JAK-Inhibitor blockiert COVID-19-Zytokin-induzierte JAK-STAT-APOL1-Signalisierung in glomerulären Zellen und Podozytopathie in menschlichen Nierenorganoiden

Abstrakt

Ursachen einer COVID-19-InfektionZusammenbruch glomerulärer KapillarenUndVerlust von Podozyten, endend in aschwere NierenerkrankungangerufenCOVID-19-assoziierte Nephropathie(COVAN). Der zugrunde liegende Mechanismus von COVID-19 ist unbekannt. Wir stellten die Hypothese auf, dass durch COVID-19 induzierte Zytokine die Expression von pathogenem APOL1 über die JAK-STAT-Signalisierung auslösen, was zum Verlust von Podozyten und zum COVAN-Phänotyp führt. Hier haben wir anhand von neun durch Biopsie nachgewiesenen COVAN-Fällen zum ersten Mal gezeigt, dass APOL1-Protein wird reichlich in Podozyten exprimiert undglomeruläres EndothelZellen (GECs) von COVAN-Nieren, jedoch nicht in Kontrollen. Darüber hinaus trug die Mehrheit (77,8 %) der COVAN-Patienten zwei davonAPOL1Risikoallele. Wir haben gezeigt, dass rekombinante Zytokine, die durch SARS-CoV-2 induziert werden, synergistisch wirken, um voranzutreibenAPOL1Expression über den JAK-STAT-Weg in primären menschlichen Podozyten, GECs undNieren-Mikroorganoideabgeleitet von einem Träger von zweiAPOL1Risikoallele, wurden jedoch durch den JAK1/2--Inhibitor Baricitinib blockiert. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Zytokin-induzierte JAK-STAT-APOL1-Signalisierung die Lebensfähigkeit von Nieren-Organoid-Podozyten verringert, aber durch Baricitinib gerettet werden konnte. Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse die Schlussfolgerung, dassCOVID-19-induzierte Zytokineausreichen, um die COVAN-assoziierte Podozytopathie über die JAK-STAT-APOL1-Signalisierung voranzutreiben, und dass der JAK-Inhibitor diesen pathogenen Prozess blockieren könnte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass JAK-Inhibitoren therapeutische Vorteile bei der Behandlung der Zytokin-induzierten APOL1-vermittelten Podozytopathie haben könnten.

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Einführung

Nierenversagen ist eine verheerende KomplikationCOVID-19-Infektion. Bis zu 50 % der stationären und 70 % der COVID{2}}-Einweisungen auf die Intensivstation werden durch eine akute Nierenschädigung (AKI) erschwert, was wiederum die Mortalität um 30-50 % erhöht (1, 2). Eine Fallserie einer Nierenbiopsie ergab, dass eine kollabierende Glomerulopathie die häufigste histopathologische Diagnose bei COVID-19-assoziiertem AKI ist (3). Ein besonderes Merkmal der COVID-19-assoziierten kollabierenden Glomerulopathie (abgekürzt COVAN) ist ihre nahezu ausschließliche Vorliebe für Afroamerikaner oder Schwarze, die zwei Risikoallele von Apolipoprotein L1 (APOL1) tragen (3, 4). Die beiden Risikoallele (mit den Namen G1 und G2) entstanden als kodierende Varianten im APOL1-Gen und verleihen Schutz gegen afrikanische Trypanosomiasis. Allerdings erhöht der Träger von G1G1, G2G2 oder G1G2 (sogenannte Hochrisiko-Genotypen) das Risiko einer Reihe von Nierenerkrankungen und erklärt einen Großteil des erhöhten Risikos einer nicht-diabetischen Nierenerkrankung bei Afroamerikanern (5-8). Schätzungsweise 13 % der Afroamerikaner tragen Hochrisiko-APOL1-Genotypen (7). Während der COVID{30}}-Pandemie ergaben Studien, dass bemerkenswerte 92 % der durch Biopsie nachgewiesenen COVAN-Fälle Träger von Hochrisiko-APOL1-Genotypen waren, von denen 61 % bei der Vorstellung eine Dialyse erforderten (3, 9). Diese Ergebnisse belegen, dass APOL1-Varianten einen wesentlichen Anteil an der Rassenungleichheit bei den Gesundheitsergebnissen von COVID-19 haben. Trotz dieser beeindruckenden Assoziation bleibt der zelluläre Mechanismus, der Hochrisiko-APOL1-Genotypen mit einer SARS-CoV-2-Infektion verbindet, und die Pathogenese der kollabierenden Glomerulopathie von COVAN unbekannt.

