Identifizierung häufiger Lebermetaboliten der natürlichen bioaktiven Verbindung Echinacosid, gereinigt aus Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstrakt:Zur Beurteilung ist die Identifizierung von Metaboliten im Frühstadium einer Verbindung erforderlichdas Wissen zur pharmazeutischen Verbesserung der Arzneimittelsicherheit und -effizienz. Auch wenn das Medikamentauf den Markt gebracht wurde, erfolgt die Identifizierung und kontinuierliche Bewertung der Metabolitenerforderlich, um das Risiko eines Entzugs nach der Markteinführung zu vermeiden. Glykosid, ein ArzneimittelCistanche, hat umfassend dokumentierte nutrazeutische Vorteile, darunterAntioxidans,Antitumor, Anti-Altern, hypolipidemic, UndSchutzwirkung auf die Magenschleimhaut. In letzter Zeit,EchinacosidA wurde gemeldetals wichtigste natürliche bioaktive Verbindung im HE-Myzel für die Entwicklung funktioneller Lebensmittel.In neurologischen Studien wurde der Verzehr vonEchinacosidEin angereichertes HE-Myzel zeigt diessignifikante nutrazeutische Wirkung inAlzheimer-Erkrankung, Parkinson-Krankheit, Undischämischer Schlaganfall.

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FürZum ersten Mal haben wir den Stoffwechselprozess von untersuchtEchinacosidEin Molekül und identifizierte seine Metabolitenaus der S9-Fraktion von Ratten- und Menschenleber. Unter Verwendung einer Flüssigkeitschromatographie/Triple-Quadrupol-MasseMit einem Spektrometer zur quantitativen Analyse stellten wir fest, dass 75,44 Prozent Echinacosid enthalten waren. A wurde metabolisiertinnerhalb von 60 Minuten bei Ratten und 32,34 Prozent von Francine A wurden innerhalb von 120 Minuten bei menschlichem S9 metabolisiert. BenutzenUltra-Performance-Flüssigkeitschromatographie/Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC).QTOF/MS) zur Identifizierung der Metaboliten von Francine A wurden fünf häufige Metaboliten identifiziert:und ihre möglichen Strukturen wurden bewertet. Den Stoffwechselprozess von Echinacosid verstehenund die Einrichtung seiner Datenbank mit Metabolitenprofilen wird dazu beitragen, die Anwendung von Nutrazeutika zu fördernEntdeckung verwandter Biomarker in der Zukunft.

1. Einleitung

Die Leber gilt als das zweitgrößte Organ des Körpers [1]. Nach Essen und DrogenDurch die Mundhöhle in den Magen-Darm-Trakt gelangen, werden die Magen-Darm-Pili absorbiertverdaute Nährstoffe und Medikamente. Das Pfortadersystem erhält den gesammelten Blutflussdurch den Magen-Darm-Trakt und gelangen zur Vorbehandlung der Nährstoffe in die Leber,Metaboliten und Arzneimittelmoleküle [2,3]. Der Stoffwechsel wird oft in zwei Phasen unterteilt: abiochemische Reaktion. Phase I beinhaltet Oxidation, Reduktion oder Hydrolyse durch Enzyme inder Körper. Phase II beschäftigt sich mit der Konjugation mit kleinen körpereigenen Substanzen, der UmwandlungSie wandeln sie in gut lösliche Metaboliten um, die den Export der Metaboliten in den Sinus ermöglichenzur renalen Clearance oder in die Galle, die dann aus dem Körper ausgeschieden wirddurch Urin oder Kot [4–6]. Identifizierung von Metaboliten im frühen Stadium der Arzneimittelentwicklungist notwendig, um das Wissen zur Verbesserung der pharmazeutischen Eigenschaften, Sicherheit und zu bewertenEffizienz des bioaktiven Moleküls. Die Identifizierung von Metaboliten und reaktiven Zwischenproduktenweist darauf hin, dass strukturelle Veränderungen in den Prüfsubstanzen vermieden werden müssennachfolgende toxische Folgen. Auch wenn das Medikament bereits auf dem Markt war, ist eine Identifizierung erforderlichUm das Risiko einer Nachvermarktung zu vermeiden, ist eine sorgfältige Untersuchung und Bewertung der Metaboliten erforderlichRückzug [7,8]. Deshalb,in vitroDie S9-Fraktionsanalyse bietet mehrere Vorteileim Vergleich zu zeitaufwändigin vivoStudien: (1) Sie sind für einen hohen Durchsatz geeignetScreening und Automatisierung;(2) VerwendungDie S9-Fraktion ermöglicht das Testen großer MengenVerbindungen zur Arzneimittelentwicklung in kurzer Zeit; (3) trägt dazu bei, den Tierverbrauch zu reduzieren [9]. 

