugt die Bindung und Aufnahme von oxLDL durch Makrophagen, unterstützt durch Scavenger-Rezeptoren wie SRA und CD36, eine athero-inflammatorische Feedforward-Schleife, die zur Entwicklung von lipidbeladenen Schaumzellen führt, einem kritischen Prozess bei Arteriosklerose2–8. Die durch Schaumzellen hervorgerufenen Kaskaden der entzündlichen Ereignisse führen zur Bildung eines frühen Fettstreifens und schließlich zum Auftreten fortgeschrittener Atherosklerose-Läsionen, die durch das Vorhandensein einer fibrösen Kappe, verkalkten Gewebes, Immunzellen, Matrixproteinen und Lipiden gekennzeichnet sind2–10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) der TRPV-Unterfamilie, ein nicht-selektiver, polymodaler Kationenkanal, der für Ca2 plus durchlässig ist, wird ubiquitär in verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich Makrophagen11–24. Früher als Osmosensor bekannt, reagiert TRPV4 heute auf vielfältige biochemische und biomechanische Stimuli, darunter Hitze, Matrixsteifheit, Osmolarität, Wachstumsfaktoren, pH-Wert und 4 Phorbolester11–24. Es wird berichtet, dass TRPV4 mehrere physiologische Funktionen wie Schmerzempfindung bei Entzündungen und Neuropathien18,22,23, Myofibroblasten-Differenzierung und -Migration 17,25,26 und Osteoklasten-Differenzierung im Knochen27 vermittelt. TRPV4-Mutationen wurden mit mehreren Kanalopathien in Verbindung gebracht28–31. Jüngste Studien unserer Gruppe und anderer haben eine mögliche Rolle dieses Kanals bei unzähligen pathologischen Zuständen wie Lungenverletzungen22,32, Schaumzellbildung14,16, Gewebefibrose17,33, Fremdkörperreaktion13 und Krebs34,35 impliziert. Zuvor wurde eine atheroprotektive Rolle von TRPV4 gezeigt, bei der gezeigt wurde, dass die durch chemische Agonisten induzierte TRPV4-Funktion in Endothelzellen mit der Aktivierung von eNOS und der Hemmung der Monozytenadhäsion an Endothelzellen assoziiert ist36. Im Gegensatz dazu wurden Mängel in den TRPV4-Funktionen mit zahlreichen atheroinflammatorischen Reaktionen in Verbindung gebracht, darunter endotheliale Dysfunktion, reduzierte Bildung von Makrophagenschaumzellen und Gefäßerkrankungen14,16,37–39. Unser Labor hat kürzlich eine proatherogene Rolle von TRPV4 identifiziert, wodurch es die Bildung von oxLDL-induzierten Makrophagenschaumzellen reguliert. Mechanistisch haben wir gezeigt, dass TRPV4 die Aufnahme, aber nicht die Bindung von oxLDL in Makrophagen in einer CD36--unabhängigen Weise beeinflusst14. In einer anderen Studie berichteten wir über eine TRPV4--abhängige Exazerbation der oxLDL-induzierten Schaumzellbildung in Gegenwart von Lipopolysaccharid und zunehmender Matrixsteifigkeit, wodurch eine Verbindung zwischen Mechanosensorik und Arterioskleroserisiko hergestellt wurde16. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TRPV4 ein attraktives Ziel bei Arteriosklerose und anderen Krankheiten ist, und somit einen Anreiz für die Entdeckung von niedermolekularen Inhibitoren von TRPV4 bieten, die in klinisch wirksame Therapeutika umgesetzt werden können. Die Verwendung natürlicher Verbindungen in Therapeutika hat an Bedeutung gewonnen, hauptsächlich getrieben durch den Bedarf an kostengünstigen und biokompatiblen Verbindungen im Vergleich zu den derzeit existierenden synthetischen Arzneimitteln. Naturstoffe wie zFlavonoide, Alkaloide,Polyphenoleund Curcuminoide beeinflussen kardiovaskuläre Erkrankungen über verschiedene Mechanismen, wie z. B. die Hemmung vonentzündungsförderndSignale, Insulinsensibilisierung und Verbesserung der Blutfettprofile durch gezielte Behandlung der AMPK-, COX1/2-, eNOS- und Nrf2-Signalwege40–45. Jüngste Studien mehrerer Gruppen haben zwei Flavonoide, Berberin und Apigenin, als potenzielle Modulatoren der TRPV4-Aktivität identifiziert46,47. Wir haben eine Semi-Hochdurchsatz-Screening-Methode entwickelt und verwendet, um potenzielle Antagonisten von TRPV4 aus einer Bibliothek natürlicher Verbindungen mit einem Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) -basierten Ca2 plus Influx-Assay zu identifizieren. Hier berichten wir über die Identifizierung und funktionelle Analyse von Linkedin, einem Flavon, als neuartigen Inhibitor von TRPV4--abhängigen atherogenen Prozessen in Makrophagen und legen damit eine Grundlage für weitere Untersuchungen dieser natürlichen Verbindung als natürliches Antiatherosklerotikum Molekülverbindung. Es wurde berichtet, dass Linkedin neuroprotektive,antikarzinogen, undAntiphlogistikumRollen48,49. Wir berichten über den Wirkmechanismus von Linkedin gegen TRPV4 im Zusammenhang mit der Makrophagenschaumzellbildung unter Verwendung zahlreicher biochemischer und zellulärer Assays.

