Immunbezogene Genexpression in den Nieren und Milzen von Gänschen, die mit Goose Nephritic Astrovirus infiziert sind

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ABSTRAKTDas Goose Nephritic Astrovirus (GNAstV) wurde erstmals 2018 isoliert und verursachte der Gänseindustrie große wirtschaftliche Verluste. Über den Gastgeber ist jedoch wenig bekanntImmunreaktionzur GNAstV-Infektion. In dieser Studie wurden vierzig {{0}} Tage alte Gänschen nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen eingeteilt: Infektions- und Negativkontrollgruppe. Jedes Gänschen in der Infektionsgruppe wurde intramuskulär mit 0,5 ml GNAstV-JSHA herausgefordert, während das Gänschen in der negativen Kontrollgruppe mit der gleichen Menge PBS geimpft wurde. Histopathologische Veränderungen und Viruslokalisation imMilzundNierewurden untersucht und die Expression immunbezogener Gene 7 und 14 Tage nach der Infektion mittels qPCR bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine GNAstV-Infektion eine Degeneration und Nekrose von Milz-Lymphozyten und Nierenepithelzellen verursachte und diese Zellen positiv für das Virus waren. Darüber hinaus induzierte die GNAstV-Infektion die Aktivierung von Mustererkennungsrezeptoren (RIG-I, MDA-5 und TLR3) und wichtigen Adaptermolekülen

(MyD88, MAVS und IRF7) in Milz und Niere und regulierten die Genexpression von Interferon in der Milz und von antiviralen Proteinen (MX1, OASL und IFITM3) in Milz und Niere hoch. Darüber hinaus wurden hohe Expressionsniveaus von Interleukin(IL)-1 und IL-8 in der Milz und iNOS in Milz und Niere gefunden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GNAstV-Infektion die angeborene Immunantwort des Wirts aktivierte. Darüber hinaus erhöhte die GNAstV-Infektion die Expressionsniveaus von CD8t, MHCI und MHCII, was darauf hinweist, dass eine adaptive Immunantwort aktiviert wurde. Außerdem wurde TGF- in Milz und Niere stark exprimiert, was eine Immunumgehungsstrategie von GNAstV sein könnte, um eine Infektion zu verursachen. Interessanterweise waren sowohl IL-1- als auch IL-6-mRNA-Spiegel in der Niere verringert, was helfen kann, Nierenläsionen zu reduzieren. Dies ist die erste Studie, die über Veränderungen der immunbezogenen Genexpression als Reaktion auf eine GNAstV-Infektion berichtet, und unsere Ergebnisse geben Einblicke in die virale Pathogenese.

Schlüsselwörter: nephritisches Astrovirus der Gans, Immunantwort, Milz, Niere, Gänseküken

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EINLEITUNG

Seit 2017 kam es in Ostchina in mehreren Gänseherden zu einem schweren Gichtausbruch bei 4- bis 16- Eintagsgänschen, was zu großen wirtschaftlichen Verlusten in der Gänseindustrie führte. Die infizierten Gänschen zeigten ein verringertes Körpergewicht und geschwollene und blasse Nieren mit weißem Urat in den Harnleitern und einer Uratdisposition auf der Oberfläche der Eingeweideorgane und der Gelenkhöhle. Im Jahr 2018 wurde ein neues Gänseestrovirus aus den infizierten Gänseküken isoliert, und Tierversuche zur Fortpflanzung bewiesen, dass es der Hauptverursacher der Gichtkrankheit war. Dieses Virus war genetisch verschieden von dem bekannten Mam-Astrovirus und Astrovirus. Es bildete gemäß der Aminosäuresequenz des ORF2-Proteins voller Länge (Kapsidprotein), das die variabelste Region des Genoms ist, eine eigene Klade. Daher sollte den Schäden, die Gänschen durch das Virus zugefügt werden, mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. In der vorliegenden Studie wird das neue Gänseestrovirus als nephritisches Gänse-Astrovirus (GNAstV) bezeichnet.

