Identifizierung von neutrophiler Gelatinase-assoziiertem Lipocalin als neuartiger früher Urin-Biomarker für ischämische Nierenschädigung

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JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* JUN YANG,† JONATHAN BARASCH,†, und PRASAD DEVARAJAN*

*Nephrologie & Bluthochdruck, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio; und † Nephrologie, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York

Abstrakt.

AkutNieren-Versagen (ARF) als Folge einer ischämischen Verletzung bleibt ein häufiges und potenziell verheerendes Problem. Eine transkriptomweite Abfragestrategie wurde verwendet, um renale Gene zu identifizieren, die sehr früh nach renaler Ischämie induziert werden und deren Proteinprodukte als neue Biomarker für ARF dienen könnten. Sieben Gene, die plus - 10--fach hochreguliert sind, wurden identifiziert, von denen kürzlich berichtet wurde, dass eines (Cyr61) nach renaler Ischämie induziert wird. Unerwarteterweise war die Induktion der anderen sechs Transkripte für das ARF-Gebiet neuartig. In dieser Studie wurde eines dieser zuvor nicht erkannten Gene weiter charakterisiert, nämlich Neutrophilen-Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL), da es sich um ein kleines sekretiertes Polypeptid handelt, das Protease-resistent ist und folglich leicht im Urin nachgewiesen werden kann. Die deutliche Hochregulierung von NGAL-mRNA- und -Proteinspiegeln in der frühen postischämischen MausNierewurde bestätigt. Die NGAL-Proteinexpression wurde überwiegend in proliferierenden Zellkernantigen-positiven proximalen Tubuluszellen in einer punktförmigen zytoplasmatischen Verteilung nachgewiesen, die mit Markern später Endosomen kolokalisiert war. NGAL wurde im Urin bei der allerersten Urinausscheidung nach Ischämie sowohl in Maus- als auch in Rattenmodellen von ARF leicht nachgewiesen. Das Erscheinen von NGAL im Urin hing mit der Dosis und Dauer der Behandlung zusammenNieren-Ischämie und ging dem Auftreten anderer Urinmarker wie N-Acetyl- -D-Glucosaminidase und 2-Mikroglobulin voraus. Der Ursprung von NGAL aus Tubuluszellen wurde in kultivierten humanen proximalen Tubuluszellen bestätigt, die einer ischämischen In-vitro-Verletzung unterzogen wurden, wobei NGAL-mRNA schnell in den Zellen induziert wurde und NGAL-Protein im Kulturmedium innerhalb von 1 h nach leichter ATP-Verarmung leicht nachweisbar war. NGAL war auch im Urin von Mäusen mit Cisplatin-induzierter Nephrotoxizität leicht nachweisbar, wiederum vor dem Auftreten von N-Acetyl- --D-glucosaminidase und 2--Mikroglobulin. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass NGAL einen frühen, sensitiven, nicht-invasiven Urin-Biomarker für Ischämie und Nephrotoxizität darstellen könnteNieren-Verletzung.

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AkutNieren-Versagen(ARF) als Folge einer ischämischen oder nephrotoxischen Verletzung bleibt ein häufiges und potenziell verheerendes Problem in der klinischen Nephrologie mit einer anhaltend hohen Sterblichkeitsrate trotz erheblicher Fortschritte in der unterstützenden Behandlung (1–4). Bahnbrechende Studien über mehrere Jahrzehnte haben die Rolle von anhaltender Vasokonstriktion, tubulärer Obstruktion, zellulären strukturellen und metabolischen Veränderungen und der Entzündungsreaktion bei der Pathogenese von ARF beleuchtet (4–7). Obwohl diese Studien den Weg für erfolgreiche therapeutische Ansätze in Tiermodellen geebnet haben, haben translationale Forschungsbemühungen am Menschen enttäuschende Ergebnisse erbracht (2–4). Gründe hierfür können die vielfältige Reaktion der Niere auf Ischämie und Nephrotoxine sowie ein Mangel an frühen Markern für ARF mit einer daraus resultierenden Verzögerung des Therapiebeginns sein (4–8).

Versuche, die molekularen Grundlagen dieser unzähligen frühen zu enträtselnNieren-Reaktionen wurden durch jüngste Fortschritte in der funktionellen Genomik erleichtert, die neue Werkzeuge für die genomweite Analyse komplexer biologischer Prozesse wie ischämischer ARF hervorgebracht haben (8–11). Die cDNA-Microarray-Methoden liefern parallele und quantitative Expressionsprofile von Tausenden von Genen, die in Kombination mit Bioinformatik-Tools Gene in einem biologischen Signalweg identifizieren, die Funktion neuer Gene charakterisieren und Unterklassen von Krankheiten erkennen können (9). Unter Verwendung dieser Screening-Technik haben wir eine Untergruppe von sieben Genen identifiziert, deren Expression innerhalb der ersten paar Stunden nach der Ischämie 0--fach hochreguliert istNieren-Verletzungin einem Mausmodell. Für eines dieser Transkripte, Cystein-reiches Protein 61 (Cyr61), wurde kürzlich bestätigt, dass es durch renale Ischämie induziert wird (8), aber das Verhalten der anderen sechs differentiell exprimierten Gene ist in der ARF-Literatur neu. In dieser Studie entschieden wir uns für die weitere Charakterisierung eines dieser zuvor nicht erkannten Gene, nämlich Neutrophilen-Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL), da es sich um ein kleines sekretiertes Polypeptid handelt, das im Urin nachweisbar sein kann, insbesondere weil es Protease-resistent ist. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass NGAL einen neuen frühen Biomarker im Urin für Ischämie und Nephrotoxizität darstellen könnteNieren-Verletzung.

