Teil 1: Die antimaligne Aszites-Wirkung der gesamten Diterpenoide aus Euphorbiae Ebracteolatae Radix ist auf Veränderungen von Aquaporinen über die Hemmung der PKC-Aktivität in der Niere zurückzuführen

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Abstrakt: Diese Studie bewertete die Anti-Aszites-Wirkung von Gesamt-Diterpenoiden, die aus Euphorbiae-ebracteolate Radix (TDEE) extrahiert wurden, auf maligne Aszites-Mäuse und erläuterte den zugrunde liegenden Mechanismus. TDEE wurde mit Dichlormethan extrahiert und einer Säulenchromatographie unterzogen. Die Reinheit von sechs aus TDEE isolierten Diterpenoiden wurde durch HPLC mit 77,18 Prozent bestimmt. TDEE (3 und 0,6 g rohe Kräuter/kg, po) verringerte Aszites und erhöhte die Urinausscheidung. In der Zwischenzeit zeigte die Analyse der Lebensfähigkeit, des Zyklus und der Apoptose von Tumorzellen, dass TDEE keine hatteAntitumorAktivität. Darüber hinaus sind die Expressionsniveaus von Aquaporinen (AQPs) und die Membrantranslokationsniveaus von Proteinkinase C (PKC) und PKC inNierenund Zellen gemessen. TDEE reduzierte die Konzentrationen von AQP1-4 und hemmte die PKC-Expression in der Membranfraktion. Vier Haupt-Diterpenoide, mit Ausnahme von Verbindung 2, reduzierten die AQP1-Spiegel in menschlichen Nieren-2-Zellen. Die Verbindungen 4 und 5 hemmten die AQP2-4-Expression in Sammelrohrzellen des inneren Marks der Maus. Die Diterpenoid-induzierte Hemmung der AQP1-4-Expression wurde durch Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; PKC-Agonist) blockiert. Die Diterpenoide aus TDEE sind die wichtigsten Anti-Aszites-Komponenten. Die Anti-Aszites-Wirkung von Diterpenoiden kann mit Veränderungen der AOPs in den Nieren verbunden sein, um die Diurese zu fördern. Die Hemmung der AOP1-4-Expression durch TDEE hängt mit der Hemmung der PKC-Aktivierung zusammen.

Schlüsselwörter: Euphorbia ebracteolate Hayata; Diurese; bioaktive Komponenten; Terpenoide; Nierenzellen; PKC-Inhibitor

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1. Einleitung

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) ist ein Mitglied der Gattung Euphorbia in der Familie der Wolfsmilchgewächse (Euphorbiaceae) und wird in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) häufig zur Behandlung von Blähungen und Ödemen, parasitären Infektionen, Tuberkulose und anderen Krankheiten eingesetzt[1]. Die Wurzel von EEH (EER) enthält verschiedene Terpenoide, die als wirksame Bestandteile gelten. Kürzlich wurden Studien zu Terpenoiden durchgeführt, um deren Wirkung zu bestimmenAntiphlogistikum, Virostatikum, Antituberkulose und andere Wirkungen in vitro [2-5]. Grundlagenforschungsuntersuchungen zu den traditionellen Wirkungen der EER bei der Behandlung von Bauchblähungen und Ödemen sind jedoch begrenzt. Nach der Theorie der TCM kann EER Bauchblähungen und Ödeme schnell beseitigen, indem es das Wasserlassen und Durchfall fördert [6]. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass Gesamtditerpenoide aus EER (TDEE) Durchfall verursachen können, indem sie die Expression von Aquaporin (AQP) -1 und AQP3 regulieren [7]. Bis heute sind die wirksamen Substanzen von Anti-Aszites bei EER jedoch unklar.

Blähungen und Ödeme werden in der modernen Medizin als Aszites bezeichnet. Aszites ist eine pathologische Ansammlung von Peritonealflüssigkeit [8]. Es gibt viele Ursachen für die Bildung von Aszites, wie Zirrhose, Tumor, Herzinsuffizienz und nephrotisches Syndrom [9]. Das Auftreten von Aszites steht im Zusammenhang mit einer portalen Hypertension, die zu einer splanchnikusarteriellen Vasodilatation, einer Verringerung des effektiven zirkulierenden Volumens, einer Aktivierung endogener Vasokonstriktorsysteme und einer starken Wasserretention in den Nieren führt [10]. AQPs sind schnelle Membrantransporter von Wasser zur Überwindung von Epithel- und Endothelbarrieren und spielen somit eine grundlegende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Wasserhaushalts [11]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass AQPs eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Störung von Aszites spielen [12-15]. Es gibt viele Arten von AQPs in den Nieren, wie AQP1, AQP2, AQP3 und AQP4[16]. Da TDEE die Expression von AQPs im Darm regulieren kann [7], schlagen wir vor, dass TDEE bei der Behandlung von Aszites durch Regulierung von AQPs in den Nieren verwendet werden kann.

AQPs spielen eine entscheidende Rolle bei der Urinbildung, jedoch sind die Mechanismen der Regulation der AQPs-Expression in den Nieren noch nicht geklärt. Derzeit weist nur eine begrenzte Anzahl von Berichten darauf hin, dass AQPs durch Proteinkinase C(PKC)- und Proteinkinase A(PKA)-Wege reguliert werden [17-20]. Einige aus Euphorbia isolierte Terpenoide (z. B. Uphold und Ingenol 3-angelate) haben regulatorische Wirkungen auf PKC. TDEE kann die AQPs-Expression in den Nieren über den PKC-Weg regulieren.

In dieser Studie haben wir TDEE extrahiert und seine Anti-Aszites-Wirkung bewertet sowie die AQPs-Expression, PKC- und PKA-Aktivitäten in den Nieren von Aszites-Mäusen analysiert. Dann haben wir die wichtigsten Diterpenoide aus TDEE isoliert und gereinigt, um ihre Auswirkungen auf die AQPs-Protein- und mRNA-Expressionsniveaus in zwei Arten zu untersuchenNierenzellen(menschliche Nieren-2-Zellen (HK-2) und murine innere medulläre Sammelrohrzellen (mIMCD3)). Schließlich wählen wir eine diterpenoide Verbindung (Euphebracteolatin A) unter Verwendung von Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; PKC-Agonist) zur Aktivierung des PKC-Signalwegs, um festzustellen, ob die Expression von AQPs in den Nieren reguliert wird über den PKC-Weg. Diese Studie zielte darauf ab, die Anti-Aszites-Wirkung von TDEE bei EER zu bestimmen und eine Grundlage für die klinische Anwendung von EER und die Identifizierung von Kandidatenarzneimitteln für Diurese- und Anti-Aszites-Wirkungen bereitzustellen.

2. Ergebnisse

2.1. Auswirkungen von TDEE auf das Gewicht der Aszitesflüssigkeit, das Uringewicht und den Wassergehalt im Stuhl

Die Behandlung von Aszitesmäusen mit Gesamtextrakt aus EER (TEER) und TDEE (3 und 0,6 g rohe Kräuter/kg, po) und Furosemid (positives Medikament) reduzierte die Gewichtszunahme der Aszitesflüssigkeit im Vergleich zum Modell signifikant Gruppe (Abbildung 1A). Abbildung 1C zeigte, dass der Urin signifikant wiegt (S<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Auswirkungen von TDEE auf Serumalbuminspiegel bei Aszites-Mäusen

Serumalbumin ist das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma von Wirbeltieren und kann den osmotischen Druck des Blutes aufrechterhalten und den Wassertransport regulieren. 1B zeigte, dass die Produktion von Aszites in Modellmäusen eine signifikante Abnahme des Serumalbumins im Vergleich zur normalen Gruppe verursachte. Nach der Behandlung mit Furosemid, TEER und TDEE (3 und 0,6 g rohe Kräuter/kg, po) wurden die Serumalbuminspiegel im Vergleich zur Modellgruppe effektiv wiederhergestellt. In den NTDEE-Gruppen wurde keine Verbesserung dieses Index beobachtet.

