Ist der Zusammenhang des seltenen Rs35667974-IFIH1-Genpolymorphismus mit Autoimmunerkrankungen ein Fall von RNA-Epigenetik?

Visualisierung – AA, AP und EEE, Überwachung – EEE und Finanzierungsbeschaffung – EEE. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt. Abstrakt

Interferon, das mit dem Helikase-C-Domänen-enthaltenden Protein-1-Gen (IFIH1) induziert wird, kodiert für eine zytoplasmatische RNA-Helikase, auch bekannt als Melanoma Differentiation-Associated 5 (MDA5), eine RIG-1--ähnliche RNA-Helikase, die virale RNA erkennt und an angeborener RNA beteiligt ist Immunität durch Erkennung viraler RNA. Bei der Bindung an doppelsträngige (ds) RNA bildet MDA5 eine filamentöse Anordnung entlang der Länge der dsRNA und nutzt molekulare Signaturen, um anhand der Länge und Methylierung der dsRNA selbst von nicht-selbst zu unterscheiden. Seine Missense-Variante rs35667974 schützt vor Typ-1-Diabetes, Psoriasis und Psoriasis-Arthritis, ist aber auch mit einem erhöhten Risiko für Morbus Bechterew, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa verbunden. Um einen Einblick in die komplexe Rolle dieser Variante zu gewinnen, führten wir mithilfe von Molekulardynamiksimulationen eine Strukturanalyse von MDA5 im Komplex mit dsRNA durch.

Unsere Daten legen nahe, dass die Ile923Val-Mutation der Variante rs35667974 die Bindung an native dsRNA zwar nicht wesentlich beeinflusst, in Gegenwart einer 2′-O-Uridinmethylierung jedoch eine destabilisierende Wirkung zeigt. Somit führt das Vorhandensein einer 2′-O-Methylierung an der dsRNA zu einer Erkennungssignatur, die zu einer selektiven Verringerung der gesamten katalytischen MDA-Aktivität führt. Diese Studie stellt eine Bewertung der Rolle der gemeinsamen Variante rs35667974 des Autoimmunlocus IFIH1 dar, die Berichten zufolge zu einer selektiv verringerten katalytischen Aktivität des modifizierten MDA5-Phänotyps und infolgedessen zu einer verringerten negativen Rückkopplung auf die Zytokin- und Chemokinsignalisierung und einem selektiven Schutz vor Autoimmunität führt .

Die Helikase-C-Domäne ist ein wichtiges Enzymprotein, das die DNA-Doppelhelixstruktur aufwickeln kann. Es kann der DNA dabei helfen, die korrekte Replikation, Bearbeitung und Bereitstellung im Prozess der Zellreplikation, -reparatur und -transkription abzuschließen, und ist einer der Schlüssel zur normalen Funktion von Zellen. Gleichzeitig ist die Immunität ein sehr wichtiger Abwehrmechanismus im menschlichen Körper, der uns wirksam vor Krankheitserregern wie Bakterien und Viren schützen kann.

Studien haben gezeigt, dass die Helikase-C-Domäne eine wichtige Rolle bei der Immunität spielt. Erstens kann die Helikase-C-Domäne die Stabilität und Kodierungseffizienz von Genen gewährleisten, indem sie die normale Replikation, Reparatur und Transkription zellulärer DNA unterstützt und so die Immunität des menschlichen Körpers verbessert. Zweitens kann die Helikase-C-Domäne die Erkennung von Proteinheterogenitätsmolekülen durch Zellen fördern und die Signalübertragung des Immunsystems regulieren, wodurch die Abwehrfunktion des Körpers unterstützt wird. Beide oben genannten Methoden haben eine positive Rolle bei der Förderung der Aufrechterhaltung und Stärkung der Immunität gespielt.

Darüber hinaus liefert uns die eingehende Untersuchung der Beziehung zwischen der Helikase-C-Domäne und der Immunität wichtige Inspirationen für die Entdeckung neuer Medikamente zur Behandlung von Krebs und immunbedingten Erkrankungen. Die Entwicklung von Arzneimitteln und Gentherapien, die auf die Helikase-C-Domäne abzielen, kann die Widerstandskraft des Körpers gegen Krebs und andere immunbedingte Krankheiten verbessern und Patienten dabei helfen, die Behandlung und Genesung damit verbundener Krankheiten besser zu bewältigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Beziehung zwischen der Helikase-C-Domäne und der Immunität sehr eng ist und eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genstabilität, der Förderung der zellulären Immunität und der Unterstützung der Körperabwehr spielt. Es besteht die Hoffnung, dass wir durch entsprechende Forschungs- und Behandlungsmethoden die menschliche Immunität besser aufrechterhalten und stärken und ein gesünderes und besseres Leben für uns schaffen können. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir die persönliche Immunität stärken. Cistanche hat einen erheblichen Einfluss auf die Verbesserung der Immunität, da Fleischpaste reich an einer Vielzahl antioxidativer Substanzen wie Vitamin C, Vitamin C, Carotinoiden usw. ist. Diese Inhaltsstoffe können freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren. Stimulieren und verbessern Sie die Widerstandskraft des Immunsystems.

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Schlüsselwörter

Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) · Molekulares Modell · Interferon induziert mit Helikase C-Domäne 1 (IFIH1) · Melanomdifferenzierungsassoziiertes 5 (MDA5) · RNA-Methylierung.