Materialen und Methoden

Mausmodelle der renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Wir verwendeten gut etablierte Mausmodelle, in denen die strukturellen und funktionellen Folgen von kurzen Perioden vonNieren-Ischämie wurden zuvor dokumentiert (11–15). Kurz gesagt wurden männliche Swiss-Webster-Mäuse (Taconic Farms, Germantown, NY) mit einem Gewicht von 25 bis 35 g mit einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12:12-h gehalten und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital (5 0 mg/kg intraperitoneal) anästhesiert und auf einen Wärmetisch gelegt, um eine rektale Temperatur von 37 Grad aufrechtzuerhalten. Drei separate Protokolle wurden verwendet: (1) einseitige Ischämie ohne ARF, (2) bilaterale Ischämie mit ARF und (3) bilaterale leichte subklinische Ischämie. Für die unilateralen Ischämieexperimente wurde der linke Nierenstiel mit einer nichttraumatischen Gefäßklemme für 45 min verschlossen, während dieser Zeit wurde die Niere warm und feucht gehalten. Die Klemme wurde dann entfernt, die Niere wurde auf Rückkehr des Blutflusses beobachtet und der Einschnitt wurde vernäht. Den Mäusen wurde erlaubt, sich in einem gewärmten Käfig zu erholen, und es wurden zeitgesteuerte Urinsammlungen durchgeführt. Nach 0, 3, 12 oder 24 h Reperfusion wurden die Tiere erneut anästhesiert, die Bauchhöhle wurde geöffnet und Blut wurde durch Punktion der unteren Hohlvene zur Messung des Serumkreatinins mit einem quantitativen kolorimetrischen Assay-Kit (Sigma, St. Louis, MO). Die Mäuse wurden getötet, die Nieren wurden in situ mit 4 % Paraformaldehyd in PBS perfusionsfixiert, und beide Nieren wurden geerntet (die rechte Niere diente als Kontrolle für jedes Tier). Mindestens drei getrennte Tiere wurden bei jeder der Reflow-Perioden untersucht. Eine Hälfte jeder Niere wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei 70 Grad gelagert; eine Probe wurde in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten (4 m). Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt und histologisch untersucht. Die abgeklemmten Nieren zeigten die charakteristischen morphologischen Veränderungen, die aus einer Ischämie-Reperfusionsverletzung resultieren, wie zuvor von anderen (12–14) und uns (11) veröffentlicht. Die andere Hälfte jeder Niere wurde in die OCT-Verbindung (Tissue-Tek) eingebettet und gefrorene Schnitte (4 m) wurden für die Immunhistochemie erhalten. Für die bilaterale Ischämie mit ARF-Experimenten wurden beide Nieren für 30 min abgeklemmt und bei verschiedenen Reflow-Perioden wie oben detailliert untersucht. Diese Gruppe von acht Tieren wurde entworfen, um klinisches ARF darzustellen, und zeigte 24 h nach der Verletzung eine signifikante Erhöhung des Serum-Kreatinins. Für die bilateralen Experimente mit milder subklinischer Ischämie wurden beide Nieren nur für 5, 10 oder 20 min abgeklemmt und bei verschiedenen Reperfusionsperioden wie oben untersucht. Dieser leichte Verletzungsgrad wurde entwickelt, um eine subklinische renale Ischämie zu simulieren, und Mäuse in dieser Gruppe zeigten keine Erhöhungen des Serum-Kreatinins, gemessen 24 h nach der Verletzung.

Rattenmodell der renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Wir verwendeten etablierte Nagetiermodelle vonNieren-Ischämie-Reperfusionsverletzung (10). Kurz gesagt, männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 250 g (Taconic Farms) wurden mit Ketamin (150 g/g) und Xylazin (3 g/g) anästhesiert und einem bilateralen Nierenarterienverschluss mit mikrovaskulären Klemmen für 30 Minuten unterzogen, wie in ausführlich beschrieben das Mausprotokoll. Zeitgesteuerte Urinsammlungen wurden nach 3, 6, 9, 12 und 24 h der Reperfusion erhalten, und Blut wurde zur Kreatininmessung zum Zeitpunkt der Tötung (24 h) gesammelt.

Mausmodell einer Cisplatin-induzierten Nierenschädigung

Wir verwendeten gut etablierte Mausmodelle, in denen die strukturellen und funktionellen Folgen der Cisplatin-Verabreichung zuvor dokumentiert wurden (16–18). Kurz gesagt, Mäusen wurde eine einzelne intraperitoneale Injektion von Cisplatin (20 mg/kg Körpergewicht) verabreicht. Dies führt innerhalb von 3 Tagen nach der Cisplatin-Injektion zu Nekrose und Apoptose der Tubuluszellen und zu erhöhtem Harnstoffstickstoff im Blut (16–18). Die Tiere wurden in Stoffwechselkäfigen gehalten und es wurde täglich Urin gesammelt.

RNA-Isolierung

Ganze Nierengewebe von Mäusen (oder kultivierte humane proximale Tubuluszellen; siehe unten) wurden mit einem Tissue Terror (Biospec Products, Racine, WI) aufgeschlossen. Gesamt-RNA aus Kontrollnieren und ischämischen Nieren wurde unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA) isoliert und durch Spektrophotometrie quantifiziert.

Microarray-Verfahren

Ausführliche Beschreibungen von Microarray-Hardware und -Verfahren wurden zuvor veröffentlicht (11). Kurz gesagt, für jedes Experiment wurden 100 g gereinigte Gesamtmaus-Nieren-RNA revers transkribiert mit Superscript II Reverse Transkriptase (Life Technologies, Rockville, MD) in Gegenwart von Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) für Kontrollen und Cy5-dUTP für ischämische Proben. Die cDNA-Proben wurden unter Verwendung eines Microcon YM-50-Filters (Millipore, Madison, WI) gereinigt und mit Microarray-Objektträgern hybridisiert, die 8979 einzigartige Maussonden mit verifizierter Sequenz enthielten (11). Für jede der Reflow-Perioden wurden drei separate Tiere untersucht, und für jedes der Tiere wurden mindestens zwei unabhängige Microarray-Experimente durchgeführt. Die Array-Objektträger wurden unter Verwendung eines Microarray-Scanners (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) gescannt, um separate TIFF-Bilder für Cy3- und Cy5-Fluoreszenz zu erhalten. Die Signalintensitäten für Cy3 und Cy5 wurden für einzelne Gene unter Verwendung der Datenextraktionssoftware GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments) bestimmt. Qualitätskontrolle und Datenanalyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (11).

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Semiquantitative Reverse Transkription – PCR

Eine gleiche Menge (1 plus – g) Gesamt-RNA aus Kontroll- und Versuchsmausnieren wurde mit Superscript II reverser Transkriptase (Life Technologies) in Gegenwart von zufälligen Hexameren gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. Die PCR wurde unter Verwendung eines Kits (Roche, Indianapolis, IN) und der folgenden Primer durchgeführt: Maus-NGAL-Sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', Maus-NGAL-Antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', menschliches NGAL Sense 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3' und Human-NGAL-Antisense 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Primerpaare für Maus- und Human-Actin und Glyceraldehyd-3--Phosphatdehydrogenase (GAPDH) wurden von Clontech (La Jolla, CA) erhalten. Scheinreaktionen ohne cDNA dienten als negative Kontrollen. PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese, gefolgt von Färbung mit Ethidiumbromid, analysiert und durch Densitometrie quantifiziert. Vielfache Änderungen in der NGAL-mRNA-Expression in ischämischen gegenüber Kontrollnieren wurden nach Normalisierung für &agr;-Aktin- oder GAPDH-Amplifikation exprimiert.

