In Silico-Design eines promiskuitiven chimären Multi-Epitop-Impfstoffs gegen Mycobacterium Tuberculosis Teil 1

Abstrakt

Tuberkulose (TB) ist eine globale Gesundheitsbedrohung, an der jedes Jahr etwa 1,5 Millionen Menschen sterben. Die Ausrottung von Mycobacterium tuberculosis, dem Hauptverursacher von Tuberkulose, wird aufgrund des Auftretens zahlreicher arzneimittelresistenter Stämme immer schwieriger. Die Impfung gilt als wirksames Mittel zum Schutz des Wirts vor Krankheitserregern, doch der einzige klinisch zugelassene Tuberkulose-Impfstoff, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), bietet bei Erwachsenen nur begrenzten Schutz. Es wurde festgestellt, dass Multi-Epitop-Impfstoffe die Immunität gegen Krankheiten verbessern, indem sie Epitope mehrerer Kandidatenproteine ​​selektiv kombinieren.

Tuberkulose ist eine durch das Bakterium Mycobacterium tuberculosis verursachte Infektionskrankheit, die hauptsächlich die Lunge befällt, aber auch andere Organe befallen kann. Die Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Behandlung von Tuberkulose.

Bei unzureichender Immunität kann Mycobacterium tuberculosis leicht in den menschlichen Körper eindringen und sich zu Tuberkulose entwickeln. Beispielsweise erhöht ein durch bestimmte Krankheiten oder medizinische Behandlungen geschwächtes Immunsystem das Risiko einer Tuberkuloseinfektion. Darüber hinaus können auch Faktoren wie Unterernährung, schlechte Lebensqualität und übermäßiger Stress die Immunität schwächen und zur Entstehung von Tuberkulose führen.

Daher ist die Aufrechterhaltung einer guten Gesundheit und die Stärkung des Immunsystems sehr wichtig, um Tuberkulose vorzubeugen. Die Immunität kann durch eine gesunde Ernährung, einen regelmäßigen Lebensstil, ausreichend Bewegung und ausreichend Schlaf gestärkt werden, wodurch das Risiko, an verschiedenen Krankheiten, einschließlich Tuberkulose, zu erkranken, wirksam verringert werden kann.

Immunität ist auch wichtig für die Behandlung und Genesung, wenn Tuberkulose bereits aufgetreten ist. Je stärker das Immunsystem ist, desto effektiver kann sich der Körper gegen einen Angriff des TB-Bazillus wehren und genügend Antikörper produzieren, um die Krankheit zu bekämpfen. Daher können die Aufrechterhaltung einer angemessenen Ernährung, angemessener Bewegung und einer positiven Einstellung die Immunität verbessern und die Genesung fördern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein enger Zusammenhang zwischen Immunität und Tuberkulose besteht. Die Aufrechterhaltung einer guten Gesundheit und die Stärkung der Immunität sind eine der wichtigsten Möglichkeiten zur Vorbeugung und Behandlung von Tuberkulose. Lassen Sie uns dem Leben positiv begegnen, einen gesunden Lebensstil pflegen und uns von Krankheiten fernhalten. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir unsere Immunität verbessern. Cistanche kann die Immunität erheblich verbessern, da Fleischasche eine Vielzahl biologisch aktiver Komponenten enthält, wie Polysaccharide, zwei Pilze, Huang Li usw. Diese Komponenten können das Immunsystem verschiedener Zelltypen im System stimulieren und ihre Immunaktivität erhöhen.

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Ziel dieser Studie war es, mithilfe eines immuninformatischen Ansatzes einen Multi-Epitop-Impfstoff gegen Tuberkulose zu entwickeln. Durch funktionelle Anreicherung haben wir acht von M. tuberculosis sezernierte Proteine ​​identifiziert, die entweder für die Pathogenese erforderlich sind, in den extrazellulären Raum sezerniert werden oder beides. Anschließend analysierten wir die Epitope dieser Proteine ​​und wählten 16 Helfer-T-Lymphozyten-Epitope mit Interferon-induzierender Aktivität, 15 zytotoxische T-Lymphozyten-Epitope und 10 lineare B-Zell-Epitope aus und konjugierten sie mit Adjuvans und Pan-HLA-DR-bindendem Epitop (PADRE) unter Verwendung geeigneter Methoden Linker.

Darüber hinaus haben wir die Tertiärstruktur dieses Impfstoffs, seine mögliche Wechselwirkung mit dem Toll-Like-Rezeptor-4 (TLR4) und die Immunantwort, die er hervorrufen könnte, vorhergesagt. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser Impfstoff eine starke Affinität zu TLR4 hatte, was CD4-Plus- und CD8-Plus-Zellen erheblich zur Sekretion von Immunfaktoren und B-Lymphozyten zur Sekretion von Immunglobulinen stimulieren konnte, um eine gute humorale und zelluläre Immunität zu erreichen. Insgesamt wurde vorausgesagt, dass dieses Multi-Epitop-Protein stabil, sicher, hoch antigen und hoch immunogen ist und das Potenzial hat, als globaler Impfstoff gegen Tuberkulose zu dienen.

1. Einleitung

Tuberkulose (TB), eine hochansteckende Krankheit, die durch Mycobacterium tuberculosis verursacht wird, wird von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als häufigste Todesursache durch einen einzelnen Infektionserreger eingestuft [1–3]. Im Jahr 2021 erreichte die geschätzte Zahl der Tuberkulose-Todesfälle und Neuerkrankungen 1,6 Millionen bzw. 10,6 Millionen [4]. Derzeit ist die klinische Behandlung von Tuberkulose relativ selten und es wird hauptsächlich die Kombination mehrerer antimikrobieller Medikamente eingesetzt.
Dieser Chemotherapiezyklus ist sehr lang und dauert normalerweise neun bis zwölf Monate oder sogar länger [5], was das Risiko arzneimittelresistenter Mutationen bei M. tuberculosis erhöht [6,7]. In den letzten Jahren hat die Wirksamkeit der Chemotherapie aufgrund des Auftretens und des zunehmenden Anteils multiresistenter und extensiv resistenter M. tuberculosis verloren [6]. Es kann wirksamer sein, die Entwicklung einer Tuberkulose zu verhindern, als sie zu behandeln. Impfungen sind bekanntermaßen ein wirksames Mittel, um den Wirt vor pathogenen Bakterien zu schützen [8].

Derzeit ist der vor über 100 Jahren entwickelte Bacillus Calmette-Guérin (BCG) der einzige klinisch zugelassene Tuberkulose-Impfstoff [9]. Leider schützt BCG nur Neugeborene und Säuglinge und ist gegen Jugendliche und Erwachsene weitgehend wirkungslos [2,10], obwohl die WHO berichtet, dass 89 Prozent der TB-Fälle im Jahr 2021 Erwachsene waren [4]. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung eines neuartigen und wirksamen Impfstoffs gegen Tuberkulose, insbesondere für Jugendliche und Erwachsene.

Die Entwicklung eines TB-Impfstoffs wird durch mehrere Merkmale von Mykobakterien erschwert, wie z. B. latente Infektion, Persistenz und Immunumgehung [11–13]. Ein idealer TB-Impfstoff sollte so konzipiert sein, dass er auf die Proteine/Signalwege abzielt, die für diese Eigenschaften bei M. tuberculosis verantwortlich sind, und in der Lage ist, CD4 plus- und CD8 plus T-Zell-vermittelte Immunantworten effizient zu induzieren [14].

Darüber hinaus sollte ein wirksamer Impfstoff auch auf die Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) des Wirts abzielen, die hochgradig polymorph sind [15]. Diese Eigenschaften stellen sehr hohe Anforderungen an die Vielseitigkeit des Impfstoffs, die offensichtlich nicht durch ein einzelnes natürliches Protein erreicht werden können. Multi-Epitop-Impfstoff, ein rekombinantes Protein, das aus einer Reihe überlappender Epitope (Peptide) besteht [16], ist ein neuartiger Impfstoffkandidat, der die oben genannten Probleme lösen könnte.

In den letzten Jahren haben Multi-Epitop-Impfstoffe aufgrund ihrer Vorteile einer höheren Immunität und geringeren Allergenität gegenüber herkömmlichen Impfstoffen große Aufmerksamkeit erregt [17,18]. Derzeit wurden Multi-Epitop-Impfstoffe gegen viele pathogene Mikroorganismen entwickelt, darunter Shigella spp. [19], Maul- und Klauenseuche-Virus [20], Helicobacter pylori [21,22], Hepatitis-B-Virus [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah-Virus [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] und Leukosevirus [29].