Der starke epidemiologische Zusammenhang zwischen dem Hochrisiko-APOL1-Genotyp und COVAN hat zu der Hypothese geführt, dass die durch COVID-19-induzierte Expression von APOL1 G1 oder G2 in Podozyten und glomerulären Endothelzellen – den Nierenzellen, die von der kollabierenden Glomerulopathie betroffen sind – die Pathogenese von beschleunigt COVAN. Diese Hypothese wurde durch aktuelle Berichte gestützt, dass die transgene Überexpression von APOL1-Risikoallelen in Mauspodozyten oder glomerulären Endothelzellen Podozytopathie, Endotheliopathie, Glomerulopathie und klinische Manifestationen von Nierenversagen verursachte (10-14). Diese murinen Krankheitsmodelle legen nahe, dass der Mechanismus, der der durch COVID-19-induzierten APOL1-Expression zugrunde liegt, ein potenzielles therapeutisches Ziel für COVID-19 wäre. Es gibt jedoch zwei wichtige Unbekannte. Erstens ist nicht bekannt, ob die APOL1-Proteinexpression in den Glomeruli von Patienten mit COVAN hochreguliert ist. Zweitens ist nicht bekannt, ob SARS-CoV-2 die APOL1-Expression direkt durch eine Virusinfektion von Nierenzellen oder indirekt über die Auswirkungen eines SARS-CoV-2-induzierten Zytokinsturms induziert.

Der Fehler beim Nachweis von SARS-CoV-2 inNierenbiopsien von COVANPatienten liefert indirekt Unterstützung für die Hypothese, dass COVAN wahrscheinlich eher auf die Auswirkungen eines Zytokinsturms als auf eine direkte Virusinfektion des Nierenparenchyms zurückzuführen ist. Der gelegentliche Nachweis von SARS-CoV-2-Viruspartikeln erfolgte in Autopsie-Nierenproben, bei denen der störende Effekt der Gewebeautolyse nicht ausgeschlossen werden konnte (3, 4, 15, 16). Es wurde festgestellt, dass mehrere entzündliche Zytokine und Chemokine in der Leber hochreguliert sindSeren von Patienten mit COVID-19und/oder COVAN (4, 17, 18). Diese Liste umfasst Zytokine wie die Interferone Alpha, Beta, Gamma und TNF, von denen zuvor bekannt war, dass sie die APOL1-Expression hochregulieren. Die Liste umfasst jedoch auch mehrere entzündliche Zytokine, die durch eine COVID-19-Infektion stark hochreguliert werden. Es ist nicht bekannt, ob diese Zytokine additive, synergistische oder antagonistische Wirkungen auf die APOL1-Expression und die damit verbundene Podozytopathie haben.

In der aktuellen Studie haben wir diese Wissenslücken geschlossen, indem wir Nierenbiopsien von neun Patienten mit COVAN und zwei menschlichen Kontrollnieren genutzt haben, um zu untersuchen, ob und wo das APOL1-Protein in COVAN und Kontrollnieren exprimiert wird. Wir haben achtzehn COVID-19--induzierte Zytokine profiliert, um acht Zytokine zu identifizieren, die in Abwesenheit von SARS-CoV-2 ausreichten, um synergistisch die APOL1-Expression in primären menschlichen glomerulären Zellen zu induzieren und eine Podozytopathie in menschlichen Nieren-Mikrozellen zu verursachen. Organoide. Diese Studie liefert nicht nur den ersten Beweis in einem vom Menschen abgeleiteten experimentellen Modell, dass der COVID-19-Zytokinsturm die APOL1-Expression und Podozytopathie induziert, sondern identifiziert auch den gemeinsamen Signalweg, der die pathogenen Wirkungen vermittelt. Diese Studie hat Auswirkungen, die sich auf Strategien für das Screening und die Behandlung von COVID-19 bei schwarzen und hispanischen Patienten auswirken könnten. Es wirft Fragen zur Sicherheit zusätzlicher Interferone als COVID{10}}-Therapie bei schwarzen und hispanischen Personen auf, die Träger von Hochrisiko-APOL1-Genotypen sind (19, 20).

