Neben der lebensdauerfördernden Aktivität von MET in verschiedenen Modellorganismen

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EINLEITUNG

Linsenepithelzellen (LECs) bilden eine Monoschicht von Zellen, die die vordere Kapsel der Linse auskleiden und sich bis zum äquatorialen Linsenbogen erstrecken [1, 2]. Die normale Konstruktion und Funktion von LECs sind wesentlich für die Aufrechterhaltung der Transparenz und metabolischen Homöostase der gesamten Linse[3]. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass die Alterung von LECs eine Modifikation, Denaturierung und Aggregation von Linsenproteinen, einschließlich Enzymen und Kristallinen, verursachen kann, was letztendlich zu Linsentrübung oder sogar Katarakt führt [3-5]. Die altersbedingte Katarakt (ARC) bleibt die Hauptursache für Sehbehinderung und Erblindung, was die Lebensqualität älterer Menschen stark beeinträchtigt [6]. Derzeit gibt es keine wirksamen Strategien zur Verhinderung des Fortschreitens von ARC. Daher ist es notwendig, eine pharmakologische Intervention zu entwickeln, die die Transparenz der Linse verbessern und die ARC-Progression verzögern kann.

In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler mit mehreren genetischen, diätetischen und pharmakologischen Eingriffen bemerkenswerte Fortschritte bei der Verbesserung der Gesundheit und der Verlängerung der Lebensdauer erzielt [7]. Metformin (MET) ist einer der umfassend untersuchten Anti-Aging-Wirkstoffe. Umfangreiche Studien deuten darauf hin, dass MET in verschiedenen Tiermodellsystemen die Seneszenz lindern und eine gesunde Lebensdauer verlängern kann. MET kann nicht nur die Lebensdauer von Caenorhabditis elegans verlängern, sondern auch seine Gesundheit und Vitalität verbessern [8]. MET kann die altersbedingte und durch oxidativen Stress bedingte Akkumulation von DNA-Schäden in Drosophila-Mitteldarmstammzellen reduzieren, um deren Lebensdauer zu verlängern [9]. Frühere Studien weisen auch darauf hin, dass die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung die Gesundheit und Lebensdauer von Mäusen verbessert [10]. Darüber hinaus deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass Patienten mit Diabetes, die mit MET behandelt werden, Überlebensvorteile zeigen, selbst wenn sie mit Kontrollen verglichen werden, die keinen Diabetes haben [11].

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Zusätzlich zu der lebensdauerfördernden Aktivität von MET in verschiedenen Modellorganismen zielt MET auf mehrere zelluläre Signalwege ab, um altersbedingte Krankheiten zu lindern. Es wurde gezeigt, dass MET die Autophagie hauptsächlich über die Aktivierung der Adenosinmonophosphat (AMP)-aktivierten Proteinkinase (AMPK) moduliert und Neurodegeneration und Neuroinflammation verhindert, um eine neuroprotektive Rolle bei der Parkinson-Krankheit zu spielen [12]. In ähnlicher Weise verbessert MET altersbedingte Veränderungen in den sinusoidalen Endothelzellen der Leber über die AMPK- und endothelialen Stickoxidwege [13].Cistanche-Dosierung redditDarüber hinaus verhindert die chronische AMPK-Aktivierung durch MET eine Kardiomyopathie, indem sie die Autophagie bei OVE26-Mäusen mit Diabetes hochreguliert [14]. Darüber hinaus lindert MET die altersbedingte kardiovaskuläre Verschlechterung durch Verbesserung der Autophagie und Kalorienrestriktion [15]. Darüber hinaus kann die MET-Behandlung altersassoziierte Atherosklerose bei ApoE-7--Mäusen und -Kaninchen hemmen, die durch eine fettreiche Ernährung induziert wird, die atherosklerotische Plaque-Verkalkung signifikant verhindern, die Spiegel des hochempfindlichen C-reaktiven Proteins reduzieren und die Aktivierung der Nuklearfaktor Kappa B(NF-kB)-Weg in Blutgefäßen [16-18].