Da es sich bei GNAstV um ein neu auftretendes Virus handelt, konzentrierten sich die meisten Studien auf seine Isolierung, genetische Analyse und die Etablierung diagnostischer Methoden (Yuan et al., 2018; Wan et al., 2019; Yin et al., 2020). Über die Immunantwort des Wirts auf eine GNAstV-Infektion ist jedoch wenig bekannt. Das nephritische Astrovirus der Gans verursacht hauptsächlich Schäden an Niere, Leber und Milz bei Gänseküken, und in Niere und Milz wurde im Vergleich zu anderen Organen eine höhere Viruslast festgestellt (Jin et al., 2018; Xu et al., 2019). Milzläsionen und eine hohe Viruslast weisen darauf hin, dass das Virus die Immunantwort schädigen kann. Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle während einer Virusinfektion, indem es als erste Verteidigungslinie gegen eine Virusinvasion dient (Chow J et al., 2015). Mustererkennungsrezeptoren (PRR) erkennen virale Nukleinsäuren und lösen eine angeborene Reaktion aus, einschließlich der Produktion von Zytokinen wie I-1 , TNF-x und IFN und antiviralen Proteinen wie OASL, IFITM3 und MX1. Der membrangebundene Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3) und die zytosolischen RIG-I-like-Rezeptoren, die hauptsächlich RIG-1 und MDA-5 enthalten, sind die wichtigsten PRR, die virale RNA erkennen. Die angeborene Immunantwort induziert Signale, um die adaptive Immunantwort hervorzurufen, die die Virusinfektion in einer nachfolgenden Infektionsphase kontrolliert. Das adaptive Immunsystem schließt die Antikörper-vermittelte/B-Zell-Antwort I-Antwort und die zellvermittelte Antwort ein, die die Beteiligung von CD3 plus -, CD4 plus -, CD8 plus - und MHC-Klasse-I- und -II-Molekülen erfordern. Derzeit sind die Mechanismen, durch die GNAstV die angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts beeinflusst, unklar. China ist die Heimat der höchsten Gänsepopulation weltweit; Daher ist die Untersuchung der Immunantwort der Gänse auf eine GNAstV-Infektion wichtig, um den Mechanismus der Pathogenität und Immunität von GNAstV aufzuklären und seine Ausbreitung zu kontrollieren. In dieser Studie wurden 2-Eintagsküken mit GNAstV infiziert. Anschließend wurden die histopathologischen Veränderungen und die Viruslokalisation sowie die immunvermittelte Genexpression in Milz und Niere untersucht.

MATERIALEN UND METHODEN

Ethik-Erklärung

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für Versuchstiere des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (Peking, China) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nanjing Agricultural University genehmigt.

Virus

Das GNAstV-JSHA-Isolat (GenBank-Zugangsnr. MK125058) wurde aus an Gicht erkrankten Gänschen (Provinz Jiangsu, China) isoliert und in unserem Labor gehalten. Der Titer des GAstV-JSHA betrug 1 × 104,25 50 Prozent Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50)/ml, bestimmt durch Titration an Gänsenieren-Epithelzellen gemäß der Methode von Reed & Muench.

Tierversuch

Die Milz- und Nierenproben stammen aus unserem vorherigen Tierversuch, der in Xus Studie beschrieben wurde (Xuet al.,2019). Kurz gesagt, 2-40 Tage alte Gänseküken ohne GNAstV-Infektion wurden nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen aufgeteilt: Infektions- und Negativkontrollgruppen. Jedes Gänschen in der Infektionsgruppe wurde mit 0,5 ml GNAstV-JSHA durch intramuskuläre Inokulation herausgefordert, während das Gänschen in der Negativkontrollgruppe mit der gleichen Menge PBS geimpft wurde.