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Materialien und Methoden Tier- und Zellkultur

Wir kauften kongene C57BL/6-Wildtyp (WT)-Mäuse von Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Die Richtlinien des Animal Care and Use Committee der University of Maryland wurden für alle Tierversuche befolgt, und die Autoren hielten sich an die ARRIVE-Richtlinien. Zur Isolierung von Thioglycolat-induzierten murinen residenten Makrophagen (MRM) wurde nach 4 Tagen intraperitonealer Thioglycolat-Injektion eine Peritonealspülung entnommen, und die Zellen wurden in 10 % fötalem Rinderserum (FBS) gehalten, das DMEM enthielt7,14,16. Eine Maus-Makrophagen-Zelllinie (RAW264.7) und menschliche dermale Fibroblasten (HDF) wurden von ATCC (Manassas, VA) gekauft und wurden jeweils mit DMEM oder MEM (Gibco, Waltham, MA) kultiviert. Aus dem Knochenmark der Maus stammende Makrophagen (BMDMs) wurden von 6- bis 7- Wochen alten Mäusen geerntet, wie zuvor beschrieben14,50,51. Kurz gesagt wurden Oberschenkelknochen von WT- und TRPV4-KO-Mäusen gesammelt, und Knochenmark von Oberschenkelknochen wurde mit vollständigem DMEM-Medium mit 10 Prozent FBS ausgespült. Die suspendierten Knochenmarkzellen wurden durch ein 70-µm-Sieb (BD Bioscience) filtriert, zentrifugiert und in mit M-CSF (25 ng/ml) ergänztem DMEM-Medium für 7–8 Tage bei 37 Grad gehalten, um eine Differenzierung in Makrophagen zu ermöglichen.

Reagenzien

Linkedin und GSK1016790A (GSK101) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen, und das FLIPR-Calcium-6-Assay-Kit wurde von Molecular Device (Sunnyvale, CA) bezogen. Menschliches natives LDL (VLDL) wurde von Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada) gekauft. Wir inkubierten LDL mit 5 µM CuSO4 für 12 h bei 37 Grad, um kupferoxidiertes LDL (oxLDL) herzustellen7,14,16. Mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes DiI-oxLDL wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA) und MCSF von R&D (Minneapolis, MN) erworben. Antikörper für die FACS-Analyse waren: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 und TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugierte sekundäre Antikörper stammten von R&D (Minneapolis, MN), und PE-konjugierte Isotypkontrollen stammten von BD (Franklin Lake, NJ). Für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) verwendeten wir das RNeasy-Kit von QIAGEN (Redwood City, CA). Alle Primer wurden von Bio-Rad (Hercules, CA) gekauft. Zellkulturmedien, zellkulturbezogene Produkte und Western-Blot-Reagenzien wurden von Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA) bezogen.