Basierend auf diesen Beobachtungen versuchte die vorliegende Studie zu untersuchen, ob MET die ARC-Alterung und den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus verzögern kann. Unsere Ergebnisse sind wie folgt: (i) eine chronische niedrig dosierte MET-Behandlung verzögerte die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen und hemmte dadurch die Linsentrübung; (i) der AMPK-Weg wurde inaktiviert und der autophagische Fluss war bei seneszenten LECs beeinträchtigt; (i ) verzögerte eine chronische niedrig dosierte MET-Behandlung die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen, indem sie den AMPK-Weg aktivierte und die Autophagie verstärkte. Unsere Ergebnisse untermauern die mutmaßliche Anti-Aging-Rolle von MET und liefern ausreichende Beweise dafür, dass sich MET als mögliche therapeutische Option für ARC erweisen könnte.

ERGEBNISSE

Seneszenz von LECs war bei natürlich gealterten Mäusen mit ARC assoziiert

Mehrere potenzielle Mechanismen von ARC, einschließlich der Auswirkungen des Alterns, wurden ausführlich untersucht.Cistanche-Extrakt Vorteile,Der Zusammenhang zwischen der Seneszenz von LECs und ARC in vivo bleibt jedoch unklar. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Seneszenz von LECs in vivo zu ARC führen kann. Daher haben wir ein Mausmodell von ARC konstruiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Transparenz der Linse bei natürlich gealterten Mäusen (ältere Mäuse) im Vergleich zur Kontrollgruppe (junge Mäuse) signifikant verringert war (Abb. 1a). Wie in Abb. 1b gezeigt, betrug die Katarakthäufigkeit in der Gruppe der natürlichen Altersgruppen 95,23 Prozent. Der H&E-Färbungsassay zeigte, dass die LECs in der Kontrollgruppe eine runde Form hatten und regelmäßig angeordnet waren und die Dichte der normalen LECs relativ hoch war, wohingegen die LECs der natürlich gealterten Mäuse eine flache Form hatten und ungleichmäßig angeordnet waren und die Dichte von seneszente LECs war deutlich verringert (Abb. 1c). Darüber hinaus zeigte die SA- -Gal-Färbung, dass der Anteil seneszenter LECs bei natürlich gealterten Mäusen erhöht war (Abb. 1d). Darüber hinaus analysierten wir die Proteinexpression von Seneszenz-assoziierten Markern mittels IHC-Färbung und Western-Blot-Analyse. Die IHC-Färbung zeigte, dass die Expression von p21 und p53 in den LECs natürlich gealterter Mäuse im Vergleich zu jungen Mäusen erhöht war (Abb. 1e, f). In ähnlicher Weise entdeckten wir ferner, dass die Proteinexpression von p21 und p53 in den Linsenkapseln natürlich gealterter Mäuse höher war als in den Linsenkapseln junger Mäuse (Abb. 1g). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Seneszenz von LECs bei natürlich gealterten Mäusen mit ARC assoziiert war.

Cistanche kann Anti-Aging

Die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung verbesserte die Transparenz der Linse und linderte die Alterung von LECs. Bevor wir die Wirkung von Metformin auf ARC testeten, stellten wir fest, ob die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung für Mäuse sicher ist. Nach 10-monatiger MET-Behandlung starben 28 Mäuse (18 in der natürlich gealterten Gruppe und 10 in der MET-Gruppe) eines natürlichen Todes. Wir fanden heraus, dass lebende Mäuse in beiden Gruppen gesund waren und es keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht und Organgewicht zwischen beiden Gruppen gab (Tabelle 1). Daher zeigten diese Ergebnisse, dass die in der Studie verwendete Dosierung von Metformin für die Tiere sicher war und für nachfolgende Experimente verwendet werden konnte.