Insbesondere das Auftreten der COVID{0}}-Pandemie hat die Anwendung dieser Technologie verstärkt [16,30–32]. Was Tuberkulose betrifft, wurden mehrere Multi-Epitop-Impfstoffe entwickelt, die auf inhärent aktive Tuberkulose [33–39] und latente Tuberkulose [40,41] abzielen. Unter ihnen wurden drei Impfstoffkandidaten in Form von DNA entworfen [34,36,40], und zwei von ihnen bauten Epitope in die Proteinrückgrate ein, um rekombinante Impfstoffe zu erzeugen [34,36].

Es ist zu beachten, dass die Kandidatenproteine ​​für einige der oben genannten Multi-Epitop-Impfstoffe zufällig ausgewählt werden und die Bevölkerungsabdeckung dieser Impfstoffe weiterer Studien bedarf.

Darüber hinaus wurden zwei Multi-Epitop-TB-Impfstoffkandidaten mit breiter Bevölkerungsabdeckung entwickelt. Ein Epitop wurde aus immunogenen Exosomen-Vesikelproteinen mit pathogenen Eigenschaften ausgewählt (39), und das andere Epitop konzentriert sich nicht auf Kandidatenproteine, sondern wählt direkt hochkonservierte und experimentell validierte aus Epitope aus der Immune Epitope Database (IEDB) [38]. Diesen Kandidatenproteinen fehlt jedoch die funktionelle Anreicherung, und die Fähigkeit der Impfstoffkandidaten, die Sekretion von Interferon (IFN-) zu induzieren, muss noch verbessert werden.

Eine frühere Studie kam zu dem Schluss, dass eine rationale Optimierung von Epitopen durch eine Kombination aus MHC-Bindungskapazität und der Fähigkeit des Epitops, mit T-Zell-Rezeptoren zu reagieren, erreicht werden kann [42]. Darüber hinaus sagten sie voraus, dass Impfstoffe mit den zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) A1-, A2-, A3-, A24- und B7-Bindungsepitopen eine Abdeckung von nahezu 100 Prozent in den wichtigsten ethnischen Gruppen (Schwarze, Asiaten, Hispanics und Kaukasier) erreichen würden.

Bisher gab es jedoch keinen vergleichbaren Ansatz zur Entwicklung eines Tuberkulose-Impfstoffs. In dieser Studie haben wir einen hochpromiskuitiven Multi-Epitop-TB-Impfstoff entwickelt, der verschiedene Antigenmerkmale von acht funktionsangereicherten Proteinen nutzt. Der chimäre Impfstoffkandidat besitzt 15 CTL-Epitope, 16 Epitope von Helfer-T-Lymphozyten (HTL) mit IFN- --induzierenden Eigenschaften und 10 lineare B-Zell-Epitope. Eine immuninformatische Analyse zeigte, dass dieser Impfstoffkandidat „allumfassend“ war, was ihn zu einem potenziellen Eckpfeiler für die Umsetzung der „End-TB-Strategie“ machte.

2. Materialien und Methode

2.1. Proteinauswahl und Sequenzabruf

Um einen Multi-Epitop-Impfstoff gegen Tuberkulose zu konstruieren, haben wir zunächst Proteine ​​des M. tuberculosis-Komplexes ausgewählt, die in der IEDB-Datenbank hinterlegt sind (43) und als MHC-Bindungsepitope der Klassen I und II validiert wurden. Aminosäuresequenzen (Primärstruktur) von Proteinen aus dem Stamm M. tuberculosis H37Rv wurden aus der UniProt-Datenbank erhalten (44). Ausrichtungsunabhängige Vorhersagen potenzieller Antigene auf der Grundlage physikalisch-chemischer Eigenschaften wurden vom VaxiJen 2.0-Server [45] erhalten, der eine automatische Kreuzkovarianztransformation (ACC) von Proteinsequenzen in einen einheitlichen Vektor der Hauptaminosäure durchlief Eigenschaften, wobei der Antigenitätsschwellenwert für jedes Bakterienprotein auf 0.4 festgelegt ist [45,46].

Die funktionelle Annotation von Proteinen wurde mithilfe der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) 6.8 bewertet [47]. Sekretierte Proteine ​​wurden anhand von zwei Kategorien weiter angereichert: extrazellulärer Raum und Pathogenese durch die Datenbanken DAVID und BioCyc [48]. Das Proteom von Homo sapiens GRCh38.p13 wurde im FASTA-Format aus der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) heruntergeladen (49). BLASTp wurde verwendet, um die Homologie (E-Wert =1e-5) zwischen sekretierten Proteinen und H. sapiens-Proteinen vorherzusagen.