Mikroskopie

Für den NGAL-Nachweis wurden gefrorene Schnitte mit {{0}},2 Prozent Triton X-100 in PBS für 10 min permeabilisiert, mit Ziegenserum für 1 h blockiert und mit primärem Antikörper gegen NGAL ( 1:500 Verdünnung) für 1 h. Die Objektträger wurden dann 30 Minuten lang im Dunkeln sekundären Antikörpern ausgesetzt, die mit Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) konjugiert waren, und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiophot), das mit Rhodaminfiltern ausgestattet war, sichtbar gemacht. Für die Kolokalisierung von NGAL mit Rab11 wurden Serienschnitte zuerst mit NGAL-Antikörper oder einem monoklonalen Antikörper gegen Rab11 (1:500-Verdünnung; Transduction Laboratories) inkubiert, dann mit sekundären Antikörpern, die entweder mit Cy5 (für NGAL) oder Cy3 (für Rab11) konjugiert waren ) und mit Rhodamin- bzw. Fluoresceinfiltern sichtbar gemacht. Zur Kolokalisierung von NGAL mit proliferierendem Zellkernantigen (PCNA) wurden Schnitte mit NGAL-Antikörper und einem monoklonalen Antikörper gegen PCNA (1:500 Verdünnung; Upstate) co-inkubiert und der Nachweis erfolgte durch Immunoperoxidase-Färbung (ImmunoCruz Staining System, Santa Cruz Biotechnologie). Für den TUNEL-Assay verwendeten wir das ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (Clontech). Paraffinschnitte wurden mit Xylol und absteigendem Ethanol entparaffiniert, mit 4 % Formaldehyd/PBS für 30 Minuten bei 4 Grad fixiert, mit Proteinase K bei Raumtemperatur für 15 Minuten und 0,2 % Triton X-100/PBS für 15 Minuten permeabilisiert min bei 4 Grad und inkubiert mit einer Mischung aus Nukleotiden und TdT - Enzym für 60 min bei 37 Grad . Die Reaktion wurde mit 2 SSC beendet, und die Schnitte wurden mit PBS gewaschen und mit Crystal/Mount (Biomed, Foster City, CA) fixiert. TUNEL-positive apoptotische Kerne wurden durch Visualisierung mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen.

Urinsammlung

Mäuse oder Ratten wurden in Stoffwechselkäfige (Nalgene, Rochester, NY) gesetzt, und der Urin wurde vor und jede Stunde nach der bilateralen Untersuchung gesammeltNieren-Arterienverschluss. Urinproben wurden bei 5000 g zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und der Überstand wurde durch Western-Blotting analysiert. Kreatinin im Urin wurde mit einem quantitativen kolorimetrischen Testkit (Sigma) gemessen, um Proben für die NGAL-Bestimmung im Urin zu normalisieren. Ein kolorimetrisches Testkit zur Bestimmung von N-Acetyl-D-glucosaminidase (NAG) im Urin wurde von Roche bezogen.

Zellkultur

MenschlichNieren-proximale tubuläre Epithelzellen (RPTEC) wurden von Clonetics (San Diego, CA) erhalten. Zellen wurden eingewachsenNieren-Epithelzellen Basalmedium ergänzt mitNierenEpithelial Cell Growth Medium (REGM)-Komplex ({{0}},5 l/ml Hydrocortison, 10 pg/ml hEGF, 0,5 - g/ml Epinephrin, 6,5 pg/ml Triiodthyronin, 10 plus - g/ml Transferrin, 5 - g/ml Insulin, 1 - g/ml Gentamicinsulfat und 2 % FBS), wie vom Hersteller empfohlen.

Leichter ATP-Mangel kultivierter Zellen

Wir modifizierten zuvor beschriebene Protokolle der In-vitro-Ischämie durch ATP-Verarmung mit Inhibitoren der oxidativen Phosphorylierung (19, 20). Am zweiten Tag nach der Konfluenz wurden RPTEC-Zellen mit 1 ml Antimycin A (Sigma) für unterschiedliche Zeiträume bis zu 6 h inkubiert. Wir haben zuvor gezeigt, dass dies bei anderen Arten von kultivierten Nierenepithelzellen wie MDCK (19) und 786- O (20)-Zellen zu einer leichten teilweisen reversiblen ATP-Verarmung und zu keinem Verlust der Zelllebensfähigkeit führt. Die ATP-Spiegel wurden unter Verwendung eines auf Luciferase basierenden Assay-Kits (Sigma) überwacht und als Prozentsatz der Kontrollwerte ausgedrückt. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der ATP-Verarmung geerntet und auf NGAL-mRNA-Expression durch reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) und NGAL-Proteinexpression durch Western-Analyse analysiert. Die Sekretion von NGAL in das Kulturmedium wurde ebenfalls überwacht.

Andere Materialien und Methoden

Alle Chemikalien wurden von Sigma bezogen, sofern nicht anders angegeben. Für Western-Blotting wurden die Proteinkonzentrationen durch den Bradford-Assay (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt und gleiche Mengen an Gesamtprotein wurden in jede Spur geladen. Monoklonaler Antikörper gegen - --Tubulin (Sigma) wurde mit einer Verdünnung von 1:10 000 zur Bestätigung einer gleichen Proteinbeladung verwendet, und ein polyklonaler Antikörper gegen NGAL wurde mit 1:500 verwendet (21). Monoklonaler Antikörper gegen 2--Mikroglobulin wurde bei 1:500 (Sigma) verwendet. Der Immunnachweis von übertragenen Proteinen wurde unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz (Amersham) erreicht.

Ergebnisse

Charakterisierung der Tiermodelle der frühen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Wir verwendeten Mausmodelle, in denen die strukturellen und funktionellen Folgen von kurzen Perioden renaler Ischämie dokumentiert wurden (11–15). Die charakteristischen histopathologischen Merkmale der ischämischen Verletzung waren in den 24- h Reperfusionsproben sowohl nach einseitiger (45 min) als auch nach bilateraler (30 min) Ischämie leicht ersichtlich. Dazu gehörten ein Verlust von Bürstensaummembranen, tubuläre Dilatation, abgeflachtes tubuläres Epithel, Lumentrümmer und interstitielle Infiltrate (Abbildung 1). Wir dokumentierten das Vorhandensein von apoptotischen Zellen unter Verwendung des TUNEL-Assays. Die Apoptose war überwiegend auf distale tubuläre Zellen und den aufsteigenden Schenkel der Henle-Schleife lokalisiert, sowohl in abgelösten Zellen innerhalb des Lumens als auch in anhaftenden Zellen. Gelegentlich waren auch proximale tubuläre Zellen apoptotisch, aber die Glomeruli waren im Wesentlichen frei von Apoptose. Keine TUNEL-positiven Zellen wurden in den Kontrollnieren oder in den ischämischen Proben nachgewiesen, wo TdT weggelassen wurde (nicht gezeigt). Die obigen histologischen und apoptotischen Veränderungen fehlten bei Nieren, die milderen Ischämiegraden ausgesetzt waren (5, 10 oder 20 min bilaterale Ischämie; nicht gezeigt). Die Serumkreatininspiegel spiegelten die beobachteten histopathologischen Veränderungen wider. So zeigten Mäuse mit einseitiger renaler Ischämie oder leichten Graden subklinischer bilateraler Ischämie Serumkreatininspiegel, die nicht von Kontrolltieren zu unterscheiden waren, wohingegen Mäuse mit bilateraler Ischämie für 30 min eine signifikante Erhöhung des Serumkreatinins zeigten ( 1 ).