Anschließend wurde chronisch niedrig dosiertes MET verabreicht, um zu beurteilen, ob MET die Linsentrübung hemmen und die altersbedingte Seneszenz von LECs bei natürlich gealterten Mäusen lindern kann. Wie erwartet war die Transparenz der Linse in der MET-Gruppe im Vergleich zur Transparenz der Linse in der natürlich gealterten Gruppe stark verbessert (Abb. 2a). Darüber hinaus bestätigten morphologische Beobachtungen, dass die Linse der MET-Gruppe eine Verringerung der Opazität aufwies. Die Katarakthäufigkeit in der natürlich gealterten Gruppe betrug 95,23 Prozent, während die in der MET-Gruppe 19,00 Prozent betrug (Abb. 2b). Der H&E-Färbungstest ergab, dass die Dichte der LECs in der MET-Gruppe deutlich höher war als bei den natürlich gealterten Mäusen (Abb. 2c). Darüber hinaus waren die LECs der MET-Gruppe im Vergleich zu denen der natürlich gealterten Gruppe relativ rund (Abb. 2c). Die SA- -Gal-Färbung zeigte, dass das Verhältnis von seneszenten LECs in der MET-Gruppe im Vergleich zu dem in der natürlich gealterten Gruppe signifikant verringert war (Abb. 2d). Die IHC-Analyse ergab, dass die Expression von p21 und p53 in den LECs der MET-Gruppe stärker verringert war als in der natürlich gealterten Gruppe (Abb. 2e, f). In ähnlicher Weise zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die Proteinexpression von p21 und p53 in den Linsenkapseln der MET-Gruppe im Vergleich zu denen der natürlich gealterten Gruppe bemerkenswert verringert war (Abb. 2g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung die Transparenz der Linse verbessern und die Alterung von LECs lindern könnte.

Chronische niedrigdosierte MET-Verabreichung schwächte die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen durch AMPK-Aktivierung ab . Unter Berücksichtigung dieser Theorie untersuchten wir die Expression des AMPK-Signalwegs in LECs von Mäusen. Der relative FAS-mRNA-Spiegel war in der natürlich gealterten Gruppe reduziert und in der MET-Gruppe erhöht (Abb. 3a). Wie in Abb. 3b, c gezeigt, war die Expression von phosphoryliertem AMPKa (Thr172) und phosphoryliertem ACC (Ser79) in den LECs von natürlich gealterten Mäusen im Vergleich zu denen von jungen Mäusen reduziert. Allerdings war die Expression von phosphoryliertem AMPKa (Thr172) und phosphoryliertem ACC (Ser79) in den LECs der MET-Gruppe im Vergleich zu denen der natürlich gealterten Gruppe erhöht. Darüber hinaus ergab die Western-Blot-Analyse, dass die Proteinexpression von phosphoryliertem AMPKa (Thr172) und phosphoryliertem ACC (Ser79) in den Linsenkapseln natürlich gealterter Personen signifikant herunterreguliert war und die Proteinexpressionsniveaus von phosphoryliertem AMPKa (Thr172) und phosphoryliertem ACC ( Ser79) waren in den Linsenkapseln der MET-Gruppe erhöht (Abb. 3d). Diese Daten zeigten, dass der AMPK-Weg in den LECs natürlich gealterter Mäuse inaktiviert war. Darüber hinaus schwächte die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen über die AMPK-Aktivierung ab.

Die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung stellte den autophagischen Fluss wieder her, um die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen zu lindern. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Autophagie eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung der nachteiligen Auswirkungen des Alterns spielen könnte [21,22]. Um die molekularen und zellulären Veränderungen in der Linse nach der MET-Behandlung weiter zu analysieren, haben wir die Expression von LC3 und p62 bestimmt, da sie weithin als Biomarker für das Ausmaß der Autophagie anerkannt sind. Wie in Fig. 4a gezeigt, war das relative p62-mRNA-Expressionsniveau in der natürlich gealterten Gruppe im Vergleich zu dem der Kontrollgruppe signifikant erhöht; jedoch war das relative mRNA-Expressionsniveau von p62 in der MET-Gruppe im Vergleich zu dem in der natürlich gealterten Gruppe wesentlich herunterreguliert.Cistanche Dschingis KhanDarüber hinaus zeigte die IHC-Färbung, dass die Spiegel der Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtkette 3 (LC3-II/l) und p62 in den LECs natürlich gealterter Mäuse erhöht waren. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Konzentrationen von LC3-II/l und p62 in den LECs der MET-Gruppe bemerkenswert verringert waren (Abb. 4b, c). Die Proteinspiegel von LC3-ll und p62 waren in den Linsenkapseln der natürlich gealterten Gruppe deutlich erhöht (Abb. 4d). Insgesamt spekulierten wir, dass der autophagische Fluss in den LECs natürlich gealterter Mäuse beeinträchtigt war und durch chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung wiederhergestellt werden könnte, um die Seneszenz von LECs in natürlich gealterten Mäusen zu lindern.