2.2. Vorhersage des T-Zell-Epitops

Vorhersage und Auswahl von Epitopen sind entscheidende Schritte bei der Entwicklung von Multi-Epitop-Impfstoffen. MHC I-Moleküle binden kurze Peptide (9–11 Aminosäuren), da die Peptidbindungsspalte von MHC I-Molekülen, die aus einer einzelnen Kette bestehen, geschlossen ist [50]. Für die Vorhersage von CTL-Epitopen wurde das frei zugängliche NetMHCpan-4.1 [51] verwendet, das NNAlign_MA verwendet, um prozentuale Ränge (Prozentrang) basierend auf einer Kombination aus MHC I-Bindungsaffinitäten und eluierten Liganden zu generieren .

Die „prozentuale Rangfolge“ einer Abfragesequenz wurde durch Vergleich ihres Vorhersagewerts mit der Verteilung der Vorhersagewerte für den relevanten MHC ermittelt, die anhand eines Satzes zufällig ausgewählter nativer Peptide berechnet wurden. Epitope mit einer prozentualen Rangfolge von < 0,5 Prozent wurden als starke Bindemittel betrachtet, während Epitope mit einer prozentualen Rangfolge von < 2 % als schwache Bindemittel betrachtet wurden [51].

Obwohl auf dem Server bis zu 12 Supertyp-MHC-Klasse-I-Epitope vorhergesagt werden können, haben wir nur A1, A2, A3, A24 und B7 verwendet, da diese fünf Supertypen 100 Prozent der wichtigsten menschlichen Rassen abdecken [42] . Wir haben starke Bindemittel ausgewählt und ihre Antigenität mithilfe von VaxiJen2.0 vorhergesagt [45]. Anschließend haben wir die Immunogenität der Klasse I mithilfe der International Epitope Database (IEDB) [52] vorhergesagt, die eine {{12}-fache Kreuzvalidierung verwendet.

Schließlich ordneten wir Epitope, die sowohl antigen als auch immunogen waren, nach prozentualer Rangfolge und wählten 15 Epitope mit niedriger Bewertung aus, drei für jeden Supertyp und mindestens eines für jedes Kandidatenprotein, mit Ausnahme eines Kandidatenproteins, das kein starkes CTL-bindendes Epitop haben konnte das ist antigen und immunogen. Schließlich wurden IC50-Werte für jedes CTL-Epitop aus NetMHC-4.0 vorhergesagt [53].
MHC-Moleküle der Klasse II binden an antigene Peptide und der resultierende Komplex kann von HTL erkannt werden. Typischerweise haben antigene Peptide eine Länge von 12 bis 20 Aminosäureresten, aber auch Peptide mit einer Länge zwischen 13 und 16 Resten werden häufig beobachtet [54].

Die {{0}}-mere waren die am häufigsten vorkommenden MHC II-Epitope für M. tuberculosis und wurden im IEDB hinterlegt. Als Ergebnis verwendeten wir NetMHCIIpan-4.0 [51,55], um die Bindung von 15-mer-Peptiden an Human Leukozyten Antigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP vorherzusagen. und H-2–1-Allel. Die Vorhersage basierte auch auf NNAlign_MA mit einer prozentualen Rangfolge von < 2 Prozent bzw. < 10 Prozent, die als starke bzw. schwache Bindemittel angesehen wurden [51].

Außerdem haben wir 15-mer IFN-induzierende Epitope für Kandidatenproteine ​​mithilfe des IFNepitope-Servers vorhergesagt [56], der einen Support-Vector-Machine-Hybrid-Ansatz verwendet, der ein virtuelles Screening von IFN- --induzierenden Peptiden/Epitopen in einem Peptid ermöglicht Bibliothek bestehend aus IFN- -induzierbaren und nicht induzierbaren MHC II-Bindern, die T-Helferzellen aktivieren. Anschließend haben wir die Antigenität der IFN-induzierenden Epitope vorhergesagt [45] und schließlich die 16 promiskuitivsten Epitope ausgewählt, die eine starke MHC-II-Bindung, IFN-Induzierung und Antigen aufwiesen.

Es ist wichtig zu beachten, dass Signalpeptide vor der Epitopvorhersage aus den Kandidatenproteinen entfernt wurden. In dieser Studie wurden Signalpeptide mit SignalP 5.0 [57] und TargetP2.0 [58] gescreent.

