Cistanche Herba hat eine antidepressive Wirksamkeit bei chronischem, unvorhersehbarem Stress

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Yang Li, et al

ABSTRAKT

Cistanche tubulosa, eine Art von Cistanches Herba, wurde kürzlich als Antidepressivum bei Ratten mit chronisch unvorhersehbarem Stress (CUS) bestätigt, indem es die Homöostase der Darmmikrobiota wiederherstellt. In diesem Artikel wollen wir das metabolische Profil von C. tubulosa in normalen und CUS-induzierten depressiven Modellratten in vitro und in vivo untersuchenCistanche tubulosa-Extrakt(CTE) wurde sowohl bei normalen als auch bei CUS-Ratten bewertet. Gleichzeitig wird der in vivo-Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)bei normalen und depressiven Ratten wurde auch im Rattenurin und -kot untersucht. Insgesamt 20 bzw. 26 Metaboliten wurden aus dem In-vitro- und In-vivo-Metabolismus bei normalen bzw. CUS-Ratten charakterisiert. CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde zu Aglykonen und Abbauprodukten von Phenylethanoidglykosiden (PhGs) und Iridoidglykosiden metabolisiert, sei es durch normale oder depressive Rattendarmmikrobiota in vitro. Phase-II-Metaboliten von Aglykonen und Abbauprodukten von PhGs und Iridoidglykosiden waren die Hauptmetaboliten im Rattenurin und -kot. Darüber hinaus war die metabolische Fähigkeit zur Erzeugung sekundärer Glykoside und Aglykone in der Darmmikrobiota von depressiven Ratten viel schwächer als in der Darmmikrobiota von normalen Ratten, was auf die gestörten Glykosidhydrolasen zurückzuführen ist, die von der Darmmikrobiota bei CUS-depressiven Ratten produziert werden. Die Ergebnisse dieser Studie legten den Grundstein für das Verständnis des Stoffwechselprozesses und des therapeutischen Mechanismus der antidepressiven Eigenschaft von CTE.

Schlüsselwörter: Cistanche tubulosa, DepressionStoffwechsel, In-vitro, In-vivo, Darmmikrobiota

1. Einleitung

Cistanches Herba ist offiziell als getrockneter Sukkulentenstamm von Cistanche deserticola (YC Ma) und C. tubulosa (Schrenk) registriert, der zur Behandlung von Niereninsuffizienz, Impotenz, weiblicher Unfruchtbarkeit, Morbidleucorrhoe, starker Metrorrhagie und seniler Verstopfung verwendet wird [1]. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass Cistanches Herba verschiedene biologische Aktivitäten wie Anti-Neurodegeneration, Immunregulation und Anti-Entzündung besitzt [2,3]. Unsere bisherigen Untersuchungen haben dies bestätigtCistanche tubulosa-Extrakt(CTE), die zu 48,6 Prozent aus Phenylethanoidglykosiden (PhGs), zu 6,9 Prozent aus Iridoidglykosiden und zu 2 0,0 Prozent aus Gesamtsacchariden bestehen, konnten depressive Symptome von durch chronischen unvorhersehbaren Stress (CUS) induzierten depressiven Ratten deutlich lindern Wiederherstellung der Homöostase der Darmmikrobiota [4]. Neuere Studien weisen darauf hin, dass Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von Depressionen assoziiert waren [5,6]. Die relative Häufigkeit der mikrobiellen Gattungen war bei CUSdepressiven Modellratten im Vergleich zu normalen Kontrollen deutlich gestört [7]. Bei depressiven Patienten waren auch die Diversität und der Reichtum der Darmmikrobiota signifikant verändert [8]. Darüber hinaus wurden verschiedene Verbindungen, darunter Phenylethanoidglykoside (PhGs) und Iridoidglykoside, als Hauptbestandteile von Cistanches Herba [2,3] angesehen, die leicht in ihre sekundären Glykoside und Aglykone, einschließlich Hydroxytyrosol (HT), 3, 4- Dihydroxyphenethyl, metabolisiert wurden Glykosid, deglykosylierte Geniposidinsäure usw. durch menschliche Darmmikrobiota. Diese Metaboliten werden leichter durch den Darm absorbiert und üben eine biologische Aktivität aus, die mit der Prototypkomponente übereinstimmt [9–11]. Daher glauben wir, dass während des Auftretens und der Entwicklung einer Depression die Störung der Darmmikroflorastruktur unweigerlich den Metabolismus oraler traditioneller chinesischer Arzneimittel (TCMs) im Magen-Darm-Trakt beeinflussen wird, zusätzlich zur Beeinflussung des physiologischen Zustands des Wirts. Die meisten vorhandenen Stoffwechseldaten von Cistanches Herba stammen aus Stoffwechselstudien an gesunden Tieren[12–15]. Daher wäre es von größerer klinischer Bedeutung, das metabolische Profil von CTE zu untersuchen(Cistanche tubulosa-Extrakt)im pathologischen Zustand bei der Aufklärung seiner bioaktiven Komponenten und dem Verständnis des Wirkungsmechanismus für seine antidepressive Wirksamkeit.