Abbildung 1. Charakterisierung des Mausmodells der IschämieNieren-Verletzung. Die linken Tafeln zeigen die Ergebnisse der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (oben) und der TUNEL-Färbung (unten) von Nierenschnitten von Kontrollmäusen oder nach 24 h Ischämie-Reperfusion (IRI). (Rechts) Ergebnisse von Serum-Kreatinin-Bestimmungen in Kontrollmäusen (Con), nach unilateraler Ischämie für 45 min (U45) oder nach bilateraler Ischämie für verschiedene Zeiträume, wie gezeigt. *P 0.05 gegenüber Kontrolle. Zahlen innerhalb von Balken geben eine Anzahl von Tieren an.

NGAL-mRNA wird deutlich in der frühen postischämischen Niere induziert

Durch Microarray-Analyse von Mäusen mit einseitigemNieren-Ischämie wurde festgestellt, dass NGAL durchweg induziert war (3,2 plus - 0,5--fach, 11,1 plus - 1,2--fach und 4,3 plus {{1{{30}) }}}.6-fach nach 3, 12 und 24 h Reperfusion) in der ischämischen Mausniere im Vergleich zu den Kontrollnieren desselben Tieres (Mittelwert plus - SD von drei Tieren zu jedem Zeitpunkt). Dieser Befund wurde durch semiquantitative RT-PCR unter Verwendung eines Normalisierungsprotokolls mit sowohl plus -Actin als auch GAPDH bestätigt. Keine signifikanten Änderungen in der mRNA-Expression von entweder plus-Actin oder GAPDH wurden in irgendeiner der untersuchten Reperfusionsperioden festgestellt, wie zuvor beschrieben (11). Unter Verwendung von Maus-spezifischen Primern entdeckten wir jedoch eine signifikante Hochregulierung der NGAL-mRNA-Expression (4,1 plus -0,5--fach, 9 plus -0,6--fach und 4,2 plus 0,4--fach nach 3, 12 bzw. 24 h Reperfusion, wobei die Werte den Mittelwert plus - Standardabweichung von drei getrennten Tieren darstellen). Diese Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt und stimmen insgesamt mit den durch die Transkriptomanalyse festgestellten Veränderungen überein.

Fig. 2. Induktion von Maus-Nieren-Neutrophilen-Gelatinase-assoziierter Lipocalin (NGAL)-mRNA nach Ischämie. (Oben) Repräsentative reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) mit Primern für Maus-Aktin und NGAL unter Verwendung von RNA, die aus den Nieren von Kontrollmäusen (C) oder nach verschiedenen Reperfusionsperioden wie gezeigt (Stunden) extrahiert wurde. Spur M enthält eine 100-bp-DNA-Leiter. (Unten) Mehrfacher Anstieg der NGAL-mRNA-Expression zu verschiedenen Zeitpunkten von der Kontrolle (CON). Werte, die durch Mikroarray (durchgezogene Linie) gegenüber RT-PCR (gepunktete Linie) erhalten wurden, sind mittlere Standardabweichungen von drei Experimenten zu jedem Zeitpunkt.

NGAL-Protein wird in den proximalen Tubuli früher ischämischer Mäusenieren deutlich überexprimiert

Als nächstes war es von Interesse zu bestimmen, ob die postischämische Expression des NGAL-Proteins in der Niere parallel zu der der mRNA verläuft. Durch Western-Analyse war NGAL gerade als ein 25--kD-immunreaktives Peptid in Kontrollmausnieren nachweisbar. Die Identität dieser Bande als NGAL wurde in einer separaten Reihe von Experimenten festgestellt, wo eine Vorinkubation des primären Antikörpers mit rekombinantem Maus-Lipocalin diese Immunreaktivität vollständig blockierte (nicht gezeigt). In den unilateralen Ischämieexperimenten wurde die NGAL-Expression drei- bis vierfach durch Densitometrie in der ischämischen Niere von fünf verschiedenen Tieren innerhalb von 3 h nach der Verletzung induziert, wie in 3 gezeigt. Diese Reaktion wurde in den bilateralen Ischämieexperimenten von acht verschiedenen Tieren dramatisch verstärkt . NGAL wurde bei diesen Mäusen nach 3 h Reperfusion dreifach induziert, erreichte in den 24--h-Proben einen Höchststand beim 12--fachen und fiel bis zur 72--stündigen Erholungsphase auf normale Werte ab (Abbildung 3). .

Abbildung 3. Induktion des Mausnieren-NGAL-Proteins nach einseitiger oder beidseitiger Ischämie. (Oben) Repräsentative Western Blots mit ganzen Nierenproben, die von Kontrollmäusen (Con) oder nach Reperfusionsperioden wie gezeigt (Stunden) erhalten wurden und mit einem polyklonalen Antikörper gegen NGAL oder einem monoklonalen Antikörper gegen Tubulin sondiert wurden (um eine gleiche Proteinbeladung zu demonstrieren). Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite. (Unten) Anstieg der NGAL-Proteinexpression zu verschiedenen Zeitpunkten gegenüber der Kontrolle (CON). Die durch Densitometrie erhaltenen Werte sind Mittelwerte SD von fünf Tieren für einseitige Ischämie und acht Tieren für zweiseitige Ischämie

Mit immunhistochemischen Techniken haben wir als nächstes gezeigt, dass das NGAL-Protein in Kontrollmausnieren kaum nachweisbar war, aber innerhalb von 3 h nach Ischämie überwiegend in den proximalen Tubuli hochreguliert wird, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Identifizierung der proximalen Tubuli in diesen Abschnitten basierte auf dem Vorhandensein einer Bürste Grenzmembran, das Verhältnis von Kern- zu Zellgröße und Zellmorphologie. Das induzierte NGAL erschien in einer punktförmigen zytoplasmatischen Verteilung innerhalb proximaler Tubuluszellen, was an ein sekretiertes Protein erinnert. Dieses Expressionsmuster war sowohl in unilateralen als auch in bilateralen Modellen der Ischämie-Reperfusionsverletzung identisch und war bei jedem untersuchten Tier durchweg offensichtlich. Die Glomeruli zeigten keine NGAL-Expression, und es waren keine NGAL-exprimierenden Neutrophilen erkennbar. Da gezeigt wurde, dass sich NGAL in kultivierten Wilms-Tumor-Nierenzellen zumindest teilweise mit Endosomen kolokalisiert (21), untersuchten wir in Serienschnitten die Verteilung von NGAL und Rab11 (einem Marker für späte Recycling-Endosomen). Zusammengeführte Bilder zeigten eine signifikante Co-Lokalisierung von NGAL mit Rab11 (Abbildung 4). Um die funktionelle Bedeutung einer verstärkten NGAL-Expression nach Ischämie zu untersuchen, untersuchten wir serielle Nierenschnitte auf NGAL-Expression, TUNEL-positive Kerne oder PCNA-positive Kerne. Während Tubuluszellen, die NGAL überexprimierten, nicht TUNEL-positiv waren (nicht gezeigt), war eine signifikante Kolokalisierung von NGAL und PCNA in den proliferierenden und regenerierenden Zellen während der 48--stündigen Rückflussperiode offensichtlich (Abbildung 4).

Fig. 4. Induktion des Mausnieren-NGAL-Proteins nach Ischämie. (Oben) Repräsentative Ergebnisse der Immunhistochemie an Gefrierschnitten von Mausnieren, die von Kontrollmäusen oder nach unterschiedlichen Reflow-Perioden wie gezeigt (Stunden) erhalten und mit einem polyklonalen Antikörper gegen NGAL sondiert wurden. G, Glomerulus. Das mit HP bezeichnete Feld ist eine 100-plus-Hochleistungsvergrößerung, und die anderen Felder haben eine 20-fache Vergrößerung. (Unten) Die beiden linken Felder zeigen einen Tubulus nach 3 h Reperfusion, der NGAL (rot) oder Rab11 (grün) exprimiert. Das dritte Feld zeigt ein zusammengeführtes Bild, das die Co-Lokalisierung in Gelb anzeigt. Das Feld ganz rechts zeigt die Kolokalisierung von NGAL mit proliferierendem Zellkernantigen in Tubuli nach 48 h Reflow.

NGAL-Protein lässt sich unmittelbar nach Induktion von ARF bei Mäusen leicht im Urin nachweisen

Als nächstes war es von beträchtlichem Interesse, zu bestimmen, ob die postischämische Expression des NGAL-Proteins im Urin nachgewiesen werden konnte, wodurch seine Nützlichkeit als früher nicht-invasiver Biomarker für Ischämie nahegelegt wurdeNieren-Verletzung. Bei Verwendung von Urin-Kreatininkonzentrationen zum Ausgleichen für die Probenbeladung fehlte NGAL im Urin vor der Ischämie. Im auffälligen Gegensatz dazu zeigte sich NGAL als 25--kD-Band innerhalb von 2 h nach der Verletzung (bei der allerersten Urinabgabe nach Ischämie) bei allen untersuchten Tieren (fünf mit unilateraler und acht mit bilateraler Ischämie), wie in gezeigt Fig. 5. Die Identität dieser Bande als NGAL wurde in einer separaten Reihe von Experimenten festgestellt, in denen die Vorinkubation des primären Antikörpers mit rekombinantem Maus-Lipocalin diese Immunreaktivität vollständig blockierte (nicht gezeigt). Bemerkenswerterweise war NGAL in nur 1 l unverarbeitetem Urin durch Western-Analyse leicht nachweisbar und bestand für die gesamte untersuchte Dauer (24 h Reperfusion) fort. Anschließend verglichen wir die NGAL-Ausscheidung im Urin mit der von zuvor etablierten Verletzungsmarkern wie 2--Mikroglobulin und NAG. Während NGAL im Urin innerhalb von 2 h nach Ischämie nachweisbar war, war 2--Mikroglobulin in den gleichen Urinproben erst nach 12 h einseitiger und 8 h bilateraler Ischämie nachweisbar (Abbildung 5). In ähnlicher Weise war die NAG-Ausscheidung im Urin nur nach 12 h unilateraler und 8 h bilateraler Ischämie im Vergleich zu nicht-ischämischen Kontrolltieren signifikant erhöht ( 5 ).

Abbildung 5. Früher Nachweis von NGAL-Protein im Urin von Mäusen mit akuter IschämieNieren-Ausfall (ARF). (Oben) Repräsentative Western Blots von unverarbeiteten Urinproben (1 bis 2 plus – l pro Bahn, normalisiert für den Kreatiningehalt) wurden bei Reperfusionsperioden wie gezeigt (Stunden) nach unilateraler oder bilateraler Reperfusion erhaltenNieren-Arterienklemmung. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. Die Blots wurden mit NGAL (oben) oder {{0}}-Mikroglobulin (Beta2-M; Mitte) sondiert. (Unten) N-Acetyl-D-glucosaminidase (NAG)-Bestimmungen im Urin bei verschiedenen Reperfusionsperioden wie angegeben, von fünf Tieren für einseitige Ischämie und acht Tieren für bilaterale Ischämie. Die Werte sind mittlere SD. *P 0,05 gegenüber der Kontrolle zu jedem Zeitpunkt, ANOVA.

Das NGAL-Protein ist selbst nach leichter renaler Ischämie bei Mäusen leicht im Urin nachweisbar

Um die Sensitivität des NGAL-Nachweises im Urin in Abwesenheit von offenkundigem ARF zu bestimmen, verwendeten wir Protokolle, bei denen getrennte Gruppen von Mäusen nur 5, 10 oder 20 Minuten bilateral ausgesetzt wurdenNieren-Arterienverschluss. Diese Studien wurden entwickelt, um die Ausscheidung von NGAL im Urin nach leichter subklinischer renaler Ischämie zu beurteilen. Das nach 24-stündigem Rückfluss gemessene Serum-Kreatinin lag bei all diesen Mäusen innerhalb der normalen Grenzen (Abbildung 1). Auffallend war, dass NGAL bei diesen Tieren in nur 1 l unverarbeitetem Urin leicht nachgewiesen werden konnte (Abbildung 6), obwohl sein Auftreten im Vergleich zu Tieren mit offener ARF etwas verzögert war. Während eine 30-minütige bilaterale Ischämie zu einer NGAL-Ausscheidung im Urin innerhalb von 2 h führte (Abbildung 5), manifestierte sich also bei Mäusen mit 20 oder 10 min bilateraler Ischämie eine NGAL im Urin nach 4 h und bei Mäusen mit einer 5-minütigen Ischämie wurde NGAL erst nach 6 h ausgeschieden ( Abbildung 6). Somit korreliert das Auftreten von NGAL im Urin mit der Dosis und Dauer der renalen Ischämie.