2.3. Vorhersage des linearen B-Zell-Epitops

Lineare B-Zell-Epitope (16-mere) wurden mit ABCpred [59,60] mit einem Standardschwellenwert von 0.51 vorhergesagt. Um die Zuverlässigkeit der Vorhersageergebnisse zu erhöhen, haben wir außerdem BepiPred 2.0 [61] verwendet, um lineare B-Zell-Epitope vorherzusagen. Mit dieser beiden Software erhaltene Epitope wurden außerdem einer Antigenitätsvorhersage mit VaxiJen2.0 unterzogen (45). Schließlich wählten wir zehn lineare B-Zell-Epitope basierend auf hohen ABCpred-Scores und Antigenität aus, wobei für jedes Kandidatenprotein mindestens ein Epitop ausgewählt wurde.

2.4. Konstruktion des Multi-Epitop-Impfstoffkandidaten mit chimären Eigenschaften

Der entwickelte Multi-Epitop-Impfstoff enthält ein HBHA-Adjuvans (Heparin-bindendes Hämagglutinin), ein Pan-HLA-DR-bindendes Epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 lineare B-Zell-Epitope und einen His×6-Tag (Abb. 3). Linker wurden verwendet, um Epitope zu verbinden, die Produktion von Verbindungsepitopen zu verhindern und die Verarbeitung und Regeneration einzelner Epitope in chimären Impfstoffen zu verbessern [62].

Für die Konstruktion dieses Impfstoffkandidaten wurde das HBHA-Adjuvans (UniProt-ID: P9WIP9) am N-Terminus lokalisiert und über einen EAAAK-Linker mit dem nachgeschalteten PADRE verknüpft. Anschließend wurden die durch die GPGPG-Linker verbundenen HTL-Epitope mit PADRE verknüpft. Darüber hinaus wurden durch den AAY-Linker verbundene CTL-Epitope über den HEYGAEALERAG-Linker mit HTL-Epitopen verbunden, der die CTL-Epitopeinheit auch mit linearen B-Zell-Epitopen verband, die über KK-Linker verknüpft waren. Schließlich wurde ein Hisx-6-Tag an den C-Terminus des chimären Proteins angebracht.

2.5. Antigenität, Allergenität und physikalisch-chemische Eigenschaften

Die Antigenität des Mehrfach-Epitop-Impfstoffs und der acht Komponentenproteine ​​wurde vom VaxiJen 2.0-Server vorhergesagt [45], während die Allergenität dieser Proteine ​​vom AllerTOP 2.0-Server vorhergesagt wurde [ 63]. AllerTOP 2.0 verwendet Aminosäure-E-Deskriptoren, ACC-Transformation von Proteinsequenzen und k-nächste Nachbarn (kNN) zur Allergenklassifizierung.

Die Methode erreichte eine Genauigkeit von 85,3 Prozent mit {{2}facher Kreuzvalidierung. Für die Vorhersage physikalisch-chemischer Eigenschaften wie Halbwertszeit, isoelektrischer Punkt, Instabilitätsindex, aliphatischer Index und großer Durchschnitt der Hydropathie (GRAVY) dieses Mehrfachepitop-Impfstoffs wurde der ExPASy ProtParam-Server [64] verwendet.
Darüber hinaus wurde die Löslichkeit des Multi-Epitop-Impfstoffpeptids mithilfe des ProteinSol (PROSO II)-Servers [65] bewertet, basierend auf einem Klassifikator, der die subtilen Unterschiede zwischen den bekannten unlöslichen Proteinen von TargetDB und den löslichen Proteinen von TargetDB und PDB ausnutzt [ 66]. Bei der Auswertung mittels 10--facher Kreuzvalidierung wurde eine Genauigkeit von 71,0 Prozent erreicht (Fläche unter der ROC-Kurve=0,785).

2.6. Immunsimulation

Um das Immunantwortprofil und die Immunogenität des Impfstoffs zu charakterisieren, wurden In-silico-Immunsimulationen mit dem C-ImmSim-Server durchgeführt [67]. C-ImmSim sagt Immuninteraktionen mithilfe positionsspezifischer Bewertungsmatrizen voraus, die aus Techniken des maschinellen Lernens zur Peptidvorhersage abgeleitet wurden.
Es simuliert gleichzeitig drei Kompartimente, die drei separate anatomische Regionen von Säugetieren repräsentieren: (i) das Knochenmark, in dem hämatopoetische Stammzellen simuliert wurden, um neue Lymphozyten und myeloische Zellen zu produzieren; (ii) der Thymus, wo naive T-Zellen ausgewählt wurden, um Autoimmunität zu vermeiden; und (iii) das lymphatische Organ wie Lymphknoten.