Alle Gänseküken wurden täglich auf klinische Anzeichen überwacht. 7 Tage nach der Infektion (dpi) wurden 10 Gänschen aus jeder Gruppe eingeschläfert und die groben Veränderungen wurden untersucht, und dann wurden die Niere und die Milz entnommen. Ein Teil dieser Probleme wurde zur histopathologischen Untersuchung in 10-prozentigem Formaldehyd fixiert, der Rest wurde für weitere Experimente bei -80 Grad gelagert. Bei 14 dpi wurden die überlebenden Gänseküken eingeschläfert und Gewebe wurden gesammelt und wie oben erwähnt gelagert.

Histopathologische Untersuchung

Die fixierten Proben wurden durch eine Reihe von Alkoholen dehydriert, in Xylol geklärt und in Paraffin eingebettet. Dann wurden die Proben seriell in 4-μm-Schnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin durch Routineverfahren gefärbt. Gefärbte Schnitte wurden mit einem Lichtmikroskop untersucht.

Erkennung des Virusstandorts durch In-situ-Hybridisierung

Das in situ-Hybridisierungs(FISH)-Verfahren wurde gemäß den Anweisungen des kommerziellen ISH-Kits (Boster, China) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Vor der Durchführung der ISH wurden die Sensitivität und Spezifität der Probe getestet und durch eine Reihe von Vorbehandlungen optimiert. Kurz gesagt, entparaffinierte Gewebeschnitte wurden mit HCl (0,2 M, 15 min) und Proteinase K (40 ug/ml, 20 min, 37 Grad) vorbehandelt. Protease K wurde durch 5-minütige Fixierung in 4 % Paraformaldehyd gehemmt. Dann wurden die Hybridisierungs- und Nachhybridisierungsschritte durchgeführt. Sonden wurden dem Hybridisierungspuffer in einer Konzentration von 0,5-2 ug/ml zugesetzt; der die Sonden enthaltende Puffer wurde 10 min lang bei 98 Grad denaturiert und sofort auf Eis gekühlt. Ungefähr 20 μl der Hybridisierungsmischung wurden auf Gewebeschnitte pipettiert, mit Diethylpyrocarbonat-behandelten Deckgläsern bedeckt und für 16 bis 20 h bei 42 Grad inkubiert. Sonden, die mit viraler RNA hybridisiert hatten, wurden unter Verwendung eines an 3,3-N-Diaminobenzidintetrahydrochlorid konjugierten Anti-DIG-Antikörpers nachgewiesen. Die Objektträger wurden mit Methylgrün gegengefärbt und mit neutralem Gummi versiegelt. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, wurde Proteinase K verwendet, um die Gewebepermeabilität zu erhöhen, um den Eintritt von Sonden in das Gewebe zu erleichtern.

Immungenanalyse durch quantitative Real-Time-PCR

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Trizol (Invitrogen, CA) extrahiert, und die reverse Transkription der RNA wurde unter Verwendung des HiScript Q RT SuperMix-Kits (Vazyme, China) durchgeführt. Für die quantitative PCR wurde ein Thermocycler (AB7300; Life Technologies) verwendet. Die Primer 5.0-Software wurde für die Bezeichnung der immunbezogenen Gene verwendet, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Ribonukleinsäure-Expression wurde durch Quantifizierung von GAPDH als Haushaltsgen normalisiert. Relative Transkriptspiegel wurden nach der Methode unter Verwendung des 2-AACT analysiert

Statistische Analyse

Die Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe wurden durch den Student-t-Test analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistical="" significance="" compared="" with="" the="" control="" group,="" and="">< 0.01="" was="" considered="" to="" indicate="" a="" high="" degree="" of="" significance="" compared="" with="" the="" control="">

ERGEBNISSE

Klinische Veränderungen

Bei der nicht geimpften Kontrolle wurden kein Tod oder offensichtliche klinische Anzeichen beobachtet. Allerdings starben 5 der 20 infizierten Gänschen während des Experiments, und bei den GNAstV-infizierten Gänschen wurde eine Verringerung des Körpergewichts beobachtet. Bei der Autopsie erschienen die Organe in der negativen Kontrollgruppe normal, aber bei toten Gänseküken wurde eine Harnstoffdisposition auf der Oberfläche der Organe (Leber, Herz und Niere), der Gallensäcke und der Gelenkhöhle festgestellt. Außerdem wurden bei allen infizierten Gänschen geschwollene und blasse Nieren mit weißem Urat in den Harnleitern beobachtet. Die pathologischen Veränderungen wurden in unserer vorherigen Studie (Xu et al..2019) gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass wir erfolgreich ein Tiermodell der GNAstV-Infektion bei Gänschen etabliert haben.

Histopathologische Veränderungen in Niere und Milz

Bei der histopathologischen Untersuchung erschienen die Nieren und Milzen der Gänseküken der Negativkontrolle histologisch normal ( 1A und 1B ). Jedoch Degeneration und Nekrose von Nierenepithelzellen undentzündlichZellinfiltration wurde in den Nieren infizierter Gänschen beobachtet (Abbildung 1C). Außerdem MilznekroseLymphozytenund entzündliche Zellinfiltration wurden auch in der Milz gefunden (Abbildung 1D).

Viruslokalisation in Niere und Milz

Die Lokalisation des nephritischen Astrovirus der Gans in den Nieren und der Milz wurde unter Verwendung von ISH untersucht. Wie in 2 gezeigt, wurden mehrere braune Partikel im Zytoplasma von tubulären Epithelzellen der Niere nachgewiesen, aber keine braunen Partikel wurden in den Glomeruli der Niere beobachtet. In den Milzlymphozyten und Makrophagenzellen der Milz wurden wenige braune Partikel nachgewiesen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GNAstV renale tubuläre Epithelzellen und Milz-Lymphozyten infizieren kann.

Expression von PRR und Adaptermolekülen in Milz und Niere von GNAstV-infizierten GänsekükenIRF7) in Milz und Nieren wurden durch qPCR bestimmt, wie in Abbildung 3 gezeigt. Der mRNA-Level der 3 PRR in der Milz war in der infizierten Gruppe bei 7 und 14 dpi signifikant erhöht im Vergleich zur Negativkontrollgruppe (P<0.05). the="" rig-1="" and="" tlr3="" mrna="" levels="" in="" the="" kidneys="" were="" also="" increased="" in="" the="" infected="" group="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" compared="" with="" that="" in="" the="" negative="" control="">< 0.01).="" the="" mda-5="" mrna="" level="" was="" higher="" in="" the="" infected="" group="" at="" 14="" dpi,="" but="" no="" difference="" in="" mda-5="" mrna="" expression="" was="" observed="" between="" the="" infected="" and="" negative="" control="" groups="" at="" 7="" dpi(p="">0.05). Dementsprechend war die Expression der Adaptermoleküle in der infizierten Gruppe bei 7 und 14 dpi signifikant höher als in der Kontrollgruppe (P<0.05). these="" results="" indicate="" that="" gnastv="" infection="" activates="" the="" host's="" innate="" immune="">

Zytokinexpression in der Milz und Niere von GNAstV-infizierten Gänschen

Die Ausdrücke der Zytokine, IL-1, I-6, IL-8, Ⅱ-10, TGF-B und iNOS wurden durch qPCR bestimmt, wie in Abbildung 4 gezeigt. In der Milz liegen die mRNA-Spiegel von IL-1B und TGF-B in der Infektionsgruppe bei 7 und 14dpi waren offensichtlich höher als in der Negativkontrollgruppe (P<0.01). furthermore,="" the="" i-8="" and="" inos="" mrna="" levels="" in="" the="" infection="" group="" at="" 14="" dpi="" were="" higher="">< 0.05).="" but="" no="" differences="" in="" the="" levels="" were="" observed="" between="" the="" infection="" and="" negative="" control="" groups="" at="" 7="" dpi(p=""> 0.05). Moreover, no difference in I-6 mRNA expression at 7 and 14 dpi was observed between the infection and control groups(P>0.05). In den Nieren waren die mRNA-Spiegel von I-1 bei 7 und 14 dpi und I-6 bei 7 dpi in der Infektionsgruppe niedriger als in der Negativkontrollgruppe (P< 0.05),="" whereas="" the="" tgf-b="" and="" inos="" mrna="" levels="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" and="" the="" i-8="" mrna="" level="" at="" 14="" dpi="" were="" higher="" in="" the="" infection="" group="" than="" those="" in="" the="" negative="" control="" group=""><0.05). no="" difference="" in="" i-10="" expression="" was="" detected="" between="" the="" infection="" and="" control="" groups(p="">0.05).

Expression antiviraler Proteine ​​in Milz und Niere von GNAstV-infizierten Gänschen

Der mRNA-Spiegel von IFN-d. in der Milz und die Expression von antiviralen Proteinen (OASL, IFITM3. und MIX1) in der Niere und Milz wurden wie in Abbildung 5 gezeigt bestimmt. In der Milz wurden die mRNA-Spiegel vonIFN-2. OASL, IFITM3 und MX1 bei 7 und 14 dpi waren in der infizierten Gruppe signifikant höher als in der negativen Kontrollgruppe (P< 0.05).="" in="" the="" kidney,="" the="" mrna="" levels="" of="" oasl,="" ifitm3,="" and="" mx1="" at="" 14="" dpi="" were="" obviously="" higher="" in="" the="" infected="" group="" than="" in="" the="" negative="" control="" group=""><0.05); however,="" no="" significant="" differences="" in="" levels="" were="" observed="" between="" the="" infection="" and="" negative="" control="" group="" at="" 7="" dpi(p="">0.05).

Expression von CD4t, CD8 plus und MHC-Klasse- und I-Molekülen in der Milz von GNAstV-infizierten Gänschen

Die Expression von Genen, die mit der Antigenpräsentation (CD4', CD8', MHC-Moleküle der Klassen I und II) in der Milz assoziiert sind, wurde durch qPCR bestimmt, wie in Abbildung 6 gezeigt. Die Expressionsniveaus von MHC I bei 7 und 14dpi waren in der infizierten Gruppe signifikant höher als in der negativen Kontrollgruppe (P < 0,05).="" die="" expressionsniveaus="" von="" mhc="" ii="" bei="" 14="" dpi="" waren="" in="" der="" infizierten="" gruppe="" offensichtlich="" höher="" als="" in="" der="" negativkontrollgruppe=""><0.05); however,="" no="" difference="" in="" levels="" was="" observed="" between="" the="" 2="" groups="" at="" 7="" dpi(p="">0.05). Die CD8 plus mRNA-Spiegel bei 7 und 14 dpi waren in der infizierten Gruppe signifikant höher als in der negativen Kontrollgruppe (P< 0.05).="" but="" no="" changes="" in="" cd4+mrna="" levels="" at="" 7="" and="" 14="" dpi="" were="" found="" between="" the="" 2="" groups="" (p="">0.05).

DISKUSSION

Goose nephritic astrovirus ist ein neu isoliertes Virus, das viszerale Gicht und den Tod von Gänseküken verursachen kann, was zu großen Schäden an Gänseherden führt. Bis heute gibt es keine Impfstoffe und Therapeutika für seine Behandlung. Daher ist es notwendig, die Immunantwort des Wirts auf das Virus zu untersuchen, um seine Pathogenese zu verstehen und Impfstoffe und Therapien zu entwickeln. In dieser Studie etablierten wir erfolgreich ein Tiermodell in Gänschen durch intramuskuläre Impfung mit GNAst V-JSHA. Die Lokalisierung des Virus in Lymphozyten und Makrophagen der Milz und die Nekrose von Lymphozyten der Milz weisen darauf hin, dass GNAstV die Milz infizieren und das Immunsystem des Wirts schädigen kann. Bisher liegen jedoch keine Berichte über die immunologische Reaktion von mit GNAstV infizierten Gänseküken vor. Außerdem wurde ein hoher Virustiter in den Nierenepithelzellen beobachtet. und dies kann zu Nierenschäden und Störungen der Harnsäureausscheidung beitragen.

Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen ein eindringendes Pathogen. In unserer Studie verursachte eine GNAstV-Infektion einen Anstieg von TLR3. RIG-1- und MIDA-5-mRNA-Expression in Milz und Niere, was darauf hindeutet, dass das angeborene Immunsystem aktiviert wurde, was möglicherweise zur Hemmung der Virusinvasion beiträgt, die Hochregulierung wichtiger Adaptermoleküle (MyD88 und IRF7 ) bestätigten diese Ergebnisse weiter. IFN wird nach der Aktivierung von PRR produziert, die durch die Induktion mehrerer IFN-stimulierter Gene, deren Produkte eine direkte antivirale Aktivität aufweisen, eine entscheidende Rolle bei der Virussuppression spielen. In unserer Studie war die Expression von IFN-z in der Milz und die Expression von antiviralen Proteinen (OASL, MX1 und IFITM3) in Milz und Niere nach einer GNAstrV-Infektion erhöht. Eine erhöhte Produktion antiviraler Proteine ​​kann für die Hemmung der Virusinvasion nützlich sein. Dementsprechend zeigten unsere Ergebnisse, dass TLR3.RIG-1. MDA-5 und IRF7 wurden während einer GNAstV-Infektion aktiviert. Eine frühere Studie hat auch gezeigt, dass die Art des Systems die menschliche Astrovirus-Replikation in vitro und in vivo begrenzt und Schutz vor Astrovirus-induzierter Barrierepermeabilität bietet (Marvin et al., 2015). Die Ergebnisse für TLR3 und OASL unterschieden sich jedoch von denen für die anderen PRR- und antiviralen Proteine ​​in der Milz, da die Expression von TLR3 und OASL bei 14 dpi im Vergleich zu 7 dpi abnahm. Dies könnte mit der negativen Rückkopplungsregulierung oder der Verringerung der Viruslast zusammenhängen. Dementsprechend kann lL-1B bei 14 dpi ein Ergebnis körpereigener Regulationsmechanismen gegen übermäßige proinflammatorische Zytokinproduktion sein. Interessanterweise war der mRNA-Spiegel von I-1 in der Niere in der infizierten Gruppe verringert. Ein niedrigerer Spiegel dieses entzündungsfördernden Zytokins kann helfen, Nierenschäden zu lindern. Frühere Studien berichteten, dass Infektionen mit dem humanen Astrovirus und dem Truthahn-Astrovirus Typ 2 (TASt V-2) nicht mit Entzündungen einhergingen und nur wenige Läsionen in den Darmzotten verursachten (Koci et al. 2003; Sebire et al. 2004), was darauf hindeutet dass dies ein Merkmal einer Astrovirus-Infektion in Epithelzellen sein könnte. I-6 ist auch ein entzündliches Zytokin, das über eine effiziente Immunantwort antivirale Wirkungen auslöst, aber auch an Prozessen beteiligt ist, die zu Gefäßschäden führen,Entzündungder Gefäßwand und Thrombose. In unserer Studie wurde nach einer GNAstV-Infektion keine signifikante Veränderung von IL-6 in der Milz gefunden; Dies könnte mit großen Unterschieden zwischen einzelnen Gänschen zusammenhängen. Allerdings war die I-6-Expression in der Niere verringert, ähnlich der Beobachtung für -1B; dies kann auch helfen, Nierenschäden zu lindern. I-8 ist ein Mediator, der für die Rekrutierung von Neutrophilen verantwortlich ist, die am lokalen entzündlichen Infiltrat teilnehmen. In dieser Studie wurde I-8 in Milz und Niere hochreguliert und könnte somit zur Entzündung beigetragen haben. IL-10 ist ein entzündungshemmendes Zytokin, das die proinflammatorische Zytokinproduktion hemmen kann. In dieser Studie verursachte GNAstV eine offensichtliche Abnahme der IL-10-Spiegel in der Milz; dies könnte ein Hinweis auf eine schwere Milzentzündung und eine der Ursachen für Milzschäden sein. Es wurde auch gezeigt, dass eine Infektion mit anderen Virusinfektionen, wie dem Japanischen Enzephalitisvirus und dem Zika-Virus, zu einer Abnahme der I-10-Expression führt (Swarup et al.2007; Abreu 2019), aber der genaue Mechanismus Die zugrunde liegende GNAstr-Infektion muss weiter untersucht werden. TGF- ist ein immunsuppressives Zytokin. Somit weist der Anstieg der TGF-B-Spiegel in Milz und Niere darauf hin, dass eine GNAstV-Infektion eine Immunsuppression induzieren kann. Darüber hinaus wurde berichtet, dass eine T-AStV-2-Infektion den Serumspiegel von TGF- bei Puten erhöhte (Koci et al. 2003). Es wurde gezeigt, dass eine erhöhte TGF-Produktion die Immunantwort unterdrückt und die virale Replikation verstärkt (Letterio und Roberts, 1998). Daher könnte eine erhöhte TGF-Produktion zur GNAstV-Replikation beitragen, indem sie die Immunantwort des Wirts hemmt. iNOS ist eine wichtige Komponente der angeborenen Immunantwort und spielt eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung von Virusinfektionen. In unserer Studie deuteten die Befunde auf eine GNAstV-Infektion hin

offensichtlich hochregulierte INOS-Expression. Eine hohe iNOS-Produktion kann es dem Wirt ermöglichen, einer viralen Infektion zu widerstehen. Unsere Ergebnisse stimmten mit denen früherer Studien überein, die zeigten, dass eine TAStV-2-Infektion die iNOS-Produktion induziert, was die Astrovirus-Replikation einschränkt (Qureshi et al.,200l; Koci et al.,2004; Meyerhoff et al.,2012 ).

Das adaptive Immunsystem spielt eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung von Virusinfektionen. In unserer Studie erhöhte GNAstVinfection den mRNA-Spiegel von MHC Ia, MHC Iix und CD8 plus, was darauf hindeutet, dass humorale und zelluläre Immunantworten aktiviert wurden. Früher wurde berichtet, dass eine Infektion mit dem menschlichen Astrovirus eine Antikörperproduktion hervorruft, die das Virus neutralisieren kann (Kurtzand Lee, 1978). In der Studie wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen in der Expression von CD4 plus mRNA gefunden. In Anbetracht der Tatsache, dass CD4"-T-Zellen für die B-Zell-Reifung und die Antikörperspezifität essentiell sind, ist es möglich, dass GNAst V keine starke humorale Immunantwort induzieren konnte. Dies könnte erklären, warum bei 7 dpi kein offensichtlicher Anstieg der MHC Ⅱa-Expression beobachtet wurde. Außerdem , verringerten sich die mRNA-Spiegel von CD8 und MHCIA bei 14 dpi im Vergleich zu 7 dpi. Dies kann, wie oben erwähnt, mit der Verringerung der Viruslast zusammenhängen. In dieser Studie wurde der GNAst V-Antikörper nicht nachgewiesen, da kein kommerzielles Kit verfügbar ist. Daher muss die Rolle von Antikörpern bei der GNAstV-Infektion weiter untersucht werden.

Zusammenfassend zeigten unsere Daten die Immunreaktionsmuster in Milz und Niere von GNAst V-infizierten Gänschen. Bei einer GNAst-V-Infektion wurden Gene aktiviert, die mit der angeborenen und adaptiven Immunität zusammenhängen. Die Produktion von Zytokinen und antiviralen Proteinen schützte die Küken jedoch nicht vor der Krankheit. Dies ist die erste Studie, die über die Veränderungen der immunbezogenen Genexpression als Reaktion auf die GNAst-Vinfektion berichtet, was zur weiteren Aufklärung der molekularen Mechanismen der GNAstV-Wechselwirkungen des Wirts beitragen könnte.