DISKUSSION

Unbehandelte Katarakte sind weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung, die durch eine Trübung der Augenlinse gekennzeichnet sind [23]. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass das Alter der dominierende Risikofaktor für Katarakte, bekannt als ARC, ist und die einzige Behandlung in der chirurgischen Entfernung besteht [24]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Seneszenz von LECs die Hauptursache für ARC ist [25]. Bis heute gab es keine wirksamen therapeutischen Mittel, um die Trübung der Linse zu hemmen und die Alterung von LECs ohne unerwünschte Nebenwirkungen abzuschwächen. Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie lag auf der Bewertung der molekularbiologischen Grundlagen für die Seneszenz von LECs und des Mechanismus zum Schutz normaler LECs vor Seneszenz. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von AMPK und die Beeinträchtigung der Autophagie mit der Seneszenz von LECs und ARC assoziiert waren. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass MET LECs vor Alterung schützen und die Trübung der Linse hemmen könnte, indem es AMPK aktiviert und die Autophagie verbessert.

Seneszenz ist ein grundlegender biologischer Prozess, der mit einem allgemeinen Rückgang der Gewebefunktion einhergeht. Mit zunehmender Lebenserwartung werden altersbedingte Funktionsstörungen wie ARC zu ernsthaften Gesundheitsproblemen

Probleme [26]. Es wurde berichtet, dass die Seneszenz von LECs am Auftreten und der Entwicklung von ARC beteiligt ist [5]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die LECs der natürlich gealterten Mäuse eine flache Form hatten und ungleichmäßig angeordnet waren und die Dichte der LECs deutlich abnahm (Abb. 1c, d). Darüber hinaus war die Expression von alterungsassoziierten Genen (p21 und p53) in den LECs der natürlich gealterten Mäuse hochreguliert (Abb. 1e, f, g). Unsere Ergebnisse implizierten, dass die Seneszenz von LECs mit dem Auftreten und der Entwicklung von ARC assoziiert war. Daher kann ein genaues Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Seneszenz von LECs zugrunde liegen, erforderlich sein, um eine Begründung für neue Behandlungsstrategien zu liefern.

MET ist das weltweit am häufigsten verschriebene orale hypoglykämische Medikament für Typ-2-Diabetes. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass MET positive Auswirkungen auf die Gesundheit hat, die über diejenigen hinausgehen, die mit einer Verbesserung der Glykämie verbunden sind [27]. Es wurde bestätigt, dass die Mechanismen von MET wichtig sind, um auf grundlegende Wege der biologischen Alterung abzuzielen, wie z. B. die Aktivierung von AMPK, die Steigerung der Autophagie, die Hemmung von Entzündungen und die Ausübung antioxidativer Wirkungen [28]. Beim Menschen wird MET seit mehr als 60 Jahren in der klinischen Praxis eingesetzt; Es hat ein hohes Sicherheitsprofil und ist einzigartig positioniert, um in mehrere entscheidende Wege einzugreifen, die für das Altern und altersbedingte Krankheiten verantwortlich sind. Die Wirkungen von MET auf ARC und der Regulierungsmechanismus dieser Wirkungen wurden jedoch nie berichtet. Folglich verbesserte in unserer Studie die chronische niedrig dosierte MET-Verabreichung bei natürlich gealterten Mäusen die Transparenz der Linse (Abb. 2a) und dämpfte die Seneszenz von LECs in vivo (Abb. 2).

