Jasminum Sambac-Zellextrakt als antioxidativer Booster gegen Hautalterung Teil 1

Abstrakt: Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle im Hautalterungsprozess durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und die Bildung fortgeschrittener Glykationsendprodukte (AGEs). Daher werden auf dem Hautpflegemarkt antioxidative Inhaltsstoffe benötigt, und die Verwendung von Molekülen aus pflanzlichen Zellkulturen bietet eine einzigartige Chance. In diesem Artikel wurden die Eigenschaften eines hydroethanolischen Extrakts untersucht, der aus Jasminum-sambac-Zellen (JasHEx) gewonnen wird. Die antioxidativen und Anti-AGE-Eigenschaften wurden durch einen multidisziplinären Ansatz untersucht, der massenspektrometrische und bioinformatische In-vitro- und Ex-vivo-Experimente kombiniert. JasHEx enthält Phenolsäurederivate, Lignane und Triterpene und reduziert nachweislich die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies im Zytosol in Keratinozyten, die exogenem Stress ausgesetzt sind. Es zeigte auch die Fähigkeit, die AGE-Bildung zu reduzieren und die Produktion von Kollagen Typ I in der extrazellulären Matrix zu steigern. Die Daten zeigten, dass die antioxidativen Eigenschaften von JasHEx mit seinen Aktivitäten zum Abfangen freier Radikale und zur Metallchelatisierung sowie der Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalwegs zusammenhängen. Dies kann die entzündungshemmende Aktivität von JasHEx im Zusammenhang mit der Abnahme der NO-Spiegel in LPS-stimulierten Makrophagen gut erklären. Somit kann JasHEx als starker antioxidativer Booster gegen durch oxidativen Stress verursachte Hautalterung angesehen werden.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen und kann reaktive Sauerstoffspezies abfangen, den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau verhindern und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch Thymin-Radikalanionen.

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Schlüsselwörter: Hautalterung; reaktive Sauerstoffspezies (ROS); fortgeschrittