Immungenexpression und funktionelle Netzwerke in verschiedenen Lupus-Nephritis-Klassen Ⅰ

ABSTRAKT

Ziel: Erforschung des Nutzens der NanoString-Plattform inaufklärende NiereImmuntranskripte für Lupusnephritis der Klassen III, IV und V (LN) unter Verwendung einer retrospektiven Kohorte vonformalinfixiert, paraffineingebettet(FFPE) Nierenbiopsiegewebe.

Methoden: Die Analyse des Immungentranskripts wurde mit der NanoString nCounter-Plattform an RNA von LN (n=55), dünner Basalmembranerkrankung (TBM) (n=14) und membranöser Nephropathie (MN) (n{ {2}}) FFPENierenbiopsieGewebe. Die LN-Proben bestanden aus einzelnen Biopsien der Klassen III (n=11), IV (n=23) und V (n=21) ohne gemischte Läsionen. Die differenzielle Genexpression wurde mit NanoString nSolver durchgeführt, wobei in R generierte Visualisierungen von Vulkandiagrammen und Heatmaps durchgeführt wurden. Signifikante Transkripte wurden abgefragt, um funktionelle Netzwerke mithilfe von STRING- und Genontogenese-Begriffen zu identifizieren.

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Ergebnisse Im Vergleich zu TBM identifizierten wir 52 signifikant unterschiedlich exprimierte Gene, die allen drei LN-Klassen gemeinsam sind. Die Signalweganalyse zeigte eine Anreicherung der Typ-I-Interferon (IFN)-Signalwege, der Komplement- und MHC-II-Signalwege, wobei die meisten die höchste Expression in LN der Klasse IV zeigten. Unsere LN-Biopsien der Klasse IV zeigten im Vergleich zu LN-Biopsien der Klasse V auch eine signifikante Hochregulierung der NF-κB-Signalübertragung und immunologischen Anreicherung. Transkripte des Typ-I-IFN-Signalwegs unterschieden LN der Klasse V von MN.

Schlussfolgerung: Unsere transkriptomische Analyse des gesamten Nierenabschnitts lieferte Einblicke in das molekulare Profil von LN der Klassen III, IV und V. Die Daten hoben wichtige Pfade hervor, die allen drei Klassen gemeinsam sind, und Pfade, die in unseren LN-Biopsien der Klasse IV angereichert wurden. Die Möglichkeit, molekulare Signalwege bei LN mithilfe von FFPE-Gesamtbiopsieschnitten aufzudecken, könnte bei der Behandlungsauswahl für LN von klinischem Nutzen sein.

EINFÜHRUNG

Lupusnephritis(LN) ist eine wichtige Manifestation systemischerLupus erythematodes(SLE) und entwickelt sich bei etwa 40 % der Patienten.1 Seine Prävalenz wird vom Alter (höher bei SLE, das im Kindesalter auftritt) und der ethnischen Zugehörigkeit (höher bei nichtkaukasischen Patienten) beeinflusst und ist umgekehrt mit dem sozioökonomischen Status verbunden.2 DieNierenbiopsieist ein wichtiger Teil der Behandlung von LN3 4 und es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die in der Biopsie beobachteten Veränderungen mit Pathogenese, Behandlungsauswahl und Prognose in Zusammenhang zu bringen.1 Entscheidend hierfür war die Entwicklung eines LN-Klassifizierungssystems, das dies berücksichtigt standardisierte Definitionen von Biopsieläsionen, um die Variabilität zwischen den Berichten zu verringern.

Die Konsensklassifizierung von LN5 durch die International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) aus dem Jahr 2003 beschrieb sechs Klassen: minimale mesangiale LN (Klasse I); mesangial proliferativer LN (Klasse II); fokaler LN (Klasse III); diffuse LN, die weiter in diffuse segmentale (Klasse IV-S) und diffuse globale (Klasse IV-G) proliferative LN unterteilt werden könnte; membranöser LN (Klasse V) und fortgeschrittener sklerosierender LN (Klasse VI). Bei der Beschreibung der Klassen III und IV wurden auch aktive (A, z. B. endokapilläre Hyperzellularität, fibrinoide Nekrose, zelluläre und mikrozelluläre Halbmonde) und chronische (C, z. B. glomeruläre Sklerose, fibröse Halbmonde) glomeruläre Läsionen definiert und bezeichnet. Klasse IV-G (A) beschrieb beispielsweise diffuse global proliferative LN mit aktiven Läsionen. Es wurde eine Aktualisierung dieser Klassifizierung vorgeschlagen.6 Zu den Empfehlungen gehörte die Streichung der Unterteilungen der Klassen IV-S und IV-G, da diese keinen Einfluss auf das Ergebnis haben. In einer Metaanalyse das Auftreten von beidemNierenerkrankung im EndstadiumoderVerdoppelung des Serumkreatininsunterschied sich nicht zwischen den Klassen IV-S und IV-G.7 Es wurde außerdem vorgeschlagen, die aktiven und chronischen Deskriptoren durch Aktivitäts- und Chronizitätsindizes zu ersetzen, die aus dem Lupus-Aktivitäts- und Bewertungssystem des NIH abgeleitet sind8 und so eine quantitative Bewertung der Aktivität zu ermöglichen (a Score von 0 bis 24) und Chronizität (ein Score von 0 bis 12).

Die LN-Klasse ist für die Information des Managements von entscheidender Bedeutung.3 Eine Immunsuppression wird bei aktiven LN der Klassen III und IV empfohlen, nicht jedoch bei LN der Klasse II. Die Entscheidung, eine Immunsuppression bei LN der Klasse V einzuleiten, wird vom Grad der Proteinurie und ihrer Reaktion auf die Renin-Angiotensin-Aldosteron-Blockade beeinflusst. Gelingt es nicht, die Proteinurie 12 Monate nach der Behandlung zu kontrollieren, ist dies mit dem Fortschreiten einer chronischen Nierenerkrankung verbunden9–11 Daher besteht das Behandlungsziel darin, die Proteinurie zu reduzieren und ein vollständiges klinisches Ansprechen anzustreben (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Die LN-Klasse allein ist weniger robust bei der Information über Ergebnisse, weilRisikofaktoren für die Entwicklung einer chronischen Nierenerkrankungenthaltenklinische Merkmaleund weil sie histologische Merkmale umfassen, die nicht von den LN-Klassendefinitionen erfasst werden. Dazu gehören der Grad der interstitiellen Fibrose und tubulären Atrophie (IFTA) sowie spezifische glomeruläre Läsionen wie fibrinoide Nekrose und fibröse Halbmonde.12 Die Quantifizierung ausgewählter und genau definierter einzelner Nierenläsionen kann die Prognose beeinflussen. Dies zeigt sich deutlich bei der IgA-Nephropathie, bei der die Bewertung der mesangialen Zellularität, der endokapillären Hyperzellularität, der segmentalen Sklerose, der tubulären Atrophie, der interstitiellen Fibrose und der Halbmonde zur Bildung des MEST-C-Scores nachweislich die Risikovorhersage unterstützt.13–15 Die vorgeschlagenen Überarbeitungen der ISN Die /RPS 2003-Konsensklassifizierung von LN könnte diese Defizite beheben6, basiert jedoch immer noch auf der Verwendung der Morphologie. Folglich besteht die Notwendigkeit, die molekularen Pfade in LN-Biopsien zu untersuchen und zu verstehen, wie diese mit LN-Klassen16 17 und Behandlungsergebnissen zusammenhängen.18 19 Im Hinblick auf den klinischen Nutzen ist die transkriptomische Analyse von Nierenbiopsien am wichtigsten Fortschritte bei der Diagnose einer Antikörper-vermittelten Nierenabstoßung, bei der eine erhöhte Expression von Gentranskripten im Biopsiegewebe bis zur Validierung zu den validierten morphologischen Kriterien hinzugefügt wurde.20 Bestimmung des Nutzens der Verwendung transkriptomischer Daten zur Verbesserung des klinischen Nutzens der Niere Biopsie bei SLE verwendeten wir die NanoString-Technologie, um die Expression von 750 immun- und entzündungsbedingten Transkripten in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Schnitten von 55 LN-Biopsien, 14 Biopsien mit einer Erkrankung der dünnen Basalmembran (TBM) und 9 Biopsien mit zu untersuchen Membranöse Nephropathie (MN).