NGAL-Protein ist im Urin unmittelbar nach Induktion von ARF bei Ratten leicht nachweisbar

Abbildung 6. Nachweis von NGAL-Protein im Urin von Mäusen mit subklinischer renaler Ischämie. Repräsentativer Western Blot von unverarbeiteten Urinproben (1 bis 2 l pro Spur, normalisiert auf Kreatiningehalt), die in Reperfusionsperioden wie gezeigt (Stunden) nach 5, 10 oder 20 Minuten bilateralem Abklemmen der Nierenarterie erhalten wurden. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. Diese Tiere zeigten nach 24 h Reflow ein normales Serumkreatinin.

Da eine Debatte über Artenunterschiede in den Reaktionen auf einen Nierenarterienverschluss besteht (22), untersuchten wir als nächstes das Verhalten von NGAL in einem anderen Tiermodell, nämlich einem gut etablierten Rattenmodell für renale Ischämie-Reperfusionsverletzung. Bei Verwendung von Urin-Kreatininkonzentrationen zum Ausgleichen für die Probenbeladung fehlte NGAL im Urin vor der Ischämie. In deutlichem Gegensatz dazu manifestierte sich NGAL als 25--kD-immunreaktives Peptid innerhalb von 3 h nach der Verletzung (in der allerersten Urinausscheidung nach Ischämie), wie in 7 gezeigt. Im Vergleich dazu war das Serumkreatinin in diesem Modell von Die ischämische Verletzung war nur nach 24 h Reperfusion erhöht (nicht gezeigt). Wiederum war NGAL in 1 l unverarbeitetem Urin nachweisbar und persistierte über die gesamte untersuchte Dauer (24 h Reperfusion).

Abbildung 7. Früher Nachweis von NGAL-Protein im Urin von Ratten mit ischämischem ARF. Repräsentativer Western Blot von unverarbeiteten Urinproben (1 bis 2 l pro Bahn, normalisiert für den Kreatiningehalt), die bei Reperfusionsperioden wie gezeigt (Stunden) nach 30-minütigem bilateralem Abklemmen der Nierenarterie bei Ratten erhalten wurden. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. Diese Tiere zeigten einen signifikanten Anstieg des Serum-Kreatinins nach 24 h Reflow.

NGAL-mRNA wird in kultivierten humanen proximalen Tubuluszellen nach früher leichter Ischämie induziert

Um den Ursprung von NGAL aus ischämischen proximalen Tubuluszellen zu bestätigen, modifizierten wir zuvor beschriebene Protokolle der In-vitro-Ischämie durch ATP-Verarmung in kultivierten humanen proximalen Tubuluszellen (RPTEC). Die Inkubation mit 1- m Antimycin führte zu einer leichten partiellen ATP-Verarmung auf etwa 83 plus 3 Prozent der Kontrolle innerhalb von 1 Stunde, mit einer allmählicheren Abnahme auf etwa 75 plus - 3 Prozent der Kontrolle bis 6 Stunden ( Mean-SD aus vier Experimenten). Es waren keine morphologischen Folgen dieser leichten ATP-Verarmung erkennbar. NGAL-mRNA war gerade in ruhenden Zellen nachweisbar. Nach teilweiser ATP-Verarmung war jedoch eine schnelle und dauerabhängige Induktion von NGAL-mRNA durch RT-PCR offensichtlich, wie in 8 gezeigt.

Das NGAL-Protein lässt sich nach einer frühen Ischämie in vitro leicht im Medium nachweisen

Als nächstes untersuchten wir die NGAL-Proteinexpression in RPTEC-Zellen und dem Kulturmedium nach leichter ATP-Verarmung. NGAL-Protein war in RPTEC-Kontrollzellen nachweisbar, und seine Expression nahm nach ATP-Verarmung in einer dauerabhängigen Weise zu, wie in Abbildung 8 gezeigt. Im Kulturmedium von Kontrollzellen wurde kein NGAL-immunreaktives Protein gefunden, aber NGAL war innerhalb von 1 leicht nachweisbar h leichter ATP-Mangel (Abbildung 8). Weitere Zunahmen der NGAL-Proteinhäufigkeit wurden im Zusammenhang mit der Dauer der ATP-Verarmung festgestellt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das induzierte NGAL-Protein schnell in das Medium sezerniert wird, analog zum schnellen Auftreten von NGAL im Urin nach renaler Ischämie in vivo.

Fig. 8. Induktion von NGAL-mRNA nach Ischämie in vitro. (Oben) Repräsentative RT-PCR mit Primern für humanes NGAL unter Verwendung von RNA, die aus renalen proximalen tubulären Epithelzellen (RPTEC)-Zellen nach verschiedenen Perioden teilweiser ATP-Verarmung wie gezeigt (Stunden) extrahiert wurde. Spur M enthält eine 100--bp-DNA-Leiter. (Mitte) Vielfacher Anstieg der NGAL-mRNA-Expression zu verschiedenen Zeitpunkten von der Kontrolle (0), normalisiert für die Glyceraldehyd-3--phosphatdehydrogenase-Expression. Die gezeigten Werte sind SD-Mittelwerte von drei Experimenten zu jedem Zeitpunkt. (Unten) Repräsentativer Western Blot mit RPTEC-Proben nach verschiedenen Perioden partieller ATP-Verarmung wie gezeigt (Stunden), erhalten aus gleichen Mengen an Zellpellets (Pel) oder dem Kulturmedium (Sup), sondiert mit einem polyklonalen Antikörper gegen NGAL. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite. Die Figur ist repräsentativ für drei getrennte Experimente.

NGAL-Protein lässt sich früh nach Induktion einer durch Cisplatin induzierten Nephrotoxizität leicht im Urin nachweisen

Als nächstes wollten wir bestimmen, ob NGAL im Urin nach anderen Formen einer Verletzung von Tubuluszellen nachgewiesen werden kann. In einem etablierten Mausmodell der Cisplatin-Nephrotoxizität wurde NGAL innerhalb von 1 Tag nach der Cisplatin-Verabreichung leicht im Urin nachgewiesen (Abbildung 9). Im Gegensatz dazu war 2--Mikroglobulin im Urin nach 2 Tagen kaum nachweisbar und konnte bis Tag 4 bis 5 nach Cisplatin nicht zuverlässig nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise war eine erhöhte NAG-Ausscheidung im Urin bis zu den Tagen 4 und 5 nach der Cisplatin-Verabreichung nicht erkennbar (Fig. 9).

Abbildung 9. Früher Nachweis von NGAL-Protein im Urin von Mäusen mit Cisplatin-induzierter Verletzung. (A) Repräsentative Western Blots auf unverarbeiteten Urinproben (1 bis 2 l pro Bahn, normalisiert für den Kreatiningehalt), die an Tagen wie gezeigt nach der Cisplatin-Verabreichung gewonnen und mit Antikörpern gegen 2--Mikroglobulin oder NGAL sondiert wurden. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt. (B) NAG-Bestimmungen im Urin an verschiedenen Tagen nach der Cisplatin-Verabreichung (n 4). Die Werte sind Mittelwerte plus -SD. *P 0.05 gegenüber Tag 0.