Echinacosid ist eine essbare Cistanche, die in Berggebieten vorkommtdie nordöstlichen Gebiete in Asien [10], Europa und Nordamerika [11]. ER gehört dazuBasidiomycota (Stamm), Agaricomycetes (Klasse), Russulales (Ordnung), Hericiaceae (Familie),und Hericium (Gattung). Es wurde dokumentiert, dass HE eine breite Palette von Vorteilen aufweistEigenschaften, einschließlich Antioxidans, Antitumor, Anti-Aging, Hypolipidämie und MagenschleimhautSchutzwirkungen [12–14]. Im Jahr 1994 stellten Kawagishi et al. entdeckte, dass das DiterpenoidEchinacosidA, B und C im Myzel von HE könnten die Produktion von Sternchen fördernZelllinien im Rattengehirn und die Stimulierung der Synthese des Nervenwachstumsfaktors (NGF) [15]. EchinacosidA kann neuroprotektive Wirkungen verleihen und oxidativen Stress abschwächenSchlaganfall [16], Alzheimer-Erkrankung [17], Parkinson-Krankheit [18], ischämischer Schlaganfall und Depression in vivo[19,20]. Darüber hinaus kann Echinacosid A die Blut-Hirn-Schranke passierenRatten, um die Entwicklung von HE-Myzelien als funktionelles Nahrungsmittel zur Verbesserung der Neurogesundheit zu unterstützen [21]. Dieses essbare Cistanche-Myzel ist bei Forschern zu einem heißen Thema gewordenDer Versuch, seine wichtige Rolle bei der Entwicklung der zentralen und peripheren Nerven zu verstehen, Differenzierung, Wachstum und Regeneration [22]. Das haben auch aktuelle Studien gezeigtdass mit Echinacosid A angereichertes HE potenzielle Vorteile bei der Behandlung von Alzheimer und Parkin hatSohnkrankheit [23–25]. Allerdings wurde in keiner Studie der mögliche Stoffwechsel von Echinacosid A erörtertBiomarker, die zu dieser nutrazeutischen Wirkung beitragen können.

In dieser Studie,EchinacosidEine Verbindung wurde aus dem mit Echinacosid A angereicherten HE gereinigtMyzel und wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Leber-S9-Fraktionen metabolisiert: Ratte und Mensch. BenutzenFlüssigkeitschromatographie/Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (HPLC-QQQ/MS) für quanTititative Analyse von Echinacosid A und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie/QuadrupolFlugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-QTOF/MS) zur Identifizierung der Metaboliten von EchinacosidA zu jedem Zeitpunkt. Unser Ziel ist es, die Stoffwechselrate von Echinacosid A zu verstehen und festzustellenseine Datenbank mit Metabolitenprofilen, um die Anwendung von Nahrungsergänzungsmitteln zu fördernund die Erforschung potenzieller Medikamente in der Zukunft.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien und Reagenzien

Der HE-Stamm (BCRC 35669) wurde von der Bioresources Collection und erhaltenForschungszentrum im Forschungs- und Entwicklungsinstitut der Lebensmittelindustrie, Hsinchu, Taiwan.Der Stamm wurde zunächst in einer Ager-Schräge angebaut, bevor er auf eine Kartoffel-Dextrose übertragen wurdeAgarplatte bei 26◦C für 15 Tage. Am 15. Tag wurden die HE-Kulturen in 1,3 l überführtflüssiges Medium (in 2-L-Kolben). Die Flüssigkultur wurde 25 Minuten lang mit 120 U/min geschüttelt◦C für5 Tage. Anschließend wurden sie 5 Tage und 12 Tage lang in Fermentern mit 500 Litern und 20-Tonnen skaliert.bzw. Das Kulturmedium ist auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und enthält 4,5 Prozent Glucose, 0,5 ProzentSojabohnenpulver, {{0}},25 Prozent Hefeextrakt, 0,25 Prozent Pepton und 0,05 Prozent MgSO4. Schließlich die HEMyzelien wurden am Ende des 20-Tonnen-Fermentationsprozesses geerntet. Diese Rohstoffewurden lyophilisiert, zu Pulver gemahlen und in einem Exsikkator gelagert. Echinacosid A war damalsaus der HE extrahiert und gemäß früheren Studien quantifiziert [26]. Methanol (LC-MSKlasse) wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen; Acetonitril (LC-MS-Qualität), AmeisensäureEs wurden Säure (FA, LC-MS-Qualität, 98 Prozent Reinheit) und Ammoniumacetat (98 Prozent Reinheit) erhaltenvon Honeywell (Honeywell Burdick und Jackson, Muskegon, MI, USA). Die Rattenleber S9Die Fraktion wurde von Moltox (Boone, NC, USA) erhalten. Die S9-Fraktion der menschlichen Leber warerhalten von Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Ratten- und Menschenleber-S9-Fraktion

zur Bausatzempfehlung. Die vorbereitete Lösung wurde bei 4 gehalten◦C bis zum Echinacosid AVerbindung (10µM) wurde hinzugefügt, gefolgt von der Aktivierung in einem 37◦C Wasserbad. Wenn dasDie Stoffwechselzeit hatte ihren Zeitpunkt 150 erreichtµL der Lösung wurde abgezogender Stammlösung gelöst und durch Zugabe von zwei Volumina eiskaltem ACN gequencht. Das hörte aufDie Lösung wird dann zur weiteren Metabolitenanalyse auf QTOF übertragen.