Ergebnisse

Die APOL1-Expression ist in Podozyten und glomerulären Endothelzellen von COVAN-Patienten hochreguliert. Um zu untersuchen, ob Patienten mit einer durch Biopsie bestätigten COVAN-Diagnose eine erhöhte Expression des APOL1-Proteins in ihren Podozyten und glomerulären Endothelzellen (GECs) aufweisen, führten wir eine immunhistochemische Co-Färbung von APOL1, Synaptopodin (einem Aktin-assoziierten Protein differenzierter Podozyten) und durch CD31 (ein Endothelzellmarker) in Nierenbiopsien von zwei Patienten mit COVAN-Diagnose (Abbildung 1). Die APOL1-Expression war in den Glomeruli sowohl von Fall 1, der zehn Monate nach der COVID-19-Diagnose biopsiert wurde, reichlich vorhanden (Abbildung 1A-F), als auch von Fall 6, der neun Tage nach der COVID-19-Diagnose biopsiert wurde (Abbildung 1G-L). Bei beiden Patienten gab es eine starke APOL1-Färbung in Synaptopodin-positiven Podozyten (Pfeil; Abbildung 1B, E, H und K) und entlang des CD31--positiven glomerulären Endothels (Pfeilspitze; Abbildung 1C, F, I und L). ). Das Vorhandensein von APOL1-Protein in Podozyten und GECs zu Zeitpunkten 9 Tage und 10 Monate nach der Diagnose einer COVID-19-Infektion legt nahe, dass die APOL1-Expression früh induziert wird und mehrere Monate lang in den Glomeruli bestehen bleiben kann, lange nach der auslösenden COVID-19 27}} Infektion ist abgeklungen.

Die APOL1-Expression ist im Biopsiegewebe von COVAN-Fällen hochreguliert, jedoch nicht in den Kontrollen. Um die Generalisierbarkeit dieser immunhistochemischen Ergebnisse weiter zu bewerten, identifizierten wir insgesamt neun COVAN-Fälle mit verfügbarem Biopsiegewebe für die Genotypisierung und IHC (Abbildung 2) sowie zwei Kontrollpatienten, darunter eine Autopsiekontrolle eines Patienten mit COVID{{2 }} Infektion, entwickelte jedoch kein AKI (Abbildung 2B und 2C). Zu den klassischen histopathologischen Merkmalen von COVAN gehörte der Kollaps der glomerulären Kapillarbüschel mit angrenzender Podozytenhypertrophie und -proliferation, häufig mit den mit glomerulärer Proteinurie verbundenen Podozytenprotein-Reabsorptionströpfchen (Supple Abb. 1 und Supple Abb. 2). Die APOL1-IHC-Färbung fehlte in allen Glomeruli der Kontrollen (Abbildung AC), war jedoch in den Glomeruli aller neun COVAN-Patienten vorhanden (Abbildung 2D-X). Die APOL1-Färbung war im Zytoplasma von Podozyten, GECs und in einigen parietalen Epithelzellen reichlich vorhanden (Abbildung 2N, gestrichelter Kreis) (Abbildung 1, Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3). APOL1-Protein konnte in Glomeruli mit offenen Kapillaren sowie in Bereichen mit glomerulärem Kollaps beobachtet werden. Das offensichtliche Vorhandensein von APOL1-Protein in einigen Kapillarlumen stellte wahrscheinlich zirkulierendes APOL1 dar, das hauptsächlich von der Leber produziert wird (21). Darüber hinaus wurde APOL1 auch in peritubulären Kapillaren und in verletzten tubulären Epithelzellen (Sternchen) beobachtet. Die Spezifität und Bedeutung dieses letztgenannten Befundes ist unklar. Bemerkenswerterweise trugen sieben der neun COVAN-Fälle einen Hochrisiko-APOL1-Genotyp (Abbildung 2D-V). Die anderen beiden Fälle, Fall 9 und Fall 4, wiesen G0G0-Genotypen mit geringem Risiko auf (Abbildung 2W und 2X). Obwohl es sich um einen Genotyp mit geringem Risiko handelte, war die APOL1-Expression im Fall 9 mit der der sieben Fälle mit hohem Risiko vergleichbar (Abbildung 2W). Im Nierenbiopsieobjektträger von Fall 4 gab es nur zwei Glomeruli, und die APOL1-Expression war in diesen Glomeruli geringer (Abbildung 2X). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die basale Nieren-APOL1-Expression in den Glomeruli von Personen ohne glomeruläre Schädigung niedrig ist, selbst wenn die Person an einer COVID-19-Infektion leidet; wohingegen die APOL1-Expression in Podozyten und GECs im Rahmen von COVAN in 89 % unserer Fälle hochreguliert wird.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, identifizierten sich sieben der neun Patienten (77,8 %) mit durch Biopsie nachgewiesenem COVAN als Afroamerikaner. Sechs dieser sieben Patienten (85,7 %) trugen Hochrisiko-APOL1-Genotypen (vier G1G1, ein G1G2, ein G2G2). Im Vergleich dazu tragen 13 % der Afroamerikaner den Hochrisiko-APOL1-Genotyp. Die verbleibenden zwei Patienten identifizierten sich selbst als weiße Hispanoamerikaner, einer von ihnen trug jedoch bemerkenswerterweise auch einen Hochrisiko-APOL1-Genotyp. Insgesamt trugen sieben der neun COVAN-Patienten (77,8 %) Hochrisiko-APOL1-Genotypen. Das Durchschnittsalter der Fälle betrug 51 Jahre (Bereich 37-60). Alle neun Fälle entwickelten eine akute Nierenschädigung und wiesen unterschiedlich starke Proteinurie auf, die von subnephrotischem bis nephrotischem Bereich reichte (1,4- 14 g/24 Stunden). Die meisten Biopsien wurden mindestens 1 Monat nach der COVID-19-Infektion durchgeführt, mit Ausnahme von Fall 6, bei dem die Biopsie 9 Tage nach einem positiven PCR-Test durchgeführt wurde. Bei einem Patienten wurde die Biopsie aufgrund der unvollständigen Genesung erst 10 Monate nach der Infektion durchgeführt. Alle neun Patientenbiopsien zeigten eine kollabierende Glomerulopathie, tubuläre Verletzungen und interstitielle Entzündungen. In keinem der Fälle wurden endotheliale tubuläre retikuläre Einschlüsse beobachtet. Bemerkenswert ist, dass in den beiden COVAN-Biopsien, die durch IHC und In-situ-Hybridisierung auf eine direkte SARS-CoV-2-Virusinfektion getestet wurden, kein Virus nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt).

Rekombinantes COVID-19-Induzierte Zytokine erhöhen synergistisch die APOL1-Expression in primären menschlichen glomerulären Endothelzellen und Podozyten. Um zu untersuchen, ob der durch COVID-19- induzierte Zytokinsturm ausreicht, um die APOL1-Expression in menschlichen glomerulären Zellen auszulösen, haben wir primäre menschliche Podozyten, die aus der Niere eines verstorbenen Spenders isoliert wurden, und primäre menschliche glomeruläre Endothelzellen (GECs) in einem von 18 Zytokinen und Chemokinen zuvor kultiviert Berichten zufolge ist das Serum von Patienten mit SARS-CoV-2 erhöht (Abbildung 3A) (4, 17). Die Podozytenidentität wurde mit mehreren Podozytenmarkern bestätigt, darunter Wilms-Tumor1, Synaptopodin, Nephrin und Podocalyxin (Abbildung 3B und ergänzende Abbildung 4A-B). Die GEC-Identität wurde durch Expression von PECAM1 relativ zu bestätigtmenschliche embryonale Niere293 cells (HEK) (Figure 3C). Induced APOL1 expression was quantitated by qPCR and immunoblot after 48hr treatment in GECs (Figure 3D and 3F) and podocytes (Figure 3E and 3G). Consistent with prior report (22), we found that interferons (gamma > beta > alpha) robustly induced expression of APOL1 in both GECs and in podocytes. Similarly, we found that TNF also induced a modest APOL1 expression in GECs and podocytes. Unexpectedly, we found that three cytokines-IL-6, IL-1β, and IL-18, which were previously unrecognized as inducers of APOL1 expression, also individually induced modest APOL1 expression in GECs or podocytes. Notably, the combination of all 18 recombinant cytokines produced a synergistic upregulation of APOL1 that was an order of magnitude higher than that produced by any of the interferons alone (Figure 3D). These effects were not only observed with cytokine concentration of 50ng/mL (Figures 3D and 3E) but also at 20ng/mL and 10ng/mL (Supplemental Figure 5). Cytokine conditions inducing >Das 1,5-fache des APOL1-Transkripts im Vergleich zur mit Medien behandelten Kontrolle wurde weiter auf Signifikanz analysiert. Die Signifikanz wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests mit Holm-Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche bewertet. Die angegebenen P-Werte sind die angepassten P-Werte. Diese Ergebnisse erweitern die Liste der physiologischen Zytokine, die die APOL1-Expression über die bekannten Interferone und TNF hinaus induzieren können. Wichtig ist, dass die Ergebnisse auch darauf hindeuten, dass die Synergie von COVID-19-induzierten Zytokinen für die APOL1-Regulation relevanter sein könnte als die Wirkung eines isolierten Zytokins allein.