Cistanche für Anti-Müdigkeit

Semi-Hochdurchsatz-Screening

Wir führten ein Semi-Hochdurchsatz-Screening nach Antagonisten von Trpv4 aus einer Bibliothek von 2000 natürlichen Verbindungen (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) unter Verwendung eines fluorometrischen Imaging-Plate-Reader (FLIPR)-basierten Calcium-Influx-Assays durch14,17. Wir identifizierten Ginkgetin (GGT) als einen neuartigen Antagonisten für TRPV4. Das primäre und sekundäre Screening wurde mit RAW264.7, HDF und BMDMs durchgeführt, um die Fähigkeit von Linkedin und anderen Kandidaten zur Hemmung von TRPV4-ausgelöstem Ca2 plus Infux14,17 zu beurteilen. Als Kontrollen verwendeten wir A23187, ein Calciumionophor, TRPV4-Null-BMDMs und GSK219, einen selektiven TRPV4-Antagonisten17. Nach dem sekundären Screening identifizierten wir sechs Verbindungen, die im Vergleich zur Vehikelkontrolle eine mehr als dreifache Hemmung des TRPV4--vermittelten Ca2-plus-Einstroms zeigten. Linkedin wurde als der stärkste Inhibitor der TRPV4-Aktivität identifiziert. BMDMs (5 × 10 4 Zellen/Vertiefung) wurden in kollagenbeschichtete (10 μg/ml) 96--Vertiefungen, schwarze Platten mit klarem Boden, ausgesät und bei 37 Grad, 5 % CO 2 inkubiert. Am Tag des Experiments wurden die Zellen mit Calcium-6-Farbstoff in HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM Probenecid beladen und für 45 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Nach der Inkubation wurden Bibliotheksverbindungen zu jeder Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 2 &mgr;M hinzugefügt. Die Platten wurden für weitere 45 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Ca2 plus Einstrom wurde durch Zugabe von 10 nM des TRPV4-Agonisten GSK1016790A in mit Vehikel oder Verbindung vorbehandelten Zellen induziert und durch Messen von ΔF/F (Max-Min) aufgezeichnet, wie zuvor beschrieben17. Die Daten werden als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) gezeigt.

Immunoblots

Durch Thioglycolat hervorgerufene peritoneale Makrophagen wurden in 10 % FBS, enthaltend DMEM, ausgesät und über Nacht inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden abgewaschen, und 1 Prozent Rinderserumalbumin (BSA), das DMEM enthielt, wurde zu der Platte gegeben und vor der Linkedin-Behandlung 3 h lang inkubiert. Um die Expression von CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4-, TLR6- und GAPDH-Proteinen zu bestimmen, wurden Ganzzelllysate aus Zellen hergestellt, die über Nacht mit Linkedin (1 und 5 µM) oder Vehikel in Gegenwart oder Abwesenheit von oxLDL (25 µg/ml) behandelt wurden ). Um die Expressionsniveaus von LPS-getriggertem p-JNK und JNK zu bestimmen, wurden Zellen mit Linkedin (5 und 10 &mgr;M) für 3 h vorbehandelt und dann mit E. coli LPS für 30 min stimuliert. Ganzzelllysate wurden aus zweimal gewaschenen Zellen (eiskaltes PBS) unter Verwendung von RIPA-Puffer mit zugesetztem Protease-Inhibitor-Cocktail (Thermo Scientific, MA) hergestellt. Blots wurden mit Kaninchen-Anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), Anti-Maus-CD36 (R&D, Minneapolis, MN), Kaninchen-Anti-TLR4, Kaninchen-Anti-TLR6, Kaninchen-Anti-JNK und Kaninchen-Anti-p- JNK-Primärantikörper (Cell Signaling, Danvers, MA), gefolgt von Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (R&D, Minneapolis, MN). Die Blots wurden gestrippt und erneut mit Anti-GAPDH-IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) zur Beladungskontrolle sondiert.

Bildung von Schaumzellen.Thioglykolat-getriggerte MRM wurden auf Deckgläschen aus Glas in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit DMEM, 10 Prozent FBS ausgesät und bei 37 Grad, 5 Prozent CO 2 für 2 Stunden inkubiert. GGT (1 oder 10 &mgr;M) wurde zu den Zellen gegeben, und nach 3 h Inkubation wurde oxLDL (50 &mgr;g/ml) zugegeben, und die Kulturen wurden über Nacht bei 37 Grad inkubiert. Natives LDL (50 ug/ml) wurde zu den Vertiefungen der Kontrollgruppe gegeben und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer Färbung mit Oil Red O, um die Schaumzellbildung zu quantifizieren.