Einführung

Gene und Mechanismen, die an Autoimmunerkrankungen beteiligt sind, von denen etwa 5 Prozent der Bevölkerung betroffen sind, sind noch immer unklar, aber die sich häufenden Daten deuten stark darauf hin, dass verschiedene Autoimmunerkrankungen einen gemeinsamen genetischen Hintergrund haben können, was auf die Existenz von Varianten hinweist, die bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen vorkommen (Zhernakova et al. 2009). Der Versuch, diese genetische Information in biologisch bedeutsame Mechanismen zu entschlüsseln, die zu Krankheiten führen, erfordert die Identifizierung ursächlicher Gene. Die Identifizierung krankheitsverursachender Varianten ist eine schwierige, aber notwendige Aufgabe bei dem Versuch, wirksame Methoden zur Krankheitsvorhersage, -prävention und -intervention zu etablieren (Biros et al. 2005).

Verschiedene Arten von RNA-Molekülen sind an der Regulierung mehrerer biologischer Prozesse beteiligt, darunter Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), microRNA (miRNA) und lange nichtkodierende RNA (lncRNA). RNA-Moleküle enthalten zahlreiche (mehr als 150) chemische Modifikationen (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Diese Modifikationen sind funktionell mit allen Stadien des RNA-Metabolismus verbunden, wie z. B. Struktur, Stabilität und Wechselwirkungen, und spielen eine entscheidende Rolle in mehreren biologischen Prozessen, wie z. B. der Modulation der Replikation von Viren und antiviralen Immunantworten (Machnicka et al. 2013). Unter diesen gehört die Ribosemethylierung zu den am weitesten verbreiteten Modifikationen in der RNA. 2′-O-Methyluridin kommt in rRNA, snRNA, snoRNA und tRNA von Archaeen, Bakterien und Eukaryota vor (Aučynaitė et al. 2018). Die Ribose-2′-Omethylierung erhöht die Hydrophobie von Nukleotiden und schützt sie vor der Wirkung von Nukleasen (Yildirim et al. 2014).
Es häufen sich Hinweise darauf, dass die 2′-O-Methylierung viraler RNA (2′OMe-RNA) eine wichtige Rolle bei der Umgehung zellulärer angeborener Immunantworten in den Wirtszellen spielt (Dimitrova et al. 2019). Züst und Kollegen haben gezeigt, dass 2‘-OMe viraler RNA zur Umgehung der Interferon (IFN)-vermittelten antiviralen Reaktion beitrug und dadurch die Virusreplikation förderte (Züst et al. 2011). Außerdem haben Vitali und Scadden vorgeschlagen, dass IU-dsDNA den MDA5-IFN-stimulierenden Signalweg unterdrückt (Vitali und Scadden 2010).

Interferon, das mit dem Helikase-C-Domäne-1-Gen (IFIH1) induziert wird, kodiert für eine zytoplasmatische RNA-Helikase, die auch als MDA5 (Melanom-Differenzierungs-assoziiertes Protein 5) bekannt ist, und ist ein RIG-I-ähnlicher Rezeptor (RLR), der eine antivirale Funktion bei der angeborenen Immunität ausübt durch den Nachweis viraler RNAs. MDA5 erkennt die 0.5–1 kb RNA-Duplex-Stammstruktur, die normalerweise während der picornaviralen Replikation gebildet wird und eine Immunantwort auf eine Virusinfektion vermittelt (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5 aktiviert beim Nachweis langer viraler doppelsträngiger RNAs (dsRNAs), die während der Replikation von Picornaviren erzeugt werden, den Typ-I-Interferon-Signalweg. Studien haben gezeigt, dass MDA5 ein Filament entlang der Länge der dsRNA bildet und die ATP-abhängige Filamentdynamik nutzt, um anhand der dsRNA-Länge zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterscheiden (Toro et al. 2015). Es wurde gezeigt, dass MDA5 durch die lokale Produktion von Zytokinen und Chemokinen an der Modulation des Crosstalks zwischen Zellen und dem angeborenen/adaptiven Immunsystem beteiligt ist.

Änderungen in der MDA5-Expression und/oder -Aktivität können Zellreaktionen auf dsRNA auslösen, ein Nebenprodukt der Virusreplikation (Colli et al. 2010). Es wurde auch gezeigt, dass die Mutation von mit der Flammenbildung assoziierten Resten zum Verlust der Filamentbildung und der MDA5--abhängigen Signalübertragung führt, mit Ausnahme eines Mutationspaars, das die Signalübertragung moderat verstärkt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ATP-unabhängige Mechanismen, d. h. eine stärkere RNA-Bindung und/oder eine stabilere Protein-Protein-Wechselwirkung, wahrscheinlich für die beobachtete Stabilität der MDA5-Filamentbildung in vitro und für eine höhere Signalaktivität in Zellen verantwortlich sind (Sohn und Hur 2016).

Smyth et al. (2006) und Nejentsev et al. (2009) beschrieben ein seltenes Allel des IFIH1-Gens, das Schutz vor Typ-1-Diabetes (T1D) verleiht. Dieser rs35667974 IFIH1-Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), bei dem sich konserviertes Isoleucin (Codon [ATT]) an Position #923 in Valin (Codon [GTT]) ändert, ist eine seltene Variante, da die Nebenallelfrequenz (MAF) C {{ 9}}.010031 (2655 Personen in einer Gesamtstichprobe von 264690) basierend auf TOPMED (Taliun et al. 2021) und C = 0.016267 (3343 Personen in einer Gesamtstichprobe von 205514) basierend auf ALFA (Phan et al al. 2020; Sherry et al. 2001). In Tabelle 1 wird die menschliche Biogeographie der Häufigkeit des Polymorphismus in verschiedenen Kontinentalregionen basierend auf den ALFA-Projektdaten (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001) dargestellt. Nachfolgende Studien bestätigten, dass dieses seltene Allel die gleiche Wirkung auf T1D, Psoriasis (PS) (Li et al. 2010) und Psoriasis-Arthritis (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017) hatte. Im Gegenteil, dieser SNP wurde als Risikofaktor für die Anfälligkeit für die Entwicklung von Spondylitis ankylosans (AS) (Ellinghaus et al. 2016) und Morbus Crohn (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017) in Verbindung gebracht ) und Colitis ulcerosa (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov et al. (2010) haben gezeigt, dass die Funktionsverlustmutationen E627X und I923V von MDA5 mit einer geringeren Poly(I:C)-induzierten Interferonproduktion in mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Typ-1-Diabetes-Patienten verbunden sind und daher vor T1D schützen. Es wird auch angegeben, dass im MDA5-Molekül die I923V-Aminosäuresubstitution in der Nähe eines H927-Rests liegt, der zur Bindung von dsRNA beiträgt (Yoneyama und Fujita 2008). Es wurde jedoch gezeigt, dass die MDA-Variante I923V eine normale Fähigkeit zur Bindung von dsRNA, aber eine um das 2,5--fache verringerte katalytische Aktivität aufweist (Shigemoto et al. 2009). Daher scheint dieser Polymorphismus die Nukleotidsäure-bindenden Eigenschaften dieser zytoplasmatischen RNA-empfindlichen Helikase nicht wesentlich zu beeinflussen, sondern verändert ihre Funktion durch einen noch unbekannten Mechanismus.

Es wurde ein Zusammenhang zwischen dem IFHI1-Polymorphismus und der Inzidenz einer Enterovirus-Infektion bei T1D sowie der Zusammenhang zwischen der MDA5-I923V-Variante und der Häufigkeit enteroviraler RNA bei T1D-Patienten gefunden (Looney et al. 2015). Darüber hinaus zeigten aktuelle Studien an MDA5-- und MAVSknockout-Mäusen eine entscheidende Rolle dieser Proteine ​​bei der Vermittlung von Typ-1-Interferon-Reaktionen gegen das Coxsackie-B-Virus (Wang et al. 2010). Es wurde gezeigt, dass ein Mengovirus-Leaderprotein die Expression von IFN- verhindert, indem es die Dimerisierung von IRF3 blockiert, die für die Aktivierung dieses Faktors erforderlich ist (Hato et al. 2007). Diese Beobachtung legt nahe, dass Varianten, die die IFIH1-Funktion in der antiviralen Reaktion des Wirts stören, negativ und nicht positiv selektiert wurden, weil sie Schutz vor T1D bieten (Crow 2011).

Chow et al. (2018) haben unter anderem die RIG-I-ähnlichen Rezeptoren ausführlich analysiert, während Brisse und Ly (2019) die Entwicklung und Speziation von MDA5 und seinem verwandten RIG-I ausführlich untersucht haben. Die Lage der veränderten Reste in oder in der Nähe der RNA-Bindungs- und ATP-Bindungsstellen oder der Filamentschnittstelle veranlasste uns zu der Hypothese, dass die beobachteten Mutationen die Stabilität des IFIH1-Filaments verbessern könnten, indem sie die intrinsische Affinität zwischen IFIH1 und dsRNA oder zwischen IFIH1 erhöhen Moleküle im Filament oder durch Verringerung der Effizienz der ATP-Hydrolyse und damit der Filamentzerlegungsrate (Rice et al. 2014).

Diese Arbeit stellt eine Strukturstudie der möglichen Rolle der gemeinsamen rs35667974-Variante des Autoimmunlocus IFIH1 dar, die Berichten zufolge zu einem gehemmten Funktionsphänotyp führt, der eine Ile923Val-Aminosäuresubstitution im IFIH1-Genproteinprodukt MDA5 kodiert. Letzteres ist ein biologisch plausibles ursächliches Kandidatengen, das von mehreren Krankheiten gemeinsam genutzt wird und die Kontrolle der lokalen Expression von Zytokinen und Chemokinen beeinflusst, die vor Autoimmunität schützen (Colli et al. 2010). Diese Arbeit zielt darauf ab, den unbekannten Mechanismus zu untersuchen, durch den die Ile923Val-Substitution die katalytische Aktivität von menschlichem MDA5 verringert. In dieser Studie untersuchten wir die Unterschiede in der Interaktion von MDA5 mit dsRNA zwischen nativer und der seltenen Variante Ile923Val bei der Auslösung des Entzündungsmechanismus. Dementsprechend wollten wir das dynamische Verhalten des menschlichen MDA5/dsRNA-Komplexes in einer wässrigen Umgebung in Gegenwart von Ile923 oder Val923 untersuchen, wenn Uracil 2′-O methyliert ist oder nicht. Diese Strukturanalyse seltener gemeinsamer genetischer Anfälligkeits- oder Schutzorte könnte Einblicke in unser Verständnis der Pathophysiologie von Autoimmunerkrankungen liefern und die Forschungsergebnisse könnten sich auf eine bessere Behandlung der untersuchten Krankheiten auswirken.

Materialen und Methoden

Sequenzabruf, phylogenetische Baumkonstruktion und positive Selektionsanalyse

Die Proteinsequenz von Homo sapiens (Sequenz-ID: NP_071451.2) wurde aus der UniProt-Datenbank (The UniProt Consortium 2021) abgerufen. Um speziesübergreifende Homologe zu finden, wurden BLAST-Suchen mit Mega BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) in der RefSeq- und NR-Proteindatenbank (sowie PDB und UniProt) unter Verwendung von Blastp (Protein-Protein BLAST) durchgeführt Standardparameter (Altschul et al. 1997). Zunächst wurden 1000 Homologe zu den menschlichen MDA5-Proteinen ausgewählt und eine artenübergreifende Selektion mit Schwerpunkt auf der C-terminalen Domäne, die die Sequenz rund um die menschliche I923V-Substitution enthält, wurde verwendet, um diese Variation in anderen Arten zu identifizieren. Clustal Omega, das Multiple-Sequence-Alignment-Programm (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) und der T-Cofee-Multiple-Sequence-Alignment-Server (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) wurden zur Durchführung von Proteinsequenz-Alignments verwendet und die Bioinformatik-Software der Unipro UGENE-Plattform (Okonechnikov et al. 2012) zur selektiven Visualisierung mehrerer Ausrichtungen.

Die evolutionäre Analyse wird verwendet, um Positionen auf den Proteinsequenzen zu identifizieren, die artenübergreifend stark konserviert sind, was auf strukturelle Bedeutung hinweist (Andreou et al. 2018). Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode (Nei und Kumar 2000) und des Tamura-Nei-Modells (Tamura und Nei 1993) mit 500 Bootstrap-Replikationen (Felsenstein 1985) erstellt. Die ersten Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch erhalten, indem Neighbor-Join- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix paarweiser Abstände angewendet wurden, die mithilfe des Tamura-Nei-Modells geschätzt wurden, und dann die Topologie mit dem überlegenen Log-Likelihood-Wert ausgewählt wurde. Die phylogenetische Analyse umfasste 52 homologe Nukleotidsequenzen (39 Orthologe und 13 Paraloge) des menschlichen IFIH1-Gens. Die enthaltenen Codon-Positionen waren 1. plus 2. plus 3. plus nichtkodierend. Der endgültige Datensatz enthielt insgesamt 3729 Positionen. Evolutionäre Analysen wurden mit dem Softwarepaket MEGA11 durchgeführt (Tamura et al. 2021).

Um festzustellen, ob sich das IFIH1-Gen adaptiv entwickelt hat, haben wir das Programm codeml im Softwarepaket PAML v4.9j verwendet (Yang 2007). Die Nukleotidsequenz und die entsprechende Proteinsequenz-Alignment-Datei wurden an PAL2NAL (Suyama et al. 2006) übermittelt, um die entsprechenden CODEML-Eingabe-Nucleotid-Alignment-Dateien zu erstellen. Die positiven Selektionsanalysen für die orthologen MDA5-Gene wurden unter Verwendung von Site- und Branch-Site-Modellen durchgeführt (Yang et al. 2005; Yang und Bielawski 2000). Das nicht-synonyme/synonyme Substitutionsratenverhältnis (ω=dN/dS) liefert ein Maß für den Selektionsdruck auf Aminosäureebene. Die Größe des Werts von dN/dS (ω) stellt die Auswahltypen dar: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 für positive Selektion (Yang et al. 2005). In CODEML wurden die Standortmodelle (M0, M1, M2, M3, M7 und M8) und Zweigstellenmodelle (Kladen A und C) ausgewählt, um die positive Auswahlanalyse durchzuführen (Bielawski und Yang 2004; Yang und Nielsen 2002). In den Standortmodellen wurde der Likelihood-Ratio-Test (LRT) verwendet, um die positive Selektion durch Vergleich der drei Modellpaare (M0/M3, M2/M1 und M7/M8) zu testen. Die Analyse wurde sowohl für die Volllängensequenz als auch für die C-Terminal Domain (CTD)-Sequenz durchgeführt.

Strukturanalyse und Molekulardynamiksimulationen

Die kryoelektronenmikroskopische (Kryo-EM) Struktur des hMDA5-dsRNA-Filaments in Gegenwart von ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) wurde als Modellsystem für die Molekulardynamik verwendet ( MD) Simulationen. Alle aufgelösten Proteinreste (307–1020), die 14 Basenpaare doppelsträngiger RNA (dsRNA) und das koordinierte Zink blieben erhalten, wohingegen fehlende Reste mithilfe des SWISS-MODEL-Servers modelliert wurden (Waterhouse et al. 2018). Kraftfeldparameter und Wasserstoffatome wurden mit dem XLEaP-Modul von AMBER 18 hinzugefügt (Case et al. 2005). Die AMBER-Kraftfelder f14SB (Maier et al. 2015) und f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) wurden für das Protein bzw. die RNA verwendet, mit den Parametern modrna08 (Aduri et al. 2007) für modifizierte Nukleoside. Die I923V-Mutation wurde in MDA5 durch manuelles Entfernen der Cδ-Methylgruppe von I923 eingeführt, während die modifizierte Ribose von U12 am 2′-O unter Verwendung des modrna08-Bibliotheksrests MRU methyliert wurde. Das Zinkion wurde mit den 4 Cysteinresten 907, 910, 962 und 964 unter Verwendung geeigneter Kraftfeldparameter gebunden, um eine tetraedrische Koordinationssphäre aufrechtzuerhalten (Zn-S-Bindungslängen von 2,35 Å mit 50 kcal·mol–1·Å–2). Kraftkonstanten und S-Zn-S-Winkel von 109,5 Grad mit 25 kcal·mol–1·rad–2).

Auf diese Weise haben wir vier Systeme für die MD-Simulationen vorbereitet: (i) die native MDA5-dsRNA, (ii) MDA5(V923)-dsRNA, (iii) MDA5-dsRNA(2′OMe) und (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Alle Systeme wurden in stumpfen oktaedrischen Lösungsmittelkästen aus voräquilibrierten TIP3P-Wassermolekülen mit einem Mindestpuffer von 1 0 Å um den Komplex herum solvatisiert, und dann wurde die erforderliche Anzahl an Gegenionen hinzugefügt, um eine Ladungsneutralisierung der Systeme zu erreichen. MD-Simulationen wurden mit der GPU-beschleunigten Version des PMEMD-Moduls (Salomon-Ferrer et al. 2013) in AMBER 18 und einem Zeitschritt von 2 fs durchgeführt. Die Temperatur wurde mit dem Langevin-Thermostat mit einer Kollisionsfrequenz von 1,0 ps–1 reguliert, während der Druck mit dem Berendsen-Barostat mit einer Druckrelaxationszeit von 1,0 ps reguliert wurde. SHAKE wurde verwendet, um Bindungen mit Beteiligung von Wasserstoffatomen auf eine Toleranz von 10–6 Å einzuschränken, wohingegen nicht gebundene Wechselwirkungen mit einer direkten Raumgrenze von 10 Å berechnet wurden.

Die Energieminimierung wurde zunächst für 1{{20}},000 Schritte mit Positionsbeschränkungen von 100 kcal·mol–1·Å–2 Kraftkonstante durchgeführt auf den Nichtwasserstoffatomen von MDA5–dsRNA. Das Lösungsmittel wurde dann durch kurze Simulationsrunden in den NVT- und NPT-Ensembles, 100 ps bzw. 400 ps, ​​bei 300 K und 1 atm äquilibriert, während die Beschränkungen für Nichtwasserstoffatome des gelösten Stoffes beibehalten wurden. Anschließend wurde eine Energieminimierung für 10 000-Schritte durchgeführt, jedoch mit Positionsbeschränkungen von 10 kcal·mol–1·Å–2 nur für die C-Atome von MDA5 und das Phosphatrückgrat der dsRNA. In 3 Sub wurden 1 ns lang allmählich entspannt (10,0, 1,0, 0,1 kcal·mol–1·Å–2), gefolgt von 9 ns uneingeschränkter Gleichgewichtseinstellung unter konstantem Druck. Nach diesen anfänglichen 10 ns der Äquilibrierung (die nicht in der Analyse verwendet wurden) wurden 100 ns Produktionssimulationen im NPT-Ensemble für jedes System bei 300 K und 1 atm durchgeführt, während alle 5,0 ps Schnappschüsse des Systems zur Analyse mit dem CPPTRAJ gespeichert wurden Modul von AMBER 18 (Roe und Cheatham 2013). Alle Abbildungen, die 3D-Modelle darstellen, wurden mit dem molekularen Grafiksystem PyMOL (Open-Source-Build Version 2.3) erstellt.

Ergebnisse

Phylogenetische Analyse der Ile923Val-Substitution von MDA5

Die Evolution und Speziation von MDA5 und seinem verwandten RIG-I werden ausführlich von (Brisse und Ly 2019) besprochen. Hier wurde die IFIH1-Evolution genutzt, um Konservierungselemente in der MDA5-Sequenz für den jeweiligen Polymorphismus zu definieren. Die Evolutionsanalyse ergab eine starke Sequenzkonservierung zwischen MDA5 verschiedener Spezies (984 von 1000 untersuchten Sequenzen haben Isoleucin an der äquivalenten Position von hMDA #923) in der RD/CTD-Domäne, was auf strukturelle/funktionale Bedeutung hinweist. Der Polymorphismus rs35667974 im Exon 14 des menschlichen Gens verursacht eine konservierte Aminosäuremutation an Position 923 von Ile nach Val in hMDA5. Es gibt jedoch weitere sechzehn entfernte Arten, bei denen die gleiche Position durch ein Valin besetzt ist (Abb. 1), was auf die Durchführbarkeit dieser Änderung zwischen den Arten in der RD/CTD-Domäne von MDA5 und der eng homologen RS/GY-Domäne der Isoformen X1 hinweist. X3- und DHX58-Helikasen (Abb. 2). Darüber hinaus zeigt die Sequenzausrichtung der Region um die hMDA-Position Nr. 923 (die CTD-Interaktionsschleife der MDAs) eine mäßig bis hoch konservierte Sequenz zwischen entfernten Arten, was auf die artenübergreifende funktionelle Bedeutung der Region hinweist.

Nachweis positiver Selektion

Um festzustellen, ob sich das IFIH1-Gen adaptiv entwickelt hat, wurden Standortmodelle und Branch-Site-Modelle verwendet, um eine positive Selektionsanalyse von Orthologen des gesamten Gens und der CTD-Domäne durchzuführen. In den Standortmodellen wurden keine positiven Selektionsstandorte für die CTD-Domäne identifiziert (Tabelle 2). M0 impliziert eine konstante Entwicklungsrate (ω=dN/dS=0.2) (Tabelle 2). Einige Stellen, die einer positiven Selektion unterzogen wurden, wurden mithilfe der M2-- und M8--Stellenmodellmethode für das gesamte Gen identifiziert (Ergänzungstabelle 1), jedoch nicht in den RNA-interagierenden Regionen und der CTD-Domäne. In den Standortmodellen beträgt ω (dN/dS).<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Insbesondere für das Branch-Site-Modell C für die CTD-Domäne (Suppl. Table 3) entwickeln sich 33 Prozent der Sites in der Kategorie ω0=0. 036. Da Standorte, die sich in dieser Kategorie entwickeln, nicht zwischen Zweigtypen unterscheiden, haben beide Zweigtypen den gleichen Wert von ω für Standorte in dieser Kategorie. Darüber hinaus entwickeln sich 55 Prozent der Standorte unter der Kategorie ω2. Diese haben jedoch ω-Werte, die vom Verzweigungstyp abhängig sind (ω20=0.25 und ω21=0). Auch für das Branch-Site-Modell C für die 39 orthologen MDA5-Gene (Suppl. Table 4) entwickeln sich 33 Prozent der Sites in der Kategorie ω0=0. 027. Andererseits entwickeln sich 41 Prozent der Websites unter der Kategorie ω2. Diese haben jedoch ω-Werte, die vom Verzweigungstyp abhängig sind (ω20=0.25 und ω21=15.32).

Strukturanalyse

Die durchgeführte Evolutionsanalyse zeigt, dass die Ile923Val-Substitution keine einzigartige Variante in der menschlichen Spezies ist, da Val auch in anderen Spezies an der MDA5-Sequenzposition vorkommt. MDA5 ist ein viraler doppelsträngiger RNA-Rezeptor (dsRNA), der aufgrund seiner ausgeprägten Spezifität für virale RNA eine Schlüsselrolle bei der antiviralen Immunität spielt (Wu et al. 2013). Es wurde gezeigt, dass die 2′-O-Methylierung viraler mRNA für angeborene Immunantworten wichtig ist. Daher wurde vermutet, dass die 2′-O-Methylierung eine molekulare Signatur für die Unterscheidung zwischen eigener und nicht-eigener mRNA ist. (Zust et al. 2011). Um die mögliche Rolle der Ile923Val-Substitution in der Missense-IFIH1-Variante rs35667974 zu untersuchen, analysierten wir die kryoelektronenmikroskopische (Kryo-EM)-Struktur des MDA5-dsRNA-Filaments in Gegenwart von ATP (PDB-ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Position 923 befindet sich auf der Schleife 921–927, die direkt mit der dsRNA interagiert (Abb. 3A). Insbesondere befindet sich Ile923 4,8 Å von 2′-ΟΗ von Uridin U12 entfernt und ihre Wechselwirkung wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem benachbarten His927 und der Uracilbase stabilisiert. Es ist nicht zu erwarten, dass die Substitution von Ile923 durch Val in der Variante rs35667974 zu sterischen Konflikten führt, sondern dass Wechselwirkungen mit 2′-ΟΗ von Uridin U12 minimiert werden (Abb. 3B). Falls RNA an der Ribose von U12 methyliert ist, zeigt die natürliche MDA5-Variante mit Ile923 einen günstigen Van-der-Waals-Kontakt mit einer 2′-OMe-Gruppe von U12 bei 3,6 Å (Abb. 3C), wohingegen Val923 der rs35667974-Variante dies tut liegt bei 5,0 Å (Abb. 3D). Diese Unterschiede können nicht per se auf einen größeren Effekt der Ile923Val-Substitution schließen lassen; Allerdings führen subtile strukturelle Veränderungen oft zu erheblichen funktionellen Veränderungen durch Störung der strukturellen Dynamik des Systems.

Berechnungen der Molekulardynamik

Um die Auswirkung der I923V-Mutation von MDA5 auf ihre Interaktion mit dsRNA, sowohl nativer als auch 2′-Ο-methylierter, zu untersuchen, haben wir Molekulardynamiksimulationen von 4 Systemen auf der 100-ns-Zeitskala eingesetzt. Die Dynamik der Systeme wurde anhand der quadratischen Mittelfluktuationen (RMSF) jedes Proteinrests und des Wasserstoffbrückenbindungsabstands von H927 mit U12 überwacht (Abb. 4). Unsere Berechnungen legen nahe, dass die Mutation von I923 zu V923 in MDA5 zu einer geringfügigen Störung der Dynamik innerhalb der RNA-Kontaktregion (Reste 923–934) und der Interprotein-Interaktionsschleife (950–955) des Komplexes mit nativer dsRNA führte (Abb. 4C). . Diese Beobachtung war im Fall der 2′-O-Methylierung in U12 ähnlich, obwohl ein ausgeprägterer Effekt in der Gesamtdynamik der carboxyterminalen Region der MDA5-V923-Mutante beobachtet wurde (Abb. 4D).

Betrachtet man nun die wichtige Wasserstoffbrückenwechselwirkung des benachbarten H927-Restes mit der Uracilbase, legen unsere MD-Simulationen nahe, dass die Methylierung an 2′-O diese im nativen MDA5 nicht beeinflusst (Abb. 4E). Die V923-Mutation beeinflusst jedoch nicht die Wasserstoffbindung von H927 in der nativen dsRNA, zeigte jedoch in Gegenwart einer 2′-O-Methylierung eine destabilisierende Wirkung (Abb. 4F). Zusammengenommen legen unsere MD-Simulationen nahe, dass die Auswirkung der I923V-Mutation von MDA5 auf die Wechselwirkung mit nativer dsRNA zwar marginal ist, ihre Auswirkung auf die Dynamik und Stabilität des MDA5/RNA-Komplexes jedoch signifikanter ist, wenn Uracil 2′-O-methyliert ist .

Diskussion

Diese Studie stellt eine evolutionäre und strukturelle Untersuchung der Rolle der gemeinsamen rs35667974-Variante des Autoimmunlocus IFIH1 dar, die Berichten zufolge zu einem modifizierten Funktionalitätsphänotyp für MDA5 führt (Downes et al. 2010). Die Anwendung von Evolutionsstellen- und Verzweigungsstellenmodellen zur Durchführung einer positiven Selektionsanalyse weist darauf hin, dass es an den RNA-Interaktionsstellen, an denen sich der Polymorphismus rs35667974 befindet, keine positiven Selektionsstellen gibt. Keines der Branch-Site-Modelle weist darauf hin, dass bestimmte Standorte im CTD-Bereich einer positiven Selektion unterzogen wurden.

Dies steht im Einklang mit der sehr geringen Häufigkeit des Auftretens der Ile923Val-Variante selbst in der menschlichen Bevölkerung (Tabelle 1). Dennoch weist die europäische Bevölkerung im Vergleich zu den anderen einen Unterschied in der Häufigkeit des C-Allels von einer Größenordnung auf. Ohne die geringe Stichprobengröße außer Acht zu lassen, zeigt die geografische Verteilung des untersuchten Polymorphismus, dass sein Auftreten in der europäischen Bevölkerung als Ausgangspunkt auf veränderte Lebensbedingungen und Ernährung in den letzten Jahren zurückzuführen sein könnte. Die strukturelle Untersuchung der Rolle des untersuchten SNP erfolgte durch Untersuchung der Struktur des dsRNA-MDA5-Komplexes (nativ und mutiert).

Auf der Ebene der Bildung des dsRNA-MDA5-Komplexes beeinflusst die Einführung der Ile923Val-Mutation die Wechselwirkung der C-terminalen Domäne (CTD) des Proteins mit der dsRNA durch die Einführung eines hydrophoben Hohlraums neben dem Ribosezucker des Einstrangs der dsRNA . Wir haben gezeigt, dass im Fall von methylierter RNA an der Phosphoribosylkette des einen Strangs weitere dynamische Effekte die Interaktion der Mutante beeinflussen können, ohne den Wildtyp zu beeinflussen. Dies steht im Einklang mit experimentellen Studien (Looney et al. 2015; Brisse und Ly 2019), die zeigen, dass der Effekt des Ile923Val-Polymorphismus, der in der Nähe eines MDA5-dsDNA-Wechselwirkungspunkts identifiziert wurde, die nativen dsRNA-Bindungseigenschaften möglicherweise nicht beeinflusst, sondern dadurch verändert wird 2.5-fache Reduzierung der katalytischen Aktivität (Shigemoto et al. 2009). Außerdem haben die molekulardynamischen Studien die entscheidende Rolle der Methylierung in der Mutante für die Mobilität und Stabilität der MDA5-Schleifen 941–959 und 970–977 gezeigt, die an der dsRNA-Wechselwirkung und der Interprotein-Wechselwirkung bei der MDA-Filamentbildung beteiligt sind. Solche Effekte können die MDA5-Filamentanordnung, die MDA5-MAVS-Assoziation und die MAVS-Filamentanordnung behindern, die die Expression der Typ-I-Interferon-Gene (IFN1: IFN und IFN) weiter aktivieren. Bei T1D und PsA schützt daher eine verringerte Aktivität des MDA5-Proteins und damit eine geringere IFN-Produktion vor Autoimmunität. Diese Beobachtungen legen nahe, dass mehrere IFIH1-Varianten, von denen vorhergesagt wird, dass sie die Interaktion von MDA5 mit MAVS und die Verringerung der IFN-Produktion beeinflussen, das Krankheitsrisiko verringern würden, während mit ihnen eine normale MDA5-Funktion verbunden ist (Shigemoto et al. 2009).