2.3. Auswirkungen von TDEE auf die Lebensfähigkeit, den Zyklus und die Apoptose von Tumorzellen bei Aszites-Mäusen

Beim malignen Aszites schwimmen Tumorzellen in der Aszitesflüssigkeit. Wir untersuchten, ob die Verringerung des Aszites mit der Antikrebsaktivität von TEER und TDEE zusammenhängt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Medikamente die Lebensfähigkeit der Tumorzellen nicht hemmten (Abbildung 2A) und nicht zu einem Zellzyklusarrest (Abbildung 2B) und Apoptose führten (Abbildung 2C, D).

2.4. Auswirkungen von TDEE auf die AQPs-Expression in den Nieren von Aszites-Mäusen

Die Niere ist ein wichtiges Organ für die Wasserresorption und Harnkonzentration. AQP-Wasserkanäle vermitteln den schnellen Wassertransport in den Nieren. Daher untersuchten wir die Expression von AQPs in den Nieren. Abbildung 3 zeigte, dass die Verstärkung des Aszites im Vergleich zur normalen Gruppe nur geringe Auswirkungen auf die AQP-Expression in den Nieren hatte. Bei Behandlung mit TEER und TDEE war die Expression von AQP1-, AQP2-, AQP3- und AQP4-Proteinen bei den meisten Dosierungen deutlich niedriger als in der Modellgruppe. TEER führte zu einer signifikanten Abnahme der AQP2-, AQP3- und AQP4-Expression bei Dosen von 3,0 und {{10}},6 g roher Kräuter/kg, während die AQP1-Expression nur bei a reduziert war niedrige Dosis (0,6 g rohe Kräuter/kg). Bemerkenswerterweise hatte TDEE die gleichen hemmenden Wirkungen auf die AQP3- und AQP4-Expression wie TEER bei zwei Dosen. Der Unterschied zwischen TDEE und TEER besteht darin, dass TDEE die Expression von AQP1 und AQP2 nur bei einer hohen Dosis (3 g rohe Kräuter/kg) hemmte 3g rohe Kräuter/kg.

2.5. Auswirkungen von TDEE auf die PKC- und PKA-Aktivierung in den Nieren von Aszites-Mäusen

Frühere Studien haben gezeigt, dass die AQPs-Expression durch PKC- und PKA-Aktivierung reguliert werden könnte. Wir untersuchten die Wirkungen von TDEE auf die PKC-a-, PKC- und PKA-Aktivierung. Die PKC-Aktivierung wurde durch ihre Translokation vom Zytosol zur Zellmembran gemessen. Wie in den Fig. 4A und B gezeigt, war das Proteinexpressionsniveau von PKC- in der Membranfraktion in den TDEE-Gruppen signifikant verringert, wohingegen es keine signifikante Wirkung auf das Expressionsniveau des PKC-Membranproteins gab. Phospholipase C(PLC) ist ein wichtiges vorgeschaltetes Signalmolekül, das die Aktivierung von PKC vermittelt. Die TDEE-Behandlung hatte keine Wirkung auf die Spiegel von phosphoryliertem und Gesamt-PLC (Abbildung 4D). Die PKA ist ein Heterotetramer, das aus zwei katalytischen Untereinheiten besteht, die an zwei regulatorische Untereinheiten gebunden sind. Die Freisetzung katalytischer Untereinheiten ist ein Kennzeichen der PKA-Aktivierung. In Abbildung 4C beeinflusste TDEE die Expression von katalytischen PKA-Untereinheiten nicht.