JAK-STAT-Signalisierung vermitteltCOVID-19-Zytokin-induzierte APOL1-Expression. Als nächstes untersuchten wir, ob durch COVID-19 induzierte Zytokine die APOL1-Expression über einen gemeinsamen intrazellulären Signalweg hochregulieren, der als therapeutisches Ziel genutzt werden könnte. Es wurde zuvor berichtet, dass die Interferon-Induktion von APOL1 durch JAK-STAT1/2 vermittelt wird (22, 23). Es wurde gezeigt, dass die Signalübertragung über den IL-6-Rezeptor durch STAT3 vermittelt wird, und es wird berichtet, dass sowohl IL-1 als auch TNF indirekt STAT3 aktivieren (24, 25). Interessanterweise berichteten Meliambro et al. kürzlich über eine Hochregulierung von Phospho-STAT3 im Biopsiegewebe eines Falles von COVAN und HIV-assoziierter Nephropathie (HIVAN) im Vergleich zur Kontrolle (26). Basierend auf diesen Hintergrundinformationen stellten wir die Hypothese auf, dass die JAK1/2-STAT1/2/3-Signalwege die primären Vermittler der Auswirkungen von COVID-19-induzierten Zytokinen auf die APOL1-Expression sind. Um diese Hypothese zu testen, haben wir den Zustand dieser Signalwege bestimmt, indem wir die phosphorylierten STAT1, 2 und 3 in Lysaten von GECs gemessen haben, nachdem sie 48 Stunden lang in einzelnen oder kombinierten Zytokinen kultiviert wurden (Abbildung 3F). Typ-I-Interferone (IFN und IFN) erhöhten die Phosphorylierung von STAT1-3, während IFN die Phosphorylierung von STAT 1 und 3 hochregulierte. IL-1, TNF und IL-6 erhöhten nur die Phosphorylierung von STAT3. Kombinierte Zytokine erhöhten die Phosphorylierung von STAT1-3. Da wir wussten, dass JAK1 und JAK2 die primären Upstream-Proteinkinasen sind, die STAT1-3 phosphorylieren, stellten wir die Hypothese auf, dass die Hemmung von JAK1/2 die durch „alle Zytokine“ induzierte APOL1-Expression blockieren würde. In Übereinstimmung mit dieser Vorhersage stellten wir fest, dass ein JAK1/2--spezifischer Inhibitor, Baricitinib, die APOL1-mRNA und die APOL1-Expression durch vollständig mit Zytokinen behandelte GECs und primäre Podozyten signifikant reduzierte (Abbildung 3D G). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die JAK-STAT-Signalübertragung der primäre Weg ist, der die durch COVID-19-Zytokine induzierte APOL1-Expression vermittelt.