Adenovirus-Vektortransduktion.Wir sammelten Adenovirus-Konstrukte zum Exprimieren von Ad(RGD)-Maus-TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) und Adenovirus-Leervektor Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml). Vektor Biolabs, Malvern, PA. Wir verwendeten 1 × 10 8 pfu/ml für alle Experimente. Für Studien zur Schaumzellbildung wurden Maus-Peritonealmakrophagen mit Ade-TRPV4 oder Ade-Vec in DMEM-Medium für 72 h vor der Zugabe von oxLDL inkubiert, um Makrophagen-Schaumzellen zu erzeugen.

Bindung und Aufnahme von Ochsen-LDL.Um die Bindung zu beurteilen, wurden peritoneale Makrophagen mit zwei Dosen (1 oder 10 &mgr;M) von Linkedin oder Vehikel für 3 Stunden behandelt und mit DiI-oxLDL bei 4 Grad für eine Stunde inkubiert. Nach der Vorbehandlung mit Linkedin oder Vehikel wurden die Zellen mit DiI-oxLDL bei 37 Grad für 30 Minuten inkubiert, um die Aufnahme zu beurteilen. Die Bilder wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (63x) erfasst, und Bild J wurde verwendet, um die Ergebnisse zu quantifizieren.

Durchflusszytometrische Analyse.Durch Thioglykolat hervorgerufene peritoneale Makrophagen wurden in DMEM, 10 Prozent FBS, 24 Stunden lang kultiviert. Nicht anhaftende Zellen wurden abgewaschen, serumfreies Medium wurde zugegeben und die Zellen wurden für 2 h inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 5 &mgr;M GGT oder Vehikel, und die Inkubation wurde für 3 h fortgesetzt. Behandelte Zellen wurden von der Platte abgekratzt und in PBS, 2 % BSA resuspendiert. Die Zellen wurden 45 Minuten lang mit primären Antikörpern inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation mit PE-konjugiertem sekundärem Antikörper. Zur Datenerfassung wurde ein FACSCantoII-Durchflusszytometer (BD Bioscience, Ontario, Kanada) verwendet. Alle Daten wurden mit der FlowJo-Software verarbeitet.

qRT‑PCR.Thioglycolat-induzierte Makrophagen wurden mit 5 &mgr;M Linkedin oder Vehikel für 3 h behandelt; 25 ug/ml oxLDL wurden dem Vehikel oder den mit Linkedin behandelten Zellen zugesetzt, und die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. RNeasy Micro Kit (#74.004) von QIAGEN wurde verwendet, um Gesamt-RNA zu extrahieren, und ein Universal SYBR Green One-Step Kit von Bio-Rad wurde verwendet, um die RNA revers zu transkribieren. Zur Datenerfassung wurde ein C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) verwendet. Die Expression eines Gens wurde als die Menge an genspezifischer mRNA im Verhältnis zu GAPDH-mRNA unter Verwendung des vergleichenden CT-Verfahrens bestimmt, das im Bio-Rad qRT-PCR System User Bulletin beschrieben ist.

Statistische Analyse.Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von biologischen Triplikaten dargestellt. Die Software GraphPad Prism 7.0 wurde verwendet, und die Berechnungen wurden unter Verwendung des Student-t-Tests für zwei Gruppen oder der einfachen ANOVA für mehrere Gruppen durchgeführt.

Ethische Zustimmung.Alle Experimente an Mäusen wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt und vom University of Maryland-College Park Review Committee genehmigt.

Ergebnisse in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>dreifach; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Abbildung 1. Semi-Hochdurchsatz-Screening-basierte Identifizierung von Linkedin als neuartigem TRPV4-Inhibitor aus einer Bibliothek natürlicher Verbindungen. (A) Flussdiagramm, das den Arbeitsablauf zeigt, der zur Identifizierung von Ginkgetin als potenzieller TRPV4-Inhibitor aus einer Bibliothek von 2000 natürlichen Verbindungen führt. (B) Repräsentative FlexStation 3-Aufzeichnung, die die hemmende Wirkung von 6 natürlichen Verbindungen auf den TRPV4-Agonisten (GSK1016790A)-induzierten Ca2-plus-Einstrom in mit Calcium-6-Farbstoff beladenen BMDMs während des sekundären Screenings zeigt. Die Vorbehandlung mit allen 6 Verbindungen zeigte im Vergleich zu Zellen, die mit Vehikel (Negativkontrolle; Vehikel plus GSK1016790A (10 nM)) oder Calciumionophor (A23187, 2 μM) vorbehandelt wurden, inhibitorische Wirkungen auf TRPV4--abhängigen Ca2 plus Einstrom. Wir verwendeten den selektiven TRPV4-Antagonisten GSK2193874 (10 nM) als Negativkontrolle. Alle Experimente wurden dreimal vierfach wiederholt. RFU: relative Fluoreszenzeinheit.