Diskussion

Wir verwendeten eine transkriptomweite Abfragestrategie, um Nierengene zu identifizieren, die früh nach renaler Ischämie induziert werden und deren Proteinprodukte als neue Biomarker für ARF dienen könnten. Wir identifizierten sieben Gene, die 10--fach hochreguliert sind, von denen kürzlich berichtet wurde, dass eines (Cyr61) nach renaler Ischämie induziert wird (8). Unerwarteterweise war die Induktion der anderen sechs Transkripte für das ARF-Gebiet neuartig. In dieser Studie haben wir uns entschieden, eines dieser zuvor nicht erkannten Gene, nämlich NGAL, weiter zu charakterisieren.

NGAL gehört zur Lipocalin-Superfamilie von - 20 strukturell verwandten sezernierten Proteinen, von denen angenommen wird, dass sie eine Vielzahl von Liganden innerhalb eines -tonnenkelches transportieren (23). Menschliches NGAL wurde ursprünglich als 25- kD-Protein identifiziert, das kovalent an Gelatinase von menschlichen Neutrophilen gebunden ist, wo es eines der sekundären Granula-Proteine ​​von Neutrophilen darstellt (24, 25). Molekulare Klonierungsstudien haben gezeigt, dass menschliches NGAL dem Maus-24p3-Gen ähnlich ist, das zuerst in Primärkulturen von Mäusenieren identifiziert wurde, die zur Proliferation induziert wurden (26). NGAL wird in anderen menschlichen Geweben, einschließlich der Niere, der Luftröhre, der Lunge, des Magens und des Dickdarms, in sehr geringen Mengen exprimiert (27). Die NGAL-Expression wird in stimulierten Epithelien deutlich induziert. Zum Beispiel ist es in Epithelzellen des Dickdarms in Bereichen mit Entzündungen oder Neoplasien hochreguliert, fehlt jedoch in dazwischenliegenden, unbeteiligten Bereichen oder innerhalb von metastatischen Läsionen (28). NGAL-Konzentrationen sind im Serum von Patienten mit akuten bakteriellen Infektionen (29), im Sputum von Patienten mit Asthma oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (30) und in der Bronchialflüssigkeit der emphysematösen Lunge (31) erhöht. In all diesen Fällen wird postuliert, dass die NGAL-Induktion das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen Entzündungszellen und der Epithelschicht ist, wobei eine Hochregulierung der NGAL-Expression sowohl in Neutrophilen als auch im Epithel offensichtlich ist (28–32).

Eine Hochregulation von NGAL in der reifen Niere wurde bisher nicht beschrieben. Mehrere Beweislinien, die aus unserer Studie gewonnen wurden, legen nahe, dass die nachgewiesene NGAL-Induktion eine neue intrinsische Reaktion der proximalen Tubuluszellen der Niere auf eine ischämische Verletzung darstellt und nicht nur von aktivierten Neutrophilen stammt. Erstens ist die Reaktion extrem schnell, wobei NGAL innerhalb von 2 h nach der Verletzung (bei der allerersten Urinausscheidung nach Nierenarterienverschluss) im Urin erscheint, und die Akkumulation von renalen Neutrophilen in diesem Modell der ischämischen ARF wird normalerweise erstmals nach 4 h festgestellt nach Verletzung (33–35). Zweitens sind die zeitlichen Muster der NGAL-Induktion und der Neutrophilen-Akkumulation unterschiedlich. Die NGAL-mRNA- und -Proteinexpression wurde maximal 12 h nach dem Rückfluss festgestellt, während die Akkumulation von Neutrophilen nach 24 h (33–35) ihren Höhepunkt erreicht. Zu diesem Zeitpunkt hat die NGAL-Expression signifikant abgenommen. Drittens waren keine NGAL-exprimierenden Neutrophilen durch Immunfluoreszenz in den untersuchten Nierenproben nachweisbar (Fig. 4). Viertens und überzeugendsten wurde dokumentiert, dass NGAL-mRNA- und Proteininduktion in kultivierten humanen proximalen Tubuluszellen nach In-vitro-Ischämie auftritt, wobei NGAL innerhalb von 1 h nach ATP-Verarmung in das Kulturmedium sezerniert wird, in einem System, in dem Neutrophile absolut fehlen. Unsere In-vivo-Studien erlauben es uns jedoch nicht, einen gewissen Beitrag der Infiltration von aktivierten Neutrophilen zu der beobachteten NGAL-Hochregulierung vollständig auszuschließen. Tatsächlich ist es möglich, dass die Hochregulierung von NGAL in Nierentubuluszellen durch die lokale Freisetzung von Zytokinen aus Neutrophilen, die früh nach einer ischämischen Verletzung in der Mikrozirkulation eingeschlossen sind, induziert werden kann.

Was ist eine Cistanche? Cistanchebehandeln kannNieren-Verletzung

Eine angemessene Erklärung für die Induktion von NGAL durch stimulierte Epithelien hat gefehlt, und ob NGAL schützend ist oder einer Verletzung nahe kommt oder sogar ein unschuldiger Zuschauer ist, bleibt unklar. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass NGAL zumindest in einer Untergruppe von Zelltypen ein proapoptotisches Molekül darstellen könnte (36–38). In der Maus-pro-B-Lymphozyten-Zelllinie führte der Zytokin-Entzug zu einer deutlichen Induktion von NGAL sowie dem Einsetzen von Apoptose (36, 37). NGAL wurde auch mit Apoptose in reproduktiven Geweben in Verbindung gebracht. Epithelzellen der sich zurückbildenden Brustdrüse und des Uterus exprimieren hohe NGAL-Spiegel, die zeitlich mit einer Periode maximaler Apoptose zusammenfallen (38). Es ist wahrscheinlich, dass NGAL eine Untergruppe von Zellpopulationen reguliert, indem es Apoptose induziert. Stimulierte Epithelien können NGAL hochregulieren, um die Apoptose von infiltrierenden Neutrophilen zu induzieren, wodurch es den residenten Zellen ermöglicht wird, die Verwüstungen der Entzündungsreaktion zu überleben. Alternativ können Epithelzellen diesen Mechanismus nutzen, um ihren eigenen Untergang zu regulieren. Es ist jedoch interessant, in unseren Studien festzustellen, dass die Induktion von NGAL nach der frühen renalen Ischämie-Reperfusionsschädigung überwiegend in proximalen Tubuluszellen auftritt, die keine TUNEL-positiven Kerne zeigten.