COVID-19-induzierte Zytokine reichen aus, um die APOL1-Expression in menschlichen iPSC-abgeleiteten Nieren-Mikroorganoiden über den JAK-STAT-Signalweg voranzutreiben. Mikroorganoide menschlicher Nieren sind eine bewährte Plattform zur Modellierung menschlicher Nierenerkrankungen und zur Erleichterung der klinischen Umsetzung. Wir fragten, ob die Ergebnisse, die wir aus primären menschlichen Podozyten und GECs erhielten, durch ein vom Menschen abgeleitetes Nieren-Mikroorganoidmodell verallgemeinerbar und validierbar seien. Daher haben wir Nieren-Mikroorganoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) eines afroamerikanischen Trägers des G1G2-APOL1-Genotyps generiert, um die APOL1-Regulation, -Expression und -Ergebnisse in diesem Modell zu untersuchen (Abbildung 4A). Wir kultivierten Nieren-Mikroorganoide in IFN 10 ng/ml oder einer Kombination aus acht Zytokinen (IFN, IFN, IFN, IL-18, IL-8, IL-6, TNF, IL{{18). }} ) jeweils bei 10 ng/ml entweder in Abwesenheit oder Anwesenheit von Baricitinib, 10 µM für 24 Stunden. Diese acht Zytokine wurden aufgrund ihrer beobachteten Regulierung der APOL1-Expression in den vorangegangenen Experimenten ausgewählt. Podozyten und tubuläre Epithelzellen in den Nieren-Mikroorganoiden wurden durch Marker bestätigt (Abbildung 4B). In Übereinstimmung mit der Literatur (27) waren Endothelzellen in den Nieren-Mikroorganoiden unterrepräsentiert (Daten nicht gezeigt). Wir entdeckten, dass die basale APOL1-Proteinexpression in Mikroorganoiden gering war. Die IFN-Behandlung induzierte eine erhebliche APOL1-Expression, wobei die höchste Intensität in Bereichen des Podozytenmarkers Podocalyxin lokalisiert war. Der Zytokincocktail induzierte im Vergleich zu anderen Behandlungen eine übergroße und robuste APOL1-Expression in der gesamten Mikroorganoidstruktur. Gruppen, die mit IFN plus Baricitinib und allen Zytokinen plus Baricitinib behandelt wurden, zeigten keine APOL1-Expression, was mit einer vollständigen Hemmung der Zytokinwirkung vereinbar ist. Die APOL1-Expression in Nieren-Mikroorganoid-Podozyten erinnerte an die in Podozyten von COVAN-Patienten beobachtete. Im Gegensatz zu COVAN-Nieren, in denen in gesunden tubulären Epithelzellen keine signifikante APOL1-Expression beobachtet wurde, exprimierten mikroorganoide E-Cadherin-positive tubuläre Epithelzellen der Niere APOL1. Dieser Unterschied könnte auf Unterschiede bei Membranzytokinrezeptoren oder epigenetischen Faktoren zurückzuführen sein, die die Proteinexpression in den unreifen Tubuli der Nieren-Mikroorganoide beeinflussen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass menschliche iPSC-abgeleitete Nieren-Mikroorganoide, die mit COVID-19--induzierten Zytokinen kultiviert wurden, eine starke Hochregulierung des pathogenen G1G2-APOL1-Proteins zeigen und die Expression durch Hemmung des JAK-STAT-Signals blockiert wurde.

Die durch Zytokine induzierte JAK-STAT-APOL1-Signalisierung verringerte die Lebensfähigkeit von Nieren-Mikroorganoid-Podozyten, die durch den JAK-Inhibitor gerettet wurden. Schließlich fragten wir, ob das in Nierenmikroorganismen exprimierte G1G2 APOL1 die Lebensfähigkeit der Podozyten beeinträchtigt. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Zytokin-induzierte Variante des APOL1-Proteins zum Verlust von Podozyten führen würde – ein charakteristischer Phänotyp von COVAN. Um diese Hypothese zu testen, isolierten wir Podozyten aus Nieren-Mikroorganoiden, die aus iPSCs eines G1G2-Trägers erzeugt wurden. Die Podozyten wurden in IFN (10 ng/ml) oder einer Kombination aus acht Zytokinen (jeweils 10 ng/ml) sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Baricitinib (10 µM) 96 Stunden lang kultiviert (Abbildung 5A und B). Die Zytokinbehandlung induzierte eine starke APOL1-Expression und diese Expression wurde durch Baricitinib blockiert, was mit unseren früheren Experimenten übereinstimmt (Abbildung 5C). Dementsprechend verursachte die Zytokinbehandlung einen erheblichen Podozytenverlust, wie durch den Lebensfähigkeitstest und das gesamte zelluläre ATP angezeigt (Abbildung 5D und 5E). Bemerkenswerterweise rettete Baricitinib den Zytokin-induzierten Podozytenverlust vollständig. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass durch COVID-19-induzierte Zytokine die JAK-STAT-APOL1-Signalisierung auslösen, die wiederum zu einer Schädigung und einem Verlust von Podozyten führt. Die schützende Wirkung der JAK-Hemmung auf die Lebensfähigkeit der Podozyten stützt diese Hypothese stark.