Die TRPV4-Hemmung durch GGT hemmt die Bildung von oxLDL‑induzierten Makrophagenschaumzellen.Unsere früheren Studien zeigten, dass durch TRPV4- ausgelöstes Ca2 plus Einstrom an der oxLDL-vermittelten Schaumzellbildung beteiligt ist 14,16. Daher bewerteten wir die Möglichkeit, dass die Schaumzellbildung durch GGT-vermittelte Antagonisierung der TRPV4-Aktivität gehemmt wurde. Wildtyp-Maus-Peritonealmakrophagen wurden mit oxLDL inkubiert, um die Bildung von Schaumzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von GGT zu induzieren, und durch Oil Red O-Färbung analysiert. Wie erwartet stellten wir fest, dass die Bildung von Schaumzellen in mit oxLDL behandelten Makrophagen im Vergleich zu nativem LDL um das Fünffache zunahm (Abb. 2A, B). Jedoch verringerte die Behandlung der Makrophagen mit GGT (1 oder 10 &mgr;M) vor der Stimulation mit oxLDL den Prozentsatz an Schaumzellen signifikant ( 2A , B). Zusammenfassend legen diese Befunde eine hemmende Wirkung von GGT auf die Bildung von Makrophagenschaumzellen nahe, die möglicherweise auf TRPV4-ausgelöstes Ca2 plus Einstrom abzielt. Darüber hinaus überexprimierten wir TRPV4 in TRPV4-Null-Makrophagen unter Verwendung eines Adenovirus-Konstrukts und induzierten dann die Bildung von Schaumzellen unter Verwendung von oxLDL in Gegenwart von GGT. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von TRPV4 die Bildung von Schaumzellen erhöhte, die blockiert wurde, als wir die Zelle mit GGT vorbehandelten, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der proatherogenen Schaumzellbildung durch GGT TRPV4-abhängig ist ( 2C , D).

GGT blockiert nicht das basale Expressionsniveau von TRPV4 und Entzündungsrezeptoren.Der Scavenger-Rezeptor CD36 spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme und Bindung von oxLDL und der Bildung von Schaumzellen, entscheidende Prozesse bei Atherosklerose4–7,54,55. In letzter Zeit deuten immer mehr Beweise auf die Beteiligung von Toll-like-Rezeptoren bei Arteriosklerose hin2,4,56. Um zu untersuchen, ob GGT die Bildung von Schaumzellen blockierte, indem es die Expression von CD36, TLR4, TLR6 und TRPV4 beeinflusste, führten wir eine Immunoblot-Analyse bei zwei Konzentrationen von GGT (1 oder 5 &mgr;M) durch. Wir fanden ähnliche Expressionsniveaus von CD36, TRPV4, TLR6 und TLR4 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Abb. 3A–D). Die durchflusszytometrische Analyse zeigte auch keinen signifikanten Unterschied in der Zelloberflächenexpression der Proteine ​​mit oder ohne GGT-Behandlung (Abb. 3E–H, I–L). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass GGT die Bildung von Makrophagen-Schaumzellen blockiert, ohne die Grundniveaus der Oberflächenexpression von TRPV4, CD36, TLR4 und TLR6 zu hemmen.