Es ist allgemein anerkannt, dass MET den AMPK-Weg aktiviert, der der potenzielle Mechanismus von MET ist, um eine Anti-Aging-Wirkung auszuüben [29]. AMPK, ein zellulärer Energiesensor, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des zellulären Energiegleichgewichts [30]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass AMPK als Integrator und Vermittler mehrerer Wege und Prozesse dient, die Energetik mit Langlebigkeit in Verbindung bringen. In unserer Studie fanden wir heraus, dass die Inaktivierung von AMPK ein Merkmal von seneszenten LECs in natürlich gealterten Mäusen war (Abb. 3). Anschließend wurde gezeigt, dass MET den AMPK-Weg stimuliert, um die Seneszenz von LECs zu verhindern (Abb. 3). Als etablierter AMPK-Aktivator wird die Rolle von MET bei der Prävention des Alterns im Allgemeinen auf seine Wirkungen auf die Modulation nachgeschalteter Signalwege zurückgeführt, wie z. B. die Wiederherstellung der Autophagie, die Aktivierung von Sirt1 und Foxo1 und die Unterdrückung von mTOR [31,32]. Unsere Studie lieferte eine neue Beweislinie, die die Bedeutung der durch MET aktivierten AMPK-Funktion bei der Verhinderung des Auftretens von ARC betont.

Wie oben erwähnt, kommuniziert AMPK mit zahlreichen Signalwegen und Proteinen, um einen Anti-Seneszenz-Effekt auszuüben, einschließlich der Verstärkung der Autophagie. Autophagie, die sich zu einem Kernprozess für die Sicherung der Langlebigkeit entwickelt, hat als potenzielles therapeutisches Ziel für altersbedingte Krankheiten breites Interesse geweckt. Autophagie ist ein fließender, vielstufiger komplexer biologischer Prozess. Der vollständige Prozess der Autophagie wird als autophagischer Fluss bezeichnet, der häufig verwendet wird, um den Grad der Autophagie widerzuspiegeln. Als Indikator für Autophagie ist LC3-Il fest an die autophagosomale Membran gebunden, die durch lysosomale Enzyme abgebaut wird.cistanche lebensverlängerungIn ähnlicher Weise wird p62, ein autophagiespezifisches Substrat, normalerweise im Autophagolysosom abgebaut, und seine Expression spiegelt indirekt das Ausmaß der Autophagie wider. In der vorliegenden Studie implizierten unsere Ergebnisse, dass das Niveau der Autophagie bei seneszenten LECs deutlich abnahm (Abb. 4), während MET die altersbedingte Beeinträchtigung der Autophagie umkehrte (Abb. 4). Der molekulare Anti-Aging-Mechanismus von MET wird der primären Funktion von AMPK in Zellen zugeschrieben, da es im Allgemeinen die Autophagie über die AMPK-Aktivierung verstärkt [33]. Darüber hinaus fördert MET nachweislich direkt die Autophagie und trägt so zur Prävention von Seneszenz bei [34]. Es sind jedoch detailliertere Studien erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären, die belegen, dass MET die Autophagie über einen unabhängigen oder abhängigen AMPK-Weg verstärkt.

Es wurde gezeigt, dass die Prävalenz von ARC in Populationen asiatischer Herkunft nicht mit dem Geschlecht in Verbindung gebracht wurde [35, 36]. Daher betrachteten wir das Geschlecht nicht als einen Faktor, der ARC beeinflussen könnte. Unsere Studie sollte unter Berücksichtigung der oben genannten Einschränkungen interpretiert werden.