Um den Impfstoff effektiv vorzubereiten und zu verstärken, folgten wir dem Ansatz von [68], bei dem zwei Injektionen im Abstand von vier Wochen verabreicht wurden. Alle Simulationsparameter wurden auf Standardwerte eingestellt, wobei die Zeitschritte auf 10 und 94 eingestellt waren (jeder Zeitschritt beträgt acht Stunden).

2.7. Vorhersage ungeordneter Regionen

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind in vielen Proteinen vorhanden. Die ungeordnete Region wurde mit DISOPRED3 vorhergesagt [69], das DISOPRED2 und zwei weitere auf maschinellem Lernen basierende Module verwendet, die auf großen IDRs trainiert wurden, um ungeordnete Reste zu identifizieren. Sie waren dann anno

2.8. Vorhersage der Sekundär- und Tertiärstruktur

Die Sekundärstruktur des entwickelten Impfstoffs wurde vom PSIPRED 4.0-Server vorhergesagt [70], der zunächst PSI-BLAST verwendet, um Sequenzen zu identifizieren, die eng mit dem Abfrageprotein verwandt sind. Die Tertiärstruktur dieses Impfstoffs wurde mithilfe des Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER)-Servers vorhergesagt [71].

Es gibt vier Schlüsselschritte bei der ITASSER-Modellierung; a) Identifizierung der Threading-Vorlage; b) iterative Strukturmontagesimulation; c) Modellauswahl und -verfeinerung; und d) strukturbasierte funktionale Annotation [72,73].

I-TASSER generierte fünf Modelle, die mit ProSA-web [74] gescreent wurden, und das Modell mit dem niedrigsten Z-Score wurde zur weiteren Verfeinerung ausgewählt. ProSA-web vergleicht die Modellwerte, die aus experimentell verifizierten, in PDB hinterlegten Strukturen erhalten wurden. Ein Diagramm der lokalen Qualitätsbewertung hilft dabei, problematische Bereiche im Modell zu identifizieren, und dieselben Bewertungen wurden mithilfe eines Farbcodes in der Darstellung der 3D-Struktur dargestellt. Dies ist nützlich für die frühe Strukturbestimmung und -verfeinerung.

2.9. Verfeinerung der Tertiärstruktur

Das von ITASSER gewonnene „grobe“ 3D-Modell des Impfstoffkandidaten wurde in zwei Schritten auf zwei Servern verfeinert; Zuerst mit ModRefiner [75], gefolgt von GalaxyRefine [76]. ModRefiner nutzt C-Spuren, um den Aufbau und die Verfeinerung von Proteinen zu beeinflussen, die durch zweistufige Energieminimierung auf atomarer Ebene erhalten werden.

Zunächst wurden die C-Spuren zum Aufbau der Hauptkette verwendet, gefolgt von der Verfeinerung von Seitenkettenrotameren und Grundgerüstatomen mithilfe physikalischer und wissensbasierter zusammengesetzter Kraftfelder. GalaxyRefine nutzt mehrere Vorlagen, um zuverlässige Kernstrukturen zu generieren, während unzuverlässige Schleifen oder Terminals durch optimierungsbasierte Modellierung generiert wurden.

2.10. Validierung der Tertiärstruktur

Die verfeinerte Struktur des Impfstoffkandidaten wurde durch Ramachandran-Diagramme validiert, die aus den Datenbanken PROCHECK (77) und MolProbity (78) erstellt wurden. Ramachandran-Diagramme bewerten die Rückgratkonformation von Proteinen, indem sie Aminosäurereste in zwei Bereiche einteilen: erlaubte und nicht erlaubte. PROCHECK nutzt die Stereochemie, um die Nettoqualität von Proteinstrukturen zu beurteilen, indem es sie mit den verfeinerten Strukturen bei derselben Auflösung vergleicht und dann Bereiche präsentiert, die einer weiteren Analyse bedürfen.