METHODEN

Proben: FFPE-Nierenbiopsiegewebe wurde aus archivierten LN-, TBM- und MN-Proben gewonnen, die für die klinische Verwendung überzählig waren und bei denen ausreichend Gewebe für die Analyse verfügbar war. Lupusbiopsien mit gemischten Läsionen oder erheblicher Narbenbildung wurden ausgeschlossen. TBM wurde als Krankheitsbekämpfung eingesetzt, da keine normalen Nierenbiopsien verfügbar waren. Klinische Parameter wurden retrospektiv aus den Gesundheitsakten erfasst. Die Interferon (IFN)-Score-Matrix wurde wie zuvor berichtet erhalten.21 Die vollständige Reaktion wurde als Urin-Protein/Kreatinin-Verhältnis (uPCR) von definiert<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20 % 1 Jahr nach der Biopsie. Eine teilweise Reaktion wurde als uPCR definiert<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

RNA-Extraktion

Aus jedem FFPE-Block wurden sechs 10 μm dicke Gesamtgewebeschnitte mit einem Mikrotom gewonnen, nachdem zwei 4 μm-Schnitte entfernt wurden. Um eine Kreuzkontamination zu verhindern, wurde die Ausrüstung zwischen den Proben mit RNase Away gereinigt und für jede Probe wurde eine neue Klinge verwendet. Die RNA-Isolierung des gesamten Gewebes wurde am selben Tag mit dem RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Nr. 73504) durchgeführt und die RNA-Konzentration wurde mit dem NanoDrop ND1000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; Online-Ergänzungsdaten S1) bewertet.

Transkriptomanalyse

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >das Doppelte (Mittelwert +2 SD) der negativen Kontrollsonden. Die Zählungen wurden auf das geometrische Mittel von 10 Housekeeping-Genen (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB und ZC3H14) normalisiert, die so ausgewählt wurden, dass sie in allen Probentypen exprimiert wurden. Die normalisierten Zählwerte für alle Proben sind in den Online-Zusatzdaten S2 aufgeführt.

statistische Analyse

Die differenzielle Genexpression (DGE) wurde mit dem Solver Advanced Analysis (V.4) Fast/Approxi mate-Algorithmus durchgeführt, der das vereinfachte negative Binomialmodell für alle Sonden verwendet, außer wenn der Algorithmus nicht konvergiert und die lineare Regressionsmethode verwendet wird. Als unabhängige Variablen wurden LN, MN oder die LN-Klasse (III, IV und V) und TBM als unsere Referenzgruppe verwendet. Der Schwellenwert wurde auf 100 und die Beobachtungshäufigkeit innerhalb der Stichproben auf 8 % festgelegt; Der P-Wert wurde mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst, wobei der Schwellenwert für falsche Entdeckungen auf 0,05 festgelegt wurde. Vulkandiagramme wurden mit dem Enhanced Volcano-Paket (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) in R.22 erstellt. Die Visualisierung des funktionellen Proteinassoziationsnetzwerks wurde mit der STRING-Datenbank (https://string-db.org/) durchgeführt. , unter Verwendung des gesamten STRING-Netzwerks. Netzwerkkanten wurden durch Konfidenz definiert und Interaktionen wurden auf den höchsten Konfidenz-Interaktionswert (größer oder gleich 0,9) festgelegt. Getrennte Knoten innerhalb von Netzwerken wurden nicht angezeigt. Signifikante differenziell exprimierte Gene wurden im Hinblick auf die Anreicherung von Begriffen der Genontologie (GO) (biologische Prozesse, molekulare Funktionen, zelluläre Komponente), Reaktompfaden und lokalen STRING-Netzwerkclustern bewertet. Visuelle Interaktionsnetzwerke wurden mit funktionellen Anreicherungen in GO-Begriffen (biologische Prozesse) und STRING-Analyse generiert. Das flächenproportionale Venn-Diagramm überlappender differentiell exprimierter Gene zwischen LN-Unterklassen wurde mit BioVenn (www.biovenn. nl) erstellt.23 Daten aus fortschrittlicher Analyse-Solver-Software wurden in die R-Statistikumgebung eingelesen und die Datenvisualisierung erfolgte mithilfe von Boxplots, Hauptkomponentenanalyse, Vulkandiagramme und Heatmaps. Heatmaps wurden mithilfe von Z-Scores normalisierter Zählungen und Pheatmaps in R erstellt. Cluster wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests analysiert. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine Varianzanalyse mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak verwendet. Die Daten wurden mit GraphPad Prism (V.8.0) analysiert.

Erklärung zur Patienten- und Öffentlichkeitsbeteiligung (PPI).

Diese Studie war Teil des MASTERPLANS-Konsortiums und Patientenmitarbeiter waren an jedem Arbeitsstrang, einschließlich dieser Studie, beteiligt. PPI hat ein Glossar mit Begriffen erstellt, um eine weitere Einbindung der breiteren Patientengemeinschaft zu ermöglichen, und Forschungsergebnisse wurden an Laienbegutachtungstagen berücksichtigt. Laienrezensionen von Veröffentlichungen werden auf der MASTERPLANS-Website (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans) geteilt.

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