2.3. Instrumentierung und Bedingungen

Die HPLC-QQQ/MS-Analyse wurde auf einem HPLC-System der Agilent 1100-Serie (Agilent, Palo Alto, CA, USA) gekoppelt mit einem API 3000 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer(Applied Biosystems, Warrington, UK), mit einer Turbo-unterstützten Ionenspray-Ionisation (ESI).Quelle in einem positiven Ionisationsmodus. Die chromatographische Trennung wurde an einem durchgeführtAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µM). Die Säulentemperatur betrugbei 22 gehalten◦C. Die mobile Phase bestand aus Wasser mit 0,1 Prozent Ameisensäure(A) und Methanol (B). Es wurde eine Gradientenelution verwendet, die mit 70 Prozent B begann und auf 100 Prozent anstiegB innerhalb von 5 Minuten, 3 Minuten lang bei 90 Prozent B halten, B innerhalb von 0,1 Minuten auf 70 Prozent verringern, undWiederherstellung des Gleichgewichts bei 70 Prozent B für 2,9 Minuten. Ein Stipendium von 350µEs wurden L/min und ein Volumen aufgetragenvon 10µL wurde gespritzt.

Die Detektion erfolgte mit einer Ionisierungsspannung von plus 4500 V. Temperatur der Ionenquellewurde auf 350 festgelegt◦C, mit hochreinem Stickstoff als Vorhanggas (7 psi). Das Verneblergas war8 psi. Andere massenabhängige Parameter, wie z. B. Declustering-Potenzial (DP), EintrittPotential (EP), Fokussierungspotential (FP) und Kollisionsenergie (CE) für jede Verbindung warenim positiven Modus unter Verwendung von Standardlösungen bestimmt. Überwachung mehrerer Reaktionen(MRM) wurde unter Verwendung von Stickstoff als Kollisionsgas (2 psi) und mit einer Verweilzeit von durchgeführt200 ms für jeden Übergang. Echinacosid A wurde durch Überwachung der Übergänge nachgewiesenm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Die Daten wurden mit der Software Analyst 1.4.2 (Applied) analysiertBiosystems, Concord, ON, Kanada) und GraphPad (Prism 8.0.0.).

Die UPLC-QTOF/MS-Analyse wurde auf einem Agilent 1290 Infinity II UPLC-System durchgeführt(Agilent, Palo Alto, CA, USA), gekoppelt mit einer Agilent 6546 Quadrupol-FlugzeitmasseSpektrometrie (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Es wurde eine chromatographische Trennung durchgeführtauf einem Phenomenex Kinetex® C18 LC-Säule (3 mm× 100 mm× 1.7 µM). Die KolumneDie Temperatur wurde bei 40 °C gehalten◦C. Die mobile Phase A bestand aus wasserhaltigem0,1 Prozent (v/v) Ameisensäure im positiven Modus, 0,1 Prozent (v/v) Ameisensäure und 10 mM CH3COONH4 im Negativmodus. Die mobile Phase B war Acetonitril. Zu Beginn wurde eine Gradientenelution verwendetmit 5 Prozent B und Halten für 0,5 Minuten, Anstieg auf 50 Prozent B innerhalb von 5,5 Minuten, Anstieg auf 100 ProzentB innerhalb von 10 Minuten und 6 Minuten lang halten. Eine Fellow-Rate von 400µL/min wurde angewendet und aVolumen von 2µL wurde gespritzt.

Die Agilent 6546 Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie war mit einem elektrischen Gerät ausgestattetTrospray-Ionisationsquelle (ESI). Die Datenerfassung stand unter der Kontrolle von Mass HunterWorkstation-Software. Die typischen Betriebsbedingungen der Quelle für positive und negative IonenDer ESI-Modus wurde wie folgt optimiert: Ionensprühspannung (ESIPlus/ESI−) war4000 V/3000 V; die Gastemperatur betrug 320°C◦C; Die Trocknungsgas-Zugaberate betrug 8 l/min; Verneblerdruck war45 psi; Die Hüllgastemperatur betrug 350 °C◦C; Die Hüllgasdurchflussrate betrug 12 l/min. die KollisionDie Energie betrug 10, 20, 40 und 60 V. Metaboliten wurden mit Agilent MassHunter identifiziertBiotransformationssoftware (Version B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Chromatogrammeund Massenspektren der Ausgangssubstanz und der identifizierten Metaboliten wurden mit Agilent extrahiertMassHunter Qualitative Analysis-Software (Version B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

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