FAZIT

Zusammenfassend haben wir bewiesen, dass die Inaktivierung des AMPK-Signalwegs und die altersbedingte Beeinträchtigung der Autophagie zur Seneszenz von LECs und dem Auftreten von ARC beitragen könnten. Darüber hinaus zeigten die Daten aus unseren Experimenten, dass MET die Seneszenz von LECs und die Bildung von ARC durch Aktivierung des AMPK-Signalwegs und Verstärkung der Autophagie effektiv verzögerte. Unsere Ergebnisse sind eine grundlegende Linie für die weitere Untersuchung der molekularen Mechanismen, die für die Rolle von MET während des Alterungsprozesses von ARC nützlich sind, und werden für intensivere Studien zur Entwicklung neuer Strategien gegen das Auftreten und die Entwicklung von ARC aufschlussreich sein.

MATERIALIEN UND METHODEN Reagenzien

MET wurde von Bristol-Myers Squibb Company (China) bezogen SQSTM1/p62 (3340-1) wurden von Abcam (MA, USA) bezogen. Antikörper gegen LC3 (12741) und Phosphoacetyl-CoA-Carboxylase (p-ACC) (Ser79) (3661) wurden von Cell Signaling Technology ( MA, USA).

Tiere und Behandlung

Männliche C57BL6J-Mäuse, die 3 und 8 Monate alt waren, wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Peking, China) erworben. Die Mäuse wurden in temperaturkontrollierten (Temperatur, 20-25 Grad und relativer Feuchtigkeit, 55 ± 15 Prozent) Bedingungen mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten, mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle an Tieren durchgeführten Verfahren und Protokolle wurden von der Ethikkommission der Harbin Medical University genehmigt.

Die Mäuse wurden in die folgenden drei Gruppen eingeteilt: (i) Die Kontrollgruppe mit jungen Mäusen (3 Monate alt, Körpergewicht =29,72 ± 1,66 g, n =40) erhielt eine gereinigte Standardmäusediät und Wasser nach Belieben; Als die Mäuse 10 Monate alt waren, wurden 120 Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe im natürlichen Alter und MET-Gruppe. (i) natürlich gealterte Gruppe (ältere Mäuse, 20 Monate alt, Körpergewicht =32,98 ± 1,93 g, n=60) erhielt eine gereinigte Standardmäusediät und Wasser ad libitum; (ii) MET-Gruppe ( 20 Monate alt, Körpergewicht =31,21 ± 2,81 g, n=60) wurde mit einer gereinigten Standardmäusediät und Wasser gehalten, bis die Mäuse 10 Monate alt waren; Danach wurden die Behandlungen eingeleitet. Mäuse in der MET-Gruppe wurden 10 Monate lang mit einer mit 0,1 Prozent MET (Bristol Myers Squibb, China) und Wasser ergänzten Diät gefüttert.

Isolierung von Linsen und Linsenkapseln

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation eingeschläfert. Bei allen Versuchstieren wurde sofort das ganze Auge herausgeschnitten und in sterile Kochsalzlösung gegeben. Der Sehnerv wurde nach oben gelegt und mit einer Pinzette fixiert. Dann wurde ein Einschnitt am Sehnerv vorgenommen, der in das Auge eintritt, und die Sklera wurde zurückgezogen, um die Linse freizulegen.cistanche nzAnschließend entfernten wir vorsichtig mit einer Pinzette die Ziliarkörperfragmente, die an der Äquatorebene der Linse befestigt waren. Fotos der frischen Linse wurden sofort gemacht, und die Linse wurde schnell mit 4 Prozent Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Die gesamten Linsenkapseln wurden schnell von der verbleibenden Linse abgezogen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für nachfolgende Experimente bei 80 Grad C gelagert.

Hämatoxylin und Eosin (H&E)

Die frische Linse wurde sofort mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert und in Paraffin eingebettet. Zur histologischen Untersuchung wurden die Gewebe in 4- μm-Scheiben geschnitten. Nach der Entparaffinierung und Rehydrierung wurden die präparierten Paraffinschnitte mit Hämatoxylin (H)-Lösung für 8 Minuten gefärbt, gefolgt von 5 Tauchgängen in 1 % saurem Ethanol (1 % HCl in 70 % Ethanol).

und Spülen mit destilliertem Wasser. Anschließend wurden die Schnitte mit Eosin (E)-Lösung für 3 min gefärbt, gefolgt von Dehydratisierung mit abgestuftem Alkohol und Klärung mit Xylol. Unter einem Mikroskop (Nikon, Eclipse, Japan) wurden morphologische Veränderungen beobachtet.