Abbildung 2. Die Hemmung von TRPV4 durch Linkedin verhindert die Bildung von oxLDL-induzierten Makrophagenschaumzellen. (A) Thioglycolat-induzierte peritoneale Makrophagen der Maus wurden über Nacht mit 50 &mgr;g/ml oxLDL behandelt, gefolgt von einer 3-stündigen Vorinkubation mit Vehikel oder 1 oder 10 &mgr;M Linkedin. Die Zellen wurden mit 50 &mgr;g/ml nativem LDL (VLDL) als Kontrolle behandelt. Originalvergrößerung: 40x. (B) Die Quantifizierung der Ergebnisse ist in (A) gezeigt. n=500 Zellen/Bedingung. Student's t-Test; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Aufnahme von oxLDL, aber keine Bindung durch Makrophagen wird durch GGT unterdrückt. Da zuvor gezeigt wurde, dass TRPV4 eine Rolle bei der Aufnahme von oxLDL und der Bildung von Schaumzellen spielt14,16, untersuchten wir, ob die Behandlung mit GGT eine Beeinträchtigung der Bindung von oxLDL auf der Makrophagenoberfläche verursachte. WT-Peritonealmakrophagen wurden vor der Inkubation mit DiI-oxLDL bei 4 Grad mit GGT behandelt, und die Bindung wurde bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von oxLDL auf der Makrophagenoberfläche durch die Behandlung mit GGT (1 oder 10 &mgr;M) im Vergleich zur Vehikelkontrolle nicht signifikant behindert wurde ( 5A –C). Nachdem festgestellt wurde, dass GGT die Bindung von oxLDL nicht hemmt, wollten wir als nächstes bestimmen, ob die Aufnahme von oxLDL in Makrophagen durch die GGT-Behandlung beeinträchtigt wurde. Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass es eine signifikante Hemmung der Aufnahme von oxLDL in Makrophagen in mit GGT vorbehandelten Zellen im Vergleich zu der mit Vehikel behandelten Gruppe gab ( 6A , B). Alles in allem legen diese Ergebnisse nahe, dass GGT die Aufnahme von oxLDL blockiert, aber nicht die Bindung in Makrophagen.

GGT blockiert die oxLDL‑induzierte Expression von TRPV4 in Makrophagen.

Da unsere zuvor veröffentlichten Studien zeigten, dass TRPV4- ausgelöstes Ca2 plus eine Rolle bei der oxLDL-vermittelten Makrophagen-Schaumzellbildung spielt14,16, versuchten wir zu bestimmen, ob GGT die Schaumzellbildung durch Unterdrückung der oxLDL-induzierten Expression von CD36 blockiert, TLR2, TLR4, TLR6 oder TRPV4. Wir fanden heraus, dass die Stimulation von Makrophagen über Nacht mit oxLDL zu einer signifikanten Hochregulierung der Expression von TRPV4-Proteinen im Vergleich zu LDL führte, während die Expression anderer Rezeptoren (CD36, TLR2, TLR4 und TLR6) unverändert blieb (Abb. 4A–F). Die Vorbehandlung von Zellen mit GGT vor der Stimulation mit oxLDL verringerte selektiv das Expressionsniveau von TRPV4-Proteinen im Vergleich zur Vehikelbehandlung (Abb. 4A–F). Insgesamt legen diese Befunde eine hemmende Wirkung von GGT auf die TRPV4-Proteinexpression nahe, die teilweise an der Unterdrückung der Schaumzellenbildung durch GGT beteiligt sein könnte.

Abbildung 3. Die Behandlung mit Linkedin verändert nicht die Gesamtprotein- oder Oberflächenexpression von TRPV4, CD36 und TLRs in Makrophagen. (A–D) Immunoblots von Makrophagen-Ganzzelllysaten nach Behandlung über Nacht mit 1 oder 5 µM Linkedin oder Vehikel. Repräsentative Immunoblots zeigen die Gesamtproteinexpression von CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) und TLR4 (D) in mit Linkedin behandelten und unbehandelten Zellen. Es wurden drei unabhängige biologische Wiederholungen und drei experimentelle Wiederholungen für jede Versuchsreihe durchgeführt. (E–H) Durchflusszytometrische Analyse von Makrophagen, die über Nacht mit 5 μM Linkedin behandelt wurden oder unbehandelt sind und die Oberflächenexpression von TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) und TLR6 (G) in unbehandelten und mit Linkedin behandelten Zellen zeigen. Drei unabhängige biologische Wiederholungen und 30, 000 Zellen pro Bedingung wurden analysiert. (I–L) Quantitative Analyse der Ergebnisse aus (E–H). Analysiert durch zweiseitigen t-Test mit 99-Prozent-Konfidenzintervall. Pro Experiment gezählte Zellen, 30,000; zwei experimentelle Wiederholungen.

GGT blockiert die proatherogene JNK2-Aktivierung und Entzündung in Makrophagen. Veröffentlichte Berichte aus unserem Labor und anderen haben gezeigt, dass die Aktivierung von JNK2 eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Schaumzellen und Arteriosklerose spielt7,57. Um zu bestimmen, ob GGT die Aktivierung von JNK1/2 hemmen könnte, wurden Makrophagen mit GGT behandelt, gefolgt von einer Stimulation mit LPS oder oxLDL. Die Ergebnisse der Immunoblot-Analyse zeigten, dass die Behandlung mit GGT die oxLDL- oder LPS-induzierte Phosphorylierung von JNK1/2 im Vergleich zur unbehandelten oder mit nativem LDL behandelten Kontrolle signifikant unterdrückte (Abb. 7A–D). Es wurde gezeigt, dass die JNK-Aktivierung in Makrophagen die Transkription von proinflammatorischen Mediatoren induziert, die mit Atherosklerose assoziiert sind58–60. Um festzustellen, ob GGT möglicherweise die Expression dieser proinflammatorischen Regulatoren in Makrophagen blockieren könnte, wurden mit GGT vorbehandelte Zellen mit oxLDL stimuliert und die mRNA-Expressionsniveaus von TNF , IL 6, IL12, IL1 und MCP1 wurden durch qRT-PCR-Analyse quantifiziert. Wir stellten eine signifikante Herunterregulierung der oxLDL-induzierten Expressionsniveaus von TNF-, IL12-, IL1- und MCP1-mRNA in GGT-behandelten Zellen im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen fest (Abb. 7E–I). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass GGT die proatherogene JNK2-Aktivierung und die entzündliche Genexpression als Reaktion auf die oxLDL-Stimulation in Makrophagen blockiert. Diskussion Es ist bekannt, dass natürliche Verbindungen wie Flavonoide und Polyphenole kardiovaskuläre Reaktionen über verschiedene Mechanismen modulieren, wie etwa Hemmung proinflammatorischer Signale, Insulinsensibilisierung, oxidativer Status und Verbesserung der Blutfettwerte40–45. Hier berichten wir über die Screening-basierte Halbhochdurchsatz-Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Linkedin, einem Flavon, als neuartigem Inhibitor von TRPV4--abhängigen protherogenen/entzündlichen Prozessen in Makrophagen. Wir haben insbesondere gezeigt, dass i) Ginkgetin den TRPV4--vermittelten Ca2 plus-Einstrom in Makrophagen blockiert, ii) die Ginkgetin-Blockade der TRPV4-Funktion die oxLDL-induzierte Schaumzellbildung deutlich verringert, indem die Aufnahme von oxLDL in Makrophagen unterdrückt wird, und iii) Ginkgetin blockiert LPS- und oxLDL-induzierte Phosphorylierung von JNK1/2, Expression von TRPV4-Proteinen und entzündliche Genexpression. Insgesamt zeigten die Ergebnisse unserer Studie, dass Ginkgetin die proatherogene/entzündliche Makrophagenfunktion auf TRPV4--abhängige Weise hemmt. Atherosklerose, eine Aortenerkrankung, wird anfänglich durch Entzündungen und die Ansammlung von Makrophagen mit oxLDL angeheizt, wodurch die Bildung von Makrophagen-Schaumzellen induziert wird, die anschließend zur Bildung von Atheromen fortschreiten2–10. Da die Bildung von Schaumzellen ein kritischer Prozess bei der Atherogenese ist, kann das Verständnis und die Manipulation der Bildung von Schaumzellen therapeutisches Potenzial haben. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine Reihe von membrandurchdringenden Ionenkanälen und Pumpen exprimieren, einschließlich TRPV4, einem mechanosensitiven polymodalen Ca2 plus durchlässigen Ionenkanal, der sowohl durch physikalische als auch biochemische Stimuli aktiviert wird11–24. Veröffentlichte Studien unseres Labors und anderer haben die Rolle von TRPV4 bei der Entzündung von Makrophagen und der Bildung von oxLDL-induzierten Schaumzellen identifiziert14–16,26. TRPV4 kann somit als brauchbares Ziel zur Abschwächung proatherogener Prozesse dienen.