Diskussion

Die wichtigsten Schlussfolgerungen der aktuellen Studie sind, dass mehrere COVID-19-induzierte Zytokine über Interferone hinaus synergistisch über die JAK-STAT-Signalisierung wirken, um die pathogene APOL1-Expression voranzutreiben, was zu einer Schädigung und einem Verlust von Podozyten führt, die durch die JAK-Hemmung blockiert werden. Anhand einer Fallserie zeigen wir zum ersten Mal, dass das APOL1-Protein reichlich in Podozyten und GECs von Patienten mit diagnostizierter COVID-19-Diagnose exprimiert wird, jedoch nicht in den Glomeruli gesunder Kontrollpersonen oder von COVID-19-positiven Patienten COVAN-Negativkontrolle. In drei experimentellen Modellen zeigen wir, dass bei einer COVID-19-Infektion hochregulierte rekombinante Zytokine ausreichen, um eine robuste APOL1-Expression voranzutreiben, und unerwarteterweise, dass der starke Synergismus, der durch eine Kombination von Zytokinen erzeugt wird, überwiegend über einen gemeinsamen intrazellulären Signalweg vermittelt wurde. Insgesamt stützen unsere experimentellen Beweise stark einen kausalen Zusammenhang zwischen der Zytokin-induzierten JAK-STAT-APOL1-Signalisierung und dem glomerulären COVAN-Phänotyp in vivo und unterstützen die weitere Untersuchung dieses therapeutischen Ziels.

Die erhöhte Häufigkeit des Hochrisiko-APOL1-Genotyps (77,8 %) bei Patienten mit COVAN, über die wir hier berichten, korreliert mit einer kürzlich durchgeführten internationalen multizentrischen Pathologieprüfung, in der ein Hochrisiko-APOL1-Genotyp bei 91,7 % der COVAN-Patienten festgestellt wurde (3). Angesichts der Tatsache, dass die Häufigkeit des Hochrisiko-APOL1-Genotyps in der allgemeinen afroamerikanischen Bevölkerung 13 % (28) beträgt, ist die Entdeckung einer Häufigkeit von 77-90 % bei COVAN tiefgreifend und vergleichbar mit der in berichteten Häufigkeit von 60-70 % HIV-assoziierte Nephropathie (HIVAN) (28-31). Die Existenz der verbleibenden 20-30 % der COVAN- (und HIVAN-)Fälle, die keine Hochrisiko-APOL1-Genotypen tragen, legt die Möglichkeit eines APOL{{20}}unabhängigen Pathomechanismus oder die Möglichkeit nahe, dass in einigen Fällen dies der Fall ist In einigen Fällen kann die durch COVID-19-induzierte supraphysiologische Expression von G0 APOL1 auch eine Podozytopathie verursachen. Die Analyse dieser Möglichkeiten erfordert weitere Studien. Dennoch haben wir es zuvor in demonstriertmenschliche embryonale Niere(HEK)-Zellen mit Tetracyclin-induzierbarem APOL1-Expressionssystem, dass die Zytotoxizität von APOL1 sowohl varianten- als auch dosisabhängig ist (32, 33). Eine dosisabhängige APOL1-Zytotoxizität wurde auch von anderen Forschern in ähnlichen zellbasierten Systemen berichtet (34). Darüber hinaus haben transgene APOL1-Mausmodelle nicht nur den kausalen Zusammenhang zwischen APOL1-Risikoallelen und Podozytenschäden bestätigt, sondern auch gezeigt, dass der Grad der Podozytopathie mit den APOL1-Expressionsniveaus korreliert (10, 12-14, 35). . Unsere Entdeckung, dass acht von neun COVAN-Fällen im Vergleich zu Kontrollen eine robuste glomeruläre APOL1-Expression zeigten, und der Beweis, dass die Expression endogener APOL1-Risikoallele eine Podozytopathie in menschlichen Nieren-Mikroorganoiden verursacht, unterstützen den kausalen Zusammenhang zwischen APOL1 und Podozytopathie. Umgekehrt deutet das Fehlen von APOL1 in den Glomeruli von COVID-19-positiven, aber AKI-negativen G0G0-Autopsiekontrollen darauf hin, dass eine COVID-19-Infektion ohne APOL1-Induktion kein ausreichender Auslöser dafür istCOVAN-Krankheit.