In der aktuellen Studie zielen wir darauf ab, die metabolischen Profile von CTE zu charakterisieren(Cistanche tubulosa-Extrakt)sowohl bei gesunden als auch bei CUS-induzierten depressiven Modellratten durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS). Magensaft, Darmflüssigkeit und Mikrobiota normaler und depressiver pathologischer Ratten wurden verwendet, um den Stoffwechselprozess von CTE zu simulieren(Cistanche tubulosa-Extrakt)im Gastrointestinaltrakt in vitro, unabhängig und sequentiell. In-vivo-Metaboliten werden auch nach oraler Verabreichung von CTE aufgeklärt(Cistanche tubulosa-Extrakt)bei normalen und CUS-Ratten. Diese Studie liefert neue Einblicke in den Metabolismus und die aktiven Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)für Depressionen.

2. Material und Methoden

2.1. Material

Getrocknete Stängel von C. tubulosa wurden aus dem Landkreis Hetian (Xinjiang, China) gesammelt. Die Belegexemplare wurden von Prof. Xiaobo Li authentifiziert und im Herbarium der School of Pharmacy der Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) hinterlegt. Die Extraktionsmethode wurde wie in unserer vorherigen Veröffentlichung [4] angegeben verwendet. DasCistanche tubulosa-Extrakt(CTE)-Proben wurden bei 4 Grad gelagert und vor der Verwendung mit sterilem Wasser wieder aufgelöst. Die sterilen Wasserlösungen des CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)Die Proben wurden dann durch eine 0.22-μm-Membran filtriert, und die Filtrate wurden in sterilen Röhrchen gesammelt.

Echinacosid wurde vom Labor von Dr. Pengfei Tu, Peking University (Peking, China) bereitgestellt. Acteosid, Isoacteosid, 2'-Acetylacteosid und Cistanosid A wurden von Sichuan Weikeqi Biological Technology Co., Ltd. (Chengdu, China) bezogen. Hydroxytyrosol, Kaffeesäure, 3,4-Dihydroxybenzolpropionsäure, 3-Hydroxyphenylpropionsäure und 3-Phenylpropionsäure wurden von Aladdin IndustrialInc. bezogen. (Shanghai, China). Die Reinheit jeder Komponente wurde durch HPLC-UV auf > 95 Prozent bestimmt. Acetonitril in HPLC-Qualität wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Entionisiertes Wasser wurde aus destilliertem Wasser unter Verwendung eines Milli-Q-Wasserreinigungssystems (Millipore, Bedford, MA, USA) hergestellt. Alle anderen verwendeten Reagenzien und Chemikalien waren von analytischer Qualität.

2.2. Tierversuche

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200 ± 20 g) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, China) beschafft und im Laboratory Animal Center der Shanghai JiaoTong University (Shanghai, China) untergebracht. Die Tiere wurden in Gruppen bei kontrollierter Raumtemperatur (25 ± 2 Grad, 55 ± 10 Prozent relative Luftfeuchtigkeit) mit einem 12:12-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Den Ratten wurde 1 Woche lang freier Zugang zu normalem Laborrattenfutter und Wasser gewährt. Die Einrichtungen und Protokolle für Tiere wurden von der Tierethikkommission der Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) genehmigt.

Nach einwöchiger Eingewöhnung wurden zwölf naive Ratten zufällig in zwei Gruppen (n=6), die Kontrollgruppe und die Gruppe mit chronisch unvorhersehbarem Stress (CUS) eingeteilt. CUS-Ratten wurden wie in unserem vorherigen Bericht [4] entwickelt, die einer Vielzahl von Stressoren ausgesetzt wurden: weißes Rauschen (100 dB) für 1 h, über Nacht schwache stroboskopische Beleuchtung (120 Blitze/min), Wasserentzug für 24 h, leer Wasserflaschen für 1 h (nach Wasserentzug), Nahrungsentzug für 24 h, körperliche Zurückhaltung (1−2 h), Zwangsschwimmen (5 min), verschmutzter Käfig für 24 h (200 ml Wasser in 100 g Sägemehlstreu), Schwanzkneifen ( 1 min), Schock für 30 min, Käfigneigung von 45 Grad für 24 h und Beleuchtung über Nacht (12 h). Stressoren wurden kontinuierlich und zufällig für 4 Wochen angewendet, eine detaillierte Anordnung ist in Tabelle S1 beschrieben. Nach 4 Wochen Stress wurden der Saccharosepräferenztest, der Open-Field-Test und der Novity-Suppressed-Feeding-Test wie zuvor beschrieben durchgeführt [4]. Der Umriss des CUS und des Verhaltenstests ist in Abb. S1 dargestellt. Nach Verhaltenstests wurden mindestens 4 Kotpellets von jeder Ratte erhalten und in sterile konische Röhrchen zur in vitro-Analyse von CTE gegeben(Cistanche tubulosa-Extrakt)Stoffwechsel.

2.3. Gastrointestinaler Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch normale und CUS-Ratten in vitro

2.3.1. Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in simulierten Magen- und Darmsäften

Fünfzig Milligramm CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurden zu 10 ml simuliertem Magensaft bzw. Darmsaft gegeben. Dann CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde bei 37 Grad für 4 h in Magensaft und 6 h in Darmsaft inkubiert. Die kultivierte Mischung (1 ml) wurde mit 3 ml wassergesättigtem n-Butanol sofort bei 0 und 4 h in Magensaft und bei 0 und 6 h in Darmsaft gequencht. Das Verarbeitungsverfahren der verwendeten Probe war wie zuvor beschrieben [9].

2.3.2. Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota

Frische Normal- und CUS-Rattenkotproben wurden zunächst mit dem 25-fachen Volumen GAM-Brühe vermischt und homogenisiert. Sedimente wurden durch Filtration durch drei Stücke Gaze entfernt. Die Suspension wurde dann bei 37 Grad in einem anaeroben Inkubator inkubiert, in dem die Luft durch ein Gasgemisch (H2 5 Prozent, CO2 10 Prozent, N2 85 Prozent) ersetzt wurde. Fünfzig Milligramm CTE wurden getrennt zu 5 ml normaler und CUS-Rattenkotsuspension zugegeben, und die Suspension wurde bei 37 Grad für 48 h inkubiert. Die kultivierte Mischung wurde entfernt und mit wassergesättigtem n-Butanol bei 0, 12, 24 und 48 h extrahiert. Das Probenverarbeitungsverfahren war wie zuvor beschrieben [9].

2.3.3. Sequenzieller Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch Magensaft, Darmsaft, normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota

Erstens 100 mg CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde zu 1{{10}} ml simuliertem Magensaft gegeben und 4 h bei 37 Grad inkubiert. Die gesamte Reaktion wurde mit dem 3-fachen Volumen an wassergesättigtem n-Butanol gequencht und bei 3000 U/min für 15 min zentrifugiert, gefolgt von Eindampfen des Überstands unter einem Stickstoffstrom Gas bei 37 Grad. Zweitens wurde der Rückstand in 0,4 ml sterilem Wasser wieder aufgelöst, zu 8 ml künstlichem Darmsaft gegeben und 6 h bei 37 Grad inkubiert. Die Probe mit Magensaft wurde auf die gleiche Weise hergestellt. Schließlich wurde der Rückstand in 0,3 ml sterilem Wasser wieder aufgelöst, zu 6 ml normaler bzw. CUS-Rattenkotsuspension gegeben und bei 37 Grad für 48 h in einem anaeroben Inkubator inkubiert. Ein Milliliter der Reaktion wurde durch 3 ml wassergesättigtes n-Butanol sofort bei 0 und 4 h in Magensaft, bei 0 und 6 h in Darmsaft und bei 0, 12, 24 und 48 h in Darmmikrobiota von Ratten gequencht . Die Probe wurde identisch CTE verarbeitet(Cistanche tubulosa-Extrakt)in künstlichem Magensaft.

2.4. Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch normale und CUS-Ratten in vivo

Jede Ratte in den beiden Gruppen wurde dann in einem individuellen Stoffwechselkäfig untergebracht. Nach nächtlichem Fasten, das nur freien Zugang zu Wasser ermöglichte, wurden allen Ratten 2 ml Wasser oral über eine Magensonde verabreicht. Von 0 h bis 12 h wurden von allen Ratten leere Urin- und Kotproben gesammelt. Weiterhin CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)(400 mg/kg) wurde per Magensonde verabreicht. Urin- und Kotproben wurden von 0 h bis 24 h gesammelt. Alle Urin- und Stuhlproben wurden sofort bei –80 Grad gelagert.

Urin- und Kotproben von normalen und CUS-Ratten wurden wie zuvor beschrieben vorbehandelt [12]. Alle resultierenden Proben wurden durch UPLC-Q-TOF-MS analysiert.

2.5. Analytische Methode

UPLC wurde auf einem Waters ACQUITY UPLC-System (WatersCorp., Milford, MA, USA) mit einer ACQUITY UPLC BEH C18-Säule (100 mm × 2,1 mm ID, 1,7 μm, Waters Corp.) durchgeführt. , USA) durch Gradientenelution unter Verwendung von {{10}},1 Prozent Ameisensäure, Acetonitril (A) und 0,1 Prozent Ameisensäure in Wasser (B) bei einer Flussrate von 0,4 ml/min . Das Gradientenprofil war: 0–5 min (A:5–20 Prozent), 5–7,5 min (A: 20–30 Prozent), 7,5–10 min (A: 30–70 Prozent), 10–11 min (A : 70–100 Prozent ) und wurde für 1,5 min gehalten. Der Gradient wurde in 0,5 min auf 5 % zurückgeführt und für den nächsten Durchlauf 2,5 min gehalten. Das Injektionsvolumen betrug 3 μl. Die Temperatur des Säulenofens wurde auf 35 Grad eingestellt.

Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines Waters Vion IMS-Massenspektrometers (Waters Corp., Milford, MA, USA) durchgeführt. Die Ionisierung wurde im negativen Elektrospray (ESI–)-Modus durchgeführt. Die MS-Parameter waren wie folgt: Kapillarspannung, –2,0 kV; Kegelspannung, 20 V; Quelltemperatur, 12 0 Grad; Desolvationstemperatur, 5 00 Grad; Gasströme von Konus und Desolvation, 50 bzw. 1000 l/h. Für eine genaue Massenmessung wurde Leucin-Enkephalin als Sperrmasse verwendet, um ein [M-H]-Ion (m/z 554,2615) zu erzeugen. Ein MSE-Experiment (Mass Spectrometry Elevated Energy) in zwei Scanfunktionen wurde wie folgt durchgeführt: Funktion 1 (niedrige Energie): m/z 50–1000, 0,25 s Scanzeit, 0,02 s Interscan-Verzögerung, 6 eV Stoßenergie; Funktion 2 (hohe Energie): m/z50–1000, 0,25 s Scanzeit, 0,02 s Verzögerung zwischen den Scans, Kollisionsenergierampe von 20–45 eV.

2.6. Datenverarbeitung

Die Daten wurden unter Verwendung der Software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) zur Identifizierung von Metaboliten innerhalb der durch MSE gesammelten Accuracymass-Vollscan-Rohdaten verarbeitet. Verbindungen wurden basierend auf genauer Masse identifiziert, Fragmente in Hochenergie-Massenspektrometrie. Der Intensitätsschwellenwert wurde auf 100,0 Zählungen festgelegt. Die Zielidentifikation, Fragmentübereinstimmungstoleranz und andere Parameter wurden automatisch eingestellt.

3. Ergebnisse

3.1. Verhaltensänderungen bei Ratten mit CUS-induzierter Depression

Die Ratten mit CUS-induzierten depressiven Symptomen wurden durch Verhaltenstests, einschließlich Saccharose-Präferenztest, Freilandtest und Novelty-Suppressed-Feeding-Test, bewertet. Student's t-Test ergab, dass die Saccharosepräferenz im Saccharosepräferenztest (p < 0,001),="" die="" zurückgelegte="" gesamtstrecke="" im="" open-field-test="" (p="">< 0,001)="" und="" die="" latenz="" zum="" essen="" im="" neuheitsunterdrückungsfütterungstest="" (p="">< 0,01)="" signifikant="" waren="" unterschiedlich="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" nach="" 4-wöchiger="" cus-behandlung="" (abb.="" 1).="" diese="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" das="" modell="" für="" chronischen="" unvorhersehbaren="" stress="" erfolgreich="" entwickelt="">

3.2. Charakterisierung chemischer Bestandteile von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)

Eine umfassende Analyse von Prototyp-Bestandteilen von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde mit UPLC-Q-TOF-MS durchgeführt. Insgesamt 27 Bestandteile von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurden entdeckt und vorläufig charakterisiert, darunter 20 PhGs, 5 Iridoide und Iridoidglykoside und 2 Oligosaccharide. Detaillierte Informationen, einschließlich Retentionszeit, genauer MS und MS/MS-Fragmentionen, sind in den Hintergrundinformationen (Tabelle S2) aufgeführt, um einen Einblick in die Struktur dieser chemischen Bestandteile zu geben. Das UPLC-Q-TOF-MS-Gesamtionenchromatogramm (TIC) von CTE ist in Abb. S2 gezeigt.

3.3. Gastrointestinaler Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch normale und CUS-Ratten in vitro

In dieser Studie wurden die potenziellen Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)von normalen und CUS-Ratten in vitro wurden von den TICs nachgewiesen und mit einer Kombination von Elementzusammensetzungen und MS/MS-Fragment-Massenspektren identifiziert, nachdem sie mit den Kontrollproben verglichen worden waren. Alle Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in simulierten Magen- und Darmsäften sind normale und CUS-Darmmikrobiota von Ratten in Tabelle 1 aufgeführt.

3.3.1. Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in simulierten Magen- und Darmsäften

Sieben Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in simuliertem Magensaft wurden vorläufig durch genaue Massen- und MSE-Fragmentinformationen identifiziert: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z 445,1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) und M18 (m/z623 .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglykosylierung, Dehydroxylierung, Dehydrierung und Isomerisierung wurden als die wichtigsten Stoffwechselwege für CTE im Magensaft angesehen. Es wurde festgestellt, dass M4 und M5 ein um 2 Da und 16 Da geringeres Molekulargewicht als ihre Prototypkomponente, Decaffeoylacteosid, aufweisen und somit als ihre dehydrierten bzw. dehydroxylierten Produkte identifiziert wurden. M12 wurde als ein Isomer von Echinacosid identifiziert, das die gleichen Ionen wie Echinacosid bei m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237 produziert.

Dieselben Metaboliten wurden nach CTE nachgewiesen(Cistanche tubulosa-Extrakt)Inkubation im Darmsaft. Es ist bemerkenswert, dass die Caffeoyl-Gruppe an der C-6′-Position in PhGs leicht durch Verdauungsenzyme im Darmsaft metabolisiert wurde, um seine Decaffeyl-Metabolite und Kaffeesäure zu produzieren.

3.3.2. Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota

Insgesamt 20 Metaboliten wurden von CTE biotransformiert(Cistanche tubulosa-Extrakt)in normalen Ratten-Darm-Mikrobiota wurden nachgewiesen und identifiziert (Abb. 2). Aus den Ergebnissen wurde beobachtet, dass PhGs zu Aglykonhydroxytyrosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) und Kaffeesäure (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min) abgebaut wurden, dann sie wurden weiter metabolisiert zu M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z 181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,35 min) und M11 (m/z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 min) durch Dehydroxylierung, Reduktion und Methylierung. Darüber hinaus sind die zentralen Stoffwechselwege, die direkte Metaboliten von PhG-Prototypenverbindungen aus CTE in normaler Darmmikrobiota von Ratten produzierten, Reduktion, Methoxylierung, Deglykosylierung, Decaffeoyl, Dehydrierung und Isomerisierung.

Nach Inkubation in CUS-induzierter Depression der Darmmikrobiota von Ratten, CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde durch die gleichen Stoffwechselwege wie normale Ratten in 20 Metaboliten umgewandelt.

3.3.3. Sequenzieller Metabolismus von CTE durch Magensaft, Darmsaft, normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota

Nach sequentieller Inkubation in Magensaft, Darmsaft, normaler und CUS-Ratten-Darmmikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde zu 14 Metaboliten metabolisiert (darunter 8 mit Magensaft, 7 mit Darmsaft, 11 mit normaler und 10 mit CUS-Ratten-Darmmikrobiota). Unter diesen waren M2(HT) und M11 (3-Hydroxyphenylpropionsäure, 3-HPP) die Endmetaboliten von PhGs nach aufeinanderfolgender Inkubation von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in Magensaft, Darmsaft und Darmmikrobiota. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den Metaboliten zwischen normalen und CUS-Ratten.

M8, M9, M14, M17, M19 und M20 wurden nur im unabhängigen Metabolismus von CTE durch normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota nachgewiesen. Bei diesen Metaboliten handelte es sich hauptsächlich um metabolische Zwischenprodukte, die bei der Untersuchung des sequentiellen Metabolismus von CTE vollständig zu Endmetaboliten metabolisiert wurden und daher schwer nachweisbar sind.

3.3.4. Unterschiede zwischen der Stoffwechselrate von CTE durch normale und CUS-Rattenintestinalmikrobiota

Um die Unterschiede zwischen der Stoffwechselrate von CTE aufzuklären(Cistanche tubulosa-Extrakt)Durch normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota wurden die relativen Gehalte von 27 Prototypverbindungen und 20 Metaboliten nach Inkubation mit Magensaft, Darmsaft, normaler und CUS-Ratten-Darmmikrobiota getrennt und nacheinander bestimmt (Tabellen S3 und S4). Die Ergebnisse zeigten, dass es zwar keine signifikanten Unterschiede zwischen CTE gab(Cistanche tubulosa-Extrakt)Metaboliten von normalen und depressiven Ratten wurde ein signifikanter Unterschied in ihren Stoffwechselraten beobachtet. Beispielsweise wurden C2 und C5 als 8--Epilogansäure oder ihr Isomer identifiziert. Sie wurden in normalen Proben innerhalb von 12 h Inkubation vollständig metabolisiert. In pathologisch deprimierten Darmmikrobiota von Ratten wurden sie jedoch nach 48-stündiger Inkubation vollständig metabolisiert. Es war offensichtlich, dass die Stoffwechselrate bei der normalen Ratte schneller war als bei der CUS-Ratte. Ähnliche Ergebnisse wurden von C18 (Isoacteosid) entdeckt. Darüber hinaus ist bemerkenswert, dass die Peakfläche von M12 (Isomerisierung von Echinacosid) und M16 (Isomerisierung von Tubulosid A) in normalen Proben viel größer war als die in CUS-Proben, was auf die Isomerisierungsreaktion von CTE hinweist(Cistanche tubulosa-Extrakt)war in der normalen Darmmikrobiota von Ratten häufiger als in der Darmmikrobiota von depressiven Ratten.

3.4. Metabolismus von CTE durch normale und CUS-Ratten in vivo

Durch den Vergleich biologischer Proben der CTE-behandelten Gruppe mit biologischen Blindproben wurden insgesamt 26 Metaboliten (Verbindung 1–26) von CTE gefunden(Cistanche tubulosa-Extrakt)innormale und CUS-Ratten wurden nachgewiesen (Tabelle 2). Typische UPLC-Chromatogramme von Urinproben von normalen und CUS-Ratten sind in Abb. 3 dargestellt.

3.4.1. Charakterisierung der Metaboliten von CTE in normalem und CUS-Raturin

Insgesamt 18 In-vivo-Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in normalen Rattenurinproben wurden vorläufig identifiziert. Abbaumetaboliten von PhGs, einschließlich HT und CA, und ihre weitere Sulfatierung (Verbindung 1, 2, 3, 5, 8 und 16), Methylierung (6, 21, 22 und 24) und Methoxylierung (13 und 14) waren die Metaboliten Hauptmetaboliten im normalen Rattenurin. Iridoidglykoside wurden durch Deglykosylierung leicht zu Aglykonen (23, 25 und 26) metabolisiert. Bemerkenswert ist, dass in der normalen Rattenurinprobe keine Prototypkomponente nachgewiesen wurde.

In der Urinprobe der depressiven Ratte wurden 22 Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurden erkannt und charakterisiert. Eine Prototypverbindung, 8-Epilogansäure, wurde in pathologischem Rattenurin nachgewiesen. Andere Metaboliten stimmten mit denen überein, die in normalem Rattenurin gefunden wurden, einschließlich sulfatierter Metaboliten (1, 2, 3, 8, 10 und 16), methylierter Metaboliten (6, 11, 19 und 22), methoxylierter Metaboliten (13 und 14) von HT und CA und Theaglykone von Iridoidglykosiden (25 und 26).

3.4.2. Charakterisierung der Metaboliten von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in normalem und CUS-Rattenkot

In dieser Studie wurde nur ein Metabolit (Verbindung 20, 3-HPP) von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde in normalem Rattenkot identifiziert. Die meisten PhGs wurden zuerst zu CA abgebaut und durchliefen folglich einen weiteren Metabolismus zu seinem mikrobiellen Hauptmetaboliten, 3-HPP. In der Kotprobe der CUS-Ratte wurden 3 Metaboliten vorläufig charakterisiert, darunter sulfatiertes 3-HPP (Verbindung 16) und sulfatiertes HT (Verbindungen 2 und 3).

3.4.3. Unterschiede zwischen In-vivo-Metaboliten von CTE bei normalen und CUS-Ratten

Nach oraler Gabe von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)zeigten die In-vivo-Metabolite offensichtliche Unterschiede bei gesunden und depressiven Modellratten. 21 Metaboliten (Verbindung 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 und 19–26) wurden sowohl in gesunden als auch in CUS-Rattenproben nachgewiesen. Verbindung 23 (deglykosylierte Geniposidinsäure) wurde nur in gesunden Rattenproben identifiziert, während die Verbindungen 4 (HT), 7 (8-Epilogansäure), 15 (3, 4-Dihydroxybenzolpropionsäure) und 18 ({{ 19}}HPP-Glucuronid-Konjugation) wurden nur in Rattenproben des CUS-Modells nachgewiesen. Zusammenfassend wurden Prototyp-Bestandteile nur in CUS-Ratten nachgewiesen, während mehr Phase-II-Metaboliten in normalen Ratten entdeckt wurden.

4. Diskussion

In dieser Studie wurden drei In-vitro-Inkubationsmodelle, darunter Magensaft, Darmsaft, normale und CUS-Ratten-Darmmikrobiota, unabhängig voneinander und nacheinander eingesetzt, um das gastrointestinale Stoffwechselprofil von CTE zu untersuchen(Cistanche tubulosa-Extrakt)in-vitro. Es wurde festgestellt, dass PhGs und Iridoidglykoside im CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurden durch CUS-induzierte depressive Darmmikrobiota von Ratten leicht zu ihren sekundären Glykosiden und Aglykonen metabolisiert. Danach in vivo Metabolismus von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in normalen und CUS-Ratten wurde ebenfalls verifiziert. Die vorgeschlagenen Stoffwechselwege für CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)in gesunden und CUS-induzierten depressiven Ratten sind in Abb. 4 gezeigt. PhGs, wie Echinacosid und Acteosid, wurden zu HT und CA metabolisiert, und CA wurde weiter zu seinem mikrobiellen Hauptmetaboliten, 3-HPP, metabolisiert. HT, CA und 3-HPP wurden dann zu ihren sulfatierten, methylierten und methoxylierten Metaboliten metabolisiert. Iridoidglykoside, einschließlich Geniposidinsäure, Kankanosid A und Kankanosid N, wurden durch Deglykosylierung zu ihren Aglykonen metabolisiert. Diese zeigten weiter, dass PhGs und Iridoidglykoside in CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurden bei CUS-Ratten leicht zu sekundären Glykosiden und Aglykonen metabolisiert. Diese Metaboliten weisen normalerweise eine bessere intestinale Resorption und Bioverfügbarkeit auf, um weiter in das Blut aufgenommen zu werden, um biologische Aktivität auszuüben [16–18]. Es ist anzumerken, dass die Isomerisierung für PhGs im Gastrointestinaltrakt vorherrschend war, relevante Metaboliten wurden identifiziert, nachdem sie mit der UPLC-Retentionszeit ihrer Prototypverbindungen verglichen wurden, basierend auf einem optimierten idealen UPLC-Gradientenprofil.

Kaffeesäure war das primäre Abbauprodukt von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)durch depressive pathologische Rattendarmmikrobiota. Frühere Veröffentlichungen berichteten, dass Kaffeesäure im erzwungenen Schwimmtest bei Mäusen antidepressive Wirkungen hervorruft. Sowohl der mRNA-Spiegel des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) im Frontalkortex als auch der TrkB-mRNA-Spiegel in der Amygdala waren nach dem erzwungenen Schwimmtest signifikant verringert, und die frühere Verringerung wurde durch Kaffeesäure signifikant gehemmt [19]. Hydroxytyrosol war das Aglykon von PhGs, das die Neurogenese und die kognitive Funktion schützt, indem es die stressinduzierte Herunterregulierung des neuralen Proteins BDNF verhindert [20]. Daher ist es notwendig, einigen bioaktiven Metaboliten (dh HT und CA), die nach oraler Verabreichung durch Darmmikrobiota umgewandelt werden, mehr Aufmerksamkeit zu schenken.

Außerdem belegen die vorliegenden Befunde, dass die metabolische Fähigkeit zur Bildung sekundärer Glykoside und Aglykone bei depressiven Darmmikrobiota von Ratten deutlich schwächer war als bei der Darmmikrobiota von normalen Ratten. Der Grund ist wahrscheinlich auf depressionsinduzierte strukturelle Veränderungen der Darmmikrobiota zurückzuführen, die zu einer verringerten Aktivität von Stoffwechselenzymen führen, die von Darmmikrobiota produziert werden [21]. Interessanterweise zeigte eine frühere Studie, dass der Bacteroidetes-Stamm die am häufigsten vorkommenden Glykosid-Hydrolase- und Polysaccharid-Lyase-Gene für die Glykosid-Hydrolyse und die Spaltung komplexer Kohlenhydrate mit einem Eliminierungsmechanismus kodiert [22]. Insbesondere Bacteroides spp. einschließlich B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis und B. xylanisolvens zeigte eine dominante Gesamtzahl von Genen, die GHs und PLs codieren. Die gleichen Eigenschaften besitzt auch Parabacteroides distasonis [22]. Unsere früheren Studien bestätigten, dass 28- Tag chronische unvorhersehbare Stressstimulation die relative Häufigkeit der Gattungen Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas und Weissella verringerte, während Ruminococcus und Deinococcus bei Ratten zunahmen [4]. Es ist bemerkenswert, dass Bacteroides und Parabacteroides die beiden am häufigsten vorkommenden mikrobiellen Taxa waren, die ungefähr 20 Prozent relativer Häufigkeit in normalen Ratten ausmachten. Nach der CUS-Behandlung waren die relativen Häufigkeiten von Bacteroides und Parabacteroides bei depressiven Modellratten stark auf etwa 5 Prozent gesunken. Daher wird dies unweigerlich zu einer Verringerung der Gesamtzahl von GH- und PL-Enzymen in CUS-Ratten führen und die deglykosylierte Reaktion durch CUS-depressive Darmmikrobiota nach oraler Verabreichung von CTE weiter stören(Cistanche tubulosa-Extrakt)bei Modellratten.

5. Schlussfolgerung

In der vorliegenden Studie wurde die UPLC-Q-TOF-MS-Technik etabliert und angewendet, um Metaboliten von zu screenen und zu identifizierenCistanche tubulosa-Extraktbei normalen und CUS-depressiven Ratten in vitro und in vivo. Die Ergebnisse zeigten, dass CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)wurde zu Aglykonen und Abbauprodukten von PhGs und Iridoidglykosiden sowohl von gesunden als auch depressiven Darmmikrobiota von Ratten metabolisiert. Nach oraler Gabe von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt), Phase-II-Metabolite von Aglykonen und Abbauprodukte von PhGs und Iridoidglykosiden wurden überwiegend im Rattenurin gefunden. Die metabolische Fähigkeit, sekundäre Glykoside und Aglykone in depressiven Ratten-Darmmikrobiota zu erzeugen, war viel schwächer als die in der Darmmikrobiota der normalen Ratte, was auf die ungeordneten Glykosidhydrolasen zurückgeführt wurde, die von der Darmmikrobiota in CUS-depressiven Ratten produziert wurden. Diese Studie bietet eine neue Perspektive für letztere Entwicklung von CTE(Cistanche tubulosa-Extrakt)als potenzielles Antidepressivum.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2017YFC1702400) unterstützt.

Anhang A. Ergänzende Daten

Ergänzende Daten zu diesem Artikel finden Sie online unter HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Aus: 'In-vitro- und in-vivo-Metabolismus vonCistanche tubulosa-Extraktbei normalen und chronisch unvorhersehbaren stressinduzierten depressiven RattenYang Li, et al

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

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