Seneszenz-assoziierte -Galactosidase (SA- -Gal)-Assay Die Seneszenz-assoziierte -Galactosidase (SA- -Gal)-Aktivität wurde unter Verwendung eines SA- -Gal-Färbekits (Sigma, CS{ {12}}030). Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Gewebeschnitte nach einer Reihe von Behandlungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min (dreimal) gewaschen und dann in SA- -gal-Färbelösung (pH 6,0) bei inkubiert 37 Grad ohne CO2 für 24 h. Die Bilder wurden unter einem Lichtmikroskop (Nikon, Eclipse, Japan) aufgenommen. Der Prozentsatz der SA- -gal-positiven Zellen wurde als mittlere Anzahl positiver Zellen/mittlere Anzahl aller Zellen geschätzt.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (gRT-PCR) Gesamt-RNA aus den Linsenkapseln von Mäusen wurde mit dem TRlzol-Reagenz extrahiert. Reverse Transkription wurde mit dem ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen) durchgeführt. Die quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (qRT-PCR) wurde unter Verwendung eines SYBR Green Supermix durchgeführt

Kit (Takara, Tokio, Japan), mit -Aktin als endogene Kontrolle. Die Transkriptionen wurden für mehrere Zielgene untersucht, darunter FAS (vorwärts, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3' und rückwärts, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (vorwärts, 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} und umgekehrt,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') und -actin (vorwärts, 5'-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'und rückwärts,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Der Verwandte Niveaus jeder Genexpression waren

Methode. auf -Aktin normalisiert und unter Verwendung der 2-△△ct r berechnet um die Expression von p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 und p62 zu beurteilen. Nachdem die vorbereiteten Proben bei 60 Grad für 2 Stunden inkubiert wurden, wurden sie zur Entparaffinierung durch eine Reihe von Xylol und abgestuftem Alkohol geleitet. Anschließend wurden die Proben in 0,1 M Zitronensäure (pH 6,1) für 30 min gekocht und auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Proben mit 0,3 % HO getränkt, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu hemmen. Anschließend wurden primäre Antikörper zugegeben und über Nacht auf 4°C gekühlt. Die entsprechenden sekundären Antikörper wurden für 1 h bei 37 Grad C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben in Diaminobenzidin (DAB) inkubiert, bis sich die gewünschte Färbeintensität entwickelt hatte. Bilder der immungefärbten Zellen wurden unter Verwendung des Nikon-Eclipse-Mikroskops (Nikon, Eclipse, Japan) aufgenommen.

Western-Blot-Analyse

Gesamtprotein aus Linsenkapseln von Mäusen wurde unter Verwendung von Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Pierce, USA) extrahiert, und ein Bicinchoninsäure (BCA)-Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) wurde verwendet, um die Proteinkonzentration zu quantifizieren . Das Gesamtprotein (40 ug) wurde unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert und elektrophoretisch auf Polyvinylidendifluoridfilter (PVDF)-Membranen (Millipore, Deutschland) übertragen. Die Membranen wurden über Nacht mit einem primären Antikörper bei 4 Grad C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen mit entsprechenden sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei 37 Grad C inkubiert. Die immunreaktiven Banden wurden unter Verwendung der Chemilumineszenz-Substratmethode mit einem Super Signal West Pico sichtbar gemacht Kit (Pierce Biotechnology, USA). Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 7.0 und Microsoft Excel durchgeführt. Protein wurde unter Verwendung der Image J-Software quantifiziert. Der Student's t-Test und die Varianzanalyse (ANOVA) wurden verwendet, um die statistische Signifikanz der experimentellen Daten zu berechnen. Unterschiede mit einem P-Wert<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DATENVERFÜGBARKEIT

Die Datensätze, die während der aktuellen Studie verwendet und analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus www.nature.com/cddiscovery