2.6. Bestimmung des Gehalts von sechs Diterpenoiden in TDEE durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Ergebnisse von Tierversuchen zeigten, dass TDEE die wichtigste wirksame Fraktion von EER war. Wir isolierten sechs Diterpenoide (die Strukturen der Verbindungen 1 bis 6 sind in Abbildung 5 dargestellt; die Spektraldaten wurden dem ergänzenden Material hinzugefügt) aus TDEE und verwendeten diese Verbindungen als Standards zur Bestimmung des Diterpenoidgehalts in TDEE. Die HPLC-Chromatogramme für TDEE und die sechs Diterpenoid-Standards sind in Abbildung 6 dargestellt. Der Gehalt der Verbindungen 1 bis 6 betrug 1,07 %, 12,00 %, 12,69 %, 9,15 %, 39,26 % bzw. 3,02 % für 77,18 Prozent von TDEE.

2.7. Auswirkungen von Diterpenoiden aus TDEE auf die AQPs-Expression in Nierenzellen

TDEE war die aktive Fraktion von EER, die Aszites hemmte, indem sie die AQP1-, AQP2-, AQP3- und AQP4-Expression in den Nieren reduzierte. Gleichzeitig reduzierte TDEE auch signifikant die Protein- und mRNA-Expression von AQP1, AQP2, AQP3 und AQP4 in menschlichen Nieren-2-Zellen (HK-2) und murinen inneren medullären Sammelrohrzellen (mIMCD3). (Abbildung 7). Die Hauptbestandteile von TDEE sind Diterpenoide. Wir verglichen die Wirkungen zwischen TDEE und Diterpenoidmischungen (sechs isolierte Diterpenoide wurden gemäß ihrem Gehalt in TDEE gemischt). Die Ergebnisse zeigten, dass die inhibitorischen Wirkungen der Mischung aus Diterpenoiden und TDEE auf die AQP1-, AQP2-, AQP3- und AQP4-Expression ähnlich waren (Abbildung 7). Die Aktivitäten von vier Hauptditerpenoiden aus TDEE wurden in vitro bewertet. Die 8 und 9 zeigten, dass die Protein- und mRNA-Expressionsniveaus von AQP1 in HK-2-Zellen durch die Verbindungen 3, 4 und 5 signifikant verringert wurden. Die Behandlung mit Verbindung 2 induzierte keine merkliche Abnahme von AOP1 am Protein und an der mRNA Ebenen. Bei diesen Verbindungen war Verbindung 3 (ein Diterpenoid vom Typ ent-Abietan) aktiver als die anderen Verbindungen. In mlMCD3-Zellen induzierten vier diterpenoide Verbindungen unterschiedliche Hemmungsgrade der AQP2-, AQP3- und AQP4-Expression. Die Ergebnisse der Protein- und Genexpression sind in den 8 und 9 dargestellt. Die Verbindungen 4 und 5 besaßen starke AQP2-, AQP3- und AQP4-Hemmwirkungen im Vergleich zur Kontrollgruppe auf Gen- und Proteinebene. Die Verbindungen 2 und 3 zeigten nur unterschiedliche Wirkungen auf die Aqp2-, Aqp3- und Aqp4-mRNA-Expression.

2.8. Wirkungen des Aktivators von PKC auf die Diterpenoid-induzierte Hemmung von AQPs

Die Ergebnisse aus dem Tierversuch zeigten, dass TDEE gleichzeitig die PKC-Aktivität und die AQPs-Expression in den Nieren von Mäusen mit H22-Tumorzellen hemmte. Um weiter zu klären, ob die PKC die Expression von AQPs in Nierenzellen reguliert, wurde der PKC-Agonist (PMA) in HK-2- und mIMCD3-Zellen 1,5 h vor der Stimulation mit Diterpenoid (Euphebracteolatin A) vorbehandelt. Die Veränderung der Membran-PKC-, AOP1-, AOP2-, AOP3- und AOP4-Expression wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse von Western Bolt zeigten, dass Euphebracteolatin A die Proteinexpression von Membran-PKC, AOP1, AOP2, AOP3 und AOP4 verringern konnte und die Wirkungen durch PMA-Vorbehandlung abgeschwächt werden konnten (Abbildung 10).