Abbildung 5. Linkedin unterdrückt die DiI-oxLDL-Bindung an Makrophagen nicht. Makrophagen wurden mit Vehikel oder Linkedin (1 oder 10 &mgr;M) für 3 h vorbehandelt, gefolgt von Inkubation mit DiI-markiertem oxLDL (2,5 &mgr;g/ml) für 1 h bei 4 Grad. (A) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Bilder (Originalvergrößerung, 63-fach) der DiI-oxLDL-Bindung auf der Makrophagenmembranoberfläche (n =20 Zellen/Bedingung). (B) Ergebnisse aus Experiment A, dargestellt als Plotprofil unter Verwendung der NIH ImageJ-Software. (C) Quantitative Analyse der Ergebnisse von A. n=20 Zellen/Zustand. bei der Verbesserung der Atherosklerose durch Verringerung von MMP-2 und MMP-9 und Erhöhung der NO- und NOS-Spiegel in den Brustaorten von Ratten52. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Ginkgetin TRPV blockiert4-einen Ca2-plus-Einstrom in Makrophagen auslöst. Mechanistisch haben wir gezeigt, dass Ginkgetin die Aufnahme von oxLDL in Makrophagen blockiert, aber nicht bindet. In-vivo- und in-vitro-Studien deuteten auf eine entscheidende Rolle von CD36 als Haupt-Scavenger-Rezeptor bei der Aufnahme von oxLDL und der Bildung von Makrophagenschaumzellen hin2–7. Es wurde gezeigt, dass CD36-Null-Mäuse, denen ApoE oder LDLR fehlt, weniger anfällig für die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen sind5,6. Frühere Studien unserer Gruppe identifizierten eine wesentliche Rolle der CD36-JNK-Signalkaskade bei der Makrophagenschaumzellbildung7. Die Toll-like-Rezeptoren TLR2, TLR4 und TLR6 fungieren als Korezeptoren, indem sie mit CD36 interagieren, und es wurde gezeigt, dass sie an der Atherogenese beteiligt sind2,56,63. Wir untersuchten die Möglichkeit, dass das Fehlen einer Schaumzellbildung, die bei mit Linkedin behandelten Makrophagen beobachtet wurde, auf eine verringerte Expression von CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4- oder TLR6-Proteinen zurückzuführen ist. Interessanterweise verringerte die Linkedin-Behandlung die Expression von CD36-, TLR2-, TLR4- oder TLR6-Proteinen auf Basisniveaus oder unter oxLDL-stimulierten Bedingungen nicht signifikant. Linkedin blockierte jedoch spezifisch die oxLDL-induzierte Hochregulierung der Expression von TRPV4-Proteinen, während seine Expression auf Basisniveaus unverändert blieb. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Ginkgetin die oxLDL-induzierte Schaumzellbildung über einen Mechanismus blockiert, der von der CD36- und TLR-Expression unabhängig, aber von TRPV4 abhängig ist. Frühere Studien unserer Gruppe und anderer zeigten, dass die JNK2-Aktivierung an der Bildung von Schaumzellen und der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen beteiligt ist7,57. Es wurde auch berichtet, dass JNK an der Modulation von MMP-9 und MMP-13 beteiligt ist, die in atherosklerotischen Läsionen überexprimiert werden64–68. Angesichts der anerkannten Verbindung von JNK zu atherogenen Prozessen wollten wir feststellen, ob Ginkgetin die Aktivierung von JNK hemmen könnte. In Übereinstimmung mit früheren Berichten zeigten unsere Ergebnisse auch, dass Ginkgetin die durch Entzündungsreize induzierte Phosphorylierung von JNK2 in Makrophagen blockiert. Dieses Ergebnis deutet auf einen möglichen Mechanismus hin, durch den Linkedin die Bildung von Schaumzellen blockiert. Darüber hinaus fanden wir eine signifikante Herunterregulierung der oxLDL-induzierten Expression von TNF-, IL12-, IL1- und MCP1-mRNA in mit Ginkgetin behandelten Zellen im Vergleich zur Vehikelkontrolle, was die potenzielle entzündungshemmende Rolle von Ginkgetin als Reaktion auf oxLDL hervorhebt. Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass Ginkgetin die proatherogene und entzündliche Makrophagenfunktion in einer TRPV4--abhängigen Weise hemmt. Diese Befunde stärken somit die Begründung für die Verwendung natürlicher Verbindungen bei der Entwicklung potenzieller Therapeutika und/oder chemopräventiver Reagenzien.

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