Andere neuere Studien haben gezeigt, dass NGAL den epithelialen Phänotyp verstärkt. NGAL wird durch die penetrierende Ureterknospe exprimiert und löst die Nephrogenese aus, indem es die Umwandlung mesenchymaler Zellen in Nierenepithelien stimuliert (21). Von einem anderen Lipocalin, Glycodelin, wurde gezeigt, dass es einen epithelialen Phänotyp induziert, wenn es in menschlichen Brustkrebszellen exprimiert wird (40). Diese Befunde sind besonders relevant für die reife Niere, bei der eine der gut dokumentierten Reaktionen auf eine ischämische Verletzung das bemerkenswerte Auftreten von dedifferenzierten Epithelzellen ist, die die proximalen Tubuli auskleiden (41). Ein wichtiger Aspekt der Nierenregeneration und -reparatur nach einer ischämischen Verletzung beinhaltet die Wiedererlangung des epithelialen Phänotyps, ein Prozess, der mehrere Aspekte der normalen Entwicklung rekapituliert (42). Dies legt nahe, dass NGAL durch den beschädigten Tubulus exprimiert werden kann, um eine Reepithelisierung zu induzieren. Unterstützung für diese Vorstellung ergibt sich aus der kürzlich erfolgten Identifizierung von NGAL als eisentransportierendes Protein, das während der Nephrogenese zu Transferrin komplementär ist (21). Es ist allgemein bekannt, dass die Zufuhr von Eisen in Zellen entscheidend für Zellwachstum und -entwicklung ist, und dies ist vermutlich ebenso entscheidend für die postischämische Nierenregeneration, wie es während der Ontogenese der Fall ist. Da NGAL Eisen zu binden und zu transportieren scheint (21), ist es auch wahrscheinlich, dass NGAL als Senke für Eisen dient, das von beschädigten Epithelzellen des proximalen Tubulus ausgeschieden wird. Da NGAL durch den proximalen Tubulus endozytiert werden kann (K. Mori und J. Barasch, unveröffentlichte Beobachtungen), könnte das Protein potentiell Eisen in lebensfähige Zellen recyceln. Dies könnte Wachstum und Entwicklung stimulieren sowie Eisen, ein reaktives Molekül, von der Stelle der Gewebeverletzung entfernen, wodurch die durch Eisen vermittelte Zytotoxizität begrenzt wird. Unsere Ergebnisse, die eine Kolokalisierung von NGAL in PCNA-positiven regenerierenden und proliferierenden Tubuluszellen zeigen, unterstützen diese Hypothese weiter.

Eine wichtige Implikation unserer Ergebnisse bezieht sich auf die Möglichkeit, dass NGAL ein neuer Urin-Biomarker für eine Ischämie istNieren-Verletzungdas im Vergleich zu anderen beschriebenen Biomarkern gut abschneidet. Das vielleicht am besten untersuchte Beispiel ist das Nierenverletzungsmolekül -1 (KIM-1), ein mutmaßliches Adhäsionsmolekül, das an der Nierenregeneration beteiligt ist (43,44). In einem Rattenmodell der Ischämie-Reperfusionsverletzung wurde festgestellt, dass KIM-1 24 bis 48 h nach dem anfänglichen Insult hochreguliert ist, was es zu einem zuverlässigen, aber etwas späten Marker für tubuläre Zellschädigung macht. Jüngste elegante Studien haben gezeigt, dass KIM-1 in der Nierenbiopsie und im Urin von Patienten mit ischämischer akuter tubulärer Nekrose nachgewiesen werden kann (45). Dieser Nachweis wurde jedoch bei Patienten mit nachgewiesener ischämischer Nierenschädigung dokumentiert, und die Nützlichkeit der KIM-1-Messung im Urin zum Nachweis einer frühen subklinischen Schädigung wurde bisher nicht validiert. In einem anderen neueren Beispiel wurde festgestellt, dass Cyr61 ein sekretiertes Cystein-reiches Protein ist, das 3 bis 6 Stunden nach einer ischämischen Nierenverletzung im Urin nachweisbar ist (8). Dieser Nachweis erforderte jedoch einen Bioaffinitäts-Reinigungsschritt mit Heparin-Sepharose-Kügelchen, und selbst nach einer solchen Reinigung waren mehrere kreuzreagierende Peptide offensichtlich. Im Gegensatz dazu zeigt unsere Studie, dass NGAL leicht und schnell als relativ saubere immunreaktive Peptide in Western Blots mit nur 1 l der allerersten unverarbeiteten Urinausscheidung nach renaler Ischämie sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten nachgewiesen werden konnte. Außerdem war NGAL im Urin selbst nach einer sehr leichten "subklinischen" renalen Ischämie trotz normaler Serumkreatininspiegel offensichtlich. Darüber hinaus ging der NGAL-Nachweis im Urin dem Auftreten herkömmlicher Marker im Urin, einschließlich 2--Mikroglobulin und NAG, weit voraus.

Schließlich ist es erwähnenswert, dass NGAL auch früh nach der Cisplatin-Verabreichung im Urin nachweisbar war, zu einem Zeitpunkt, als andere morphologische und biochemische Indikatoren ausNieren-Verletzungfehlten. Somit kann die Hochregulierung und Urinausscheidung von NGAL eine schnelle Reaktion von Nierentubuluszellen auf eine Vielzahl von Schädigungen darstellen, und der Nachweis von NGAL im Urin kann ein breit anwendbares nichtinvasives klinisches Werkzeug für die frühe Diagnose einer Schädigung von Tubuluszellen darstellen.

Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass NGAL einen neuen, sensitiven, nicht-invasiven Urin-Biomarker für renale Ischämie darstellt. In zukünftigen translationalen Arbeiten wird es wichtig sein, die Expression von NGAL im Urin von Patienten mit leichten und frühen Formen von Ischämie zu untersuchenNieren-Verletzung. Es ist zu hoffen, dass eine solche Früherkennung Kliniker in die Lage versetzen kann, rechtzeitig Interventionsmaßnahmen bei ANI einzuleiten, einem Zustand, der immer noch mit einer düsteren Prognose verbunden ist, für die neue Therapien dringend benötigt werden. Darüber hinaus hofft man auf einen so schnellen und einfachen Nachweis von NGAL im Urin bei Patienten mit subklinischer, subklinischer IschämieNieren-Verletzung(z. B. lebensbedingte Nierentransplantationen, Gefäßoperationen, kardiovaskuläre Ereignisse) oder subklinische nephrotoxische Schäden (z. B. die Verwendung von Kontrastmitteln und Aminoglykosiden) weisen den Arzt darauf hin, Maßnahmen einzuleiten, die darauf abzielen, das Fortschreiten einer offenen ARF zu verhindern.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health/National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases an PD (DK53289, DK52612) und JB (DK55388 und DK58872) unterstützt.

Cistanche tubulosabehandeln kannNierenverletzung

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