Molprobity validiert lokale und globale Makromolekülmodelle (Proteine ​​und Nukleinsäuren) anhand einer Mischung aus Röntgen-, NMR-, Computer- und KryoEM-Kriterien [79]. Die Leistungsfähigkeit und Empfindlichkeit zur Optimierung der Wasserstoffplatzierung und der Analyse aller Atomkontakte werden in einer aktualisierten Version der Kriterien für kovalente Geometrie und Torsionswinkel umfassend genutzt [80].

2.11. Diskontinuierliche B-Zell-Epitope

Diskontinuierliche B-Zell-Epitope in der nativen Proteinstruktur wurden mit ElliPro vorhergesagt [81]. ElliPro implementiert drei Algorithmen, um die Proteinform als Ellipsoid anzunähern, berechnet den Rest-Protrusionsindex (PI) und gruppiert benachbarte Reste basierend auf ihren PI-Werten. ElliPro stellt jedem Ausgabeepitop einen Score zur Verfügung, der als gemittelter PI-Wert für den Epitoprest beschrieben wird. Ein Ellipsoid mit einem PI-Wert von 0,9 besteht zu 90 Prozent aus den enthaltenen Proteinresten, während die restlichen 10 Prozent der Reste außerhalb des Ellipsoids liegen. Für jeden Epitoprest wird der PI-Wert aus dem Massenschwerpunkt des Rests berechnet, der außerhalb des größtmöglichen Ellipsoids liegt.

2.12. Molekulares Andocken chimärer Proteine

Das molekulare Andocken des entwickelten Impfstoffs (Ligand) an den Immunrezeptor Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) wurde mit Patchdock durchgeführt [82]. Die Top-10-Modelle wurden dann mit FireDock [83] verfeinert. PatchDock ersetzt die Connolly-Punktoberflächendarstellung der Moleküle durch konkave, konvexe und flache Patches.

Anschließend wurden die Modelle anhand der geometrischen Anpassung und der atomaren Auflösung bewertet. [82]. FireDock optimiert die Seitenkettenkonformationen und die Ausrichtung des starren Körpers und generiert basierend auf der Bindungsenergie die Ausgabe eines 3D-verfeinerten Komplexes [83]. Als Andockkomplex haben wir das erste Firedock-Modell ausgewählt, das auf globaler Energie basiert. Schließlich wurde die Bindungsenergie und der Dissoziationsgehalt innerhalb des Docking-Komplexes mithilfe des PRODIGY-Servers vorhergesagt [84].

2.13. Simulation der Molekulardynamik

Molekulardynamische Simulationen wurden an Proteinen unter Verwendung des schnellen und frei zugänglichen Webservers, des internen Koordinaten-Normalmodus-Analyseservers (iMODS) (85) durchgeführt, und konsistente und optimale Docking-Ergebnisse wurden vom PatchDock-FireDock-Server erhalten. In internen Koordinaten erzeugt die Normalmodusanalyse (NMA) kollektive Bewegungen, die für die makromolekulare Funktion entscheidend sind. iMODS präsentiert Mechanismen zur Erforschung dieser Modi als Vibrationsanalyse, Bewegungsanimationen und Morphing-Trajektorien, die nahezu interaktiv mit unterschiedlichen Auflösungen durchgeführt wurden [85].

2.14. Rückübersetzung, Codon-Optimierung und In-silico-Klonierung des Impfstoffs

Um den Impfstoffkandidaten effektiv in Escherichia coli-Zellen zu exprimieren, wurde cDNA in silico durch Codon-Optimierung und umgekehrte Übersetzung mit dem Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86] generiert.

Die Optimierung umfasste (i) die Vermeidung von Rho-unabhängigen Transkriptionsterminatoren, ii) die Vermeidung prokaryotischer Ribosomenbindungsstellen, (iii) die Vermeidung der Schnittstelle der Restriktionsenzyme NcoI und XhoI, die als N-terminale und C-terminale Restriktionsstellen für die Insertion von cDNA dient Vorlage des Impfstoffs und (iv) nur teilweise Optimierung zur Anwendung ortsgerichteter Mutagenese. Der Codon Adaptation Index (CAI) und der GC-Gehalt sagten die Qualität der cDNA mit einem Opal-Stoppcodon (TGA) voraus, das nach dem His×6-Tag eingefügt wurde. Anschließend wurde das optimierte DNA-Fragment des chimären Impfstoffkandidaten mithilfe des SnapGene-Tools in den Rückstrang von pET-28a( plus ) integriert [87].

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