Dies lässt den Schluss zu, dass wie im Fall der viralen RNA die Selbst-dsRNA-Methylierung, eine RNA-identifizierte Mutation, ein wichtiger Selektions-/Aktivierungsfaktor für die Einführung schützender Wirkungen bei einigen Autoimmunerkrankungen ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie erweitern das Wissen über die biologische Bedeutung des SNP rs35667974 des IFIH1-Locus bei der Entwicklung der oben genannten Krankheiten und unterstreichen die Bedeutung von Studien zu gemeinsamen Genen mehrerer Autoimmunerkrankungen. In Populationsstudien zur genetischen Assoziation von SNPs mit Autoimmunerkrankungen, beispielsweise unter Verwendung von PCR-RFLPs, Sequenzierung oder Genotypisierungschips, wird ein Fall von RNA-Methylierung jedoch nicht berücksichtigt. Daher ist es wichtig, den Methylierungszustand der interagierenden dsRNA und ihre Wirkung auf das Allel MDA5 zu kennen. Wie im Fall der viralen dsRNA-Erkennung (Wu et al. 2013) und der Unterscheidung zwischen Selbst- und Nicht-Selbst-mRNA (Züst et al. 2011) ist der Verlust einer Methylgruppe aus dem interagierenden MDA5, wie im Fall der Die Mutante Ile923Val MDA5 kann die Filamentbildung und die Induktion von Typ-I-Interferon beeinflussen.

Bemerkenswert ist, dass Plenge et al. (2013) hatten zuvor das Potenzial einer seltenen Variante in einem ursächlichen Krankheitsgen diskutiert, ein mutmaßliches therapeutisches Ziel für pharmazeutische Interventionen darzustellen. Zu diesem Zweck muss die biologische Funktion der verursachenden Variante bekannt sein, um genetische Erkenntnisse mit einem neuen therapeutischen Ziel zu verknüpfen. Daher scheint die Lokalisierung der Position einer verursachenden Variante in der 3D-Struktur des jeweiligen Proteins und die Untersuchung ihrer Rolle aus struktureller/funktioneller Sicht in einem pathogenetischen Weg, der zu einer Autoimmunerkrankung führt, von entscheidender Bedeutung für die weitere Behandlung und bessere Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu sein die Patienten. Es besteht nach wie vor ein dringender Bedarf, über die Entdeckung assoziierter SNPs hinaus ein tieferes Verständnis der ursächlichen Varianten zu erlangen, um die molekularen Mechanismen und Krankheitswege aufzuklären. Weitere strukturell-funktionale Analysen sind erforderlich, um die Bindung von Ribose-2′-Ο-methylierter Selbst-dsRNA an MDA5 und die Auswirkungen auf die MDA5-Fibrillenanordnung zu untersuchen. Die schwer fassbare biologische Rolle der 2′-Ο-methylierten mRNA als Sensor zur Unterscheidung zwischen viraler und eigener mRNA bei der Induktion von Typ-I-Interferon könnte bei bestimmten Autoimmunerkrankungen auf einen Schutzsensor ausgeweitet worden sein.

Abschluss

Der seltene rs35667974-IFIH1-Genpolymorphismus schützt vor T1D, PS und PsA, während das IFIH1-Allel, das von der Mehrheit der Bevölkerung getragen wird, für die Krankheiten prädisponiert. Die Annahme, dass das mutierte Ile923Val-MDA5 bei der Interaktion mit selbst-dsRNA und insbesondere mit 2′-O-methylierter anders funktioniert, legt nahe, dass in einigen Fällen Varianten, die mit methylierter dsRNA interagieren, die MDA5-Filamentbildung, die MAVS-Interaktion und die Filamentbildung stören Möglicherweise wurde die IFN-Signalübertragung, wie auch bei der antiviralen Reaktion des Wirts, negativ ausgewählt, da sie Schutz vor Krankheiten bietet.

Autorenbeiträge

Konzeptualisierung – AA, AP, EEE und GNG, Methodik – AA, AP und EEE, Validierung – AA, AP, MIZ, GNG und EEE, Untersuchung – GNG, AA, AP und MIZ, Ressourcen – GNG, AA, AP und MIZ, Datenkuration – AA und AP, Schreiben und Vorbereitung des Originalentwurfs – EEE, GNG, AA, AP und MZ, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten des Manuskripts – AA, AP, MZ, GNG und EEE, Visualisierung – AA, AP und EEE, Überwachung – EEE und Finanzierungsbeschaffung – EEE. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung

Die Open-Access-Finanzierung erfolgt durch HEAL-Link Griechenland. Diese Arbeit wurde durch das Projekt „INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization“ (Grant MIS 5002550) unterstützt, das im Rahmen der Aktion „Stärkung der Forschungs- und Innovationsinfrastruktur“ umgesetzt wird. gefördert durch das Operationelle Programm „Wettbewerbsfähigkeit, Unternehmertum und Innovation“ (NSRF 2014–2020) und kofinanziert von Griechenland und der Europäischen Union (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung).

Datenverfügbarkeit

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Erklärungen

Interessenkonflikt

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Sammlung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Verfassen des Manuskripts oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Ethische Anerkennung

Unzutreffend.

Einwilligung zur Teilnahme

Unzutreffend.

Einwilligung zur Veröffentlichung

Unzutreffend.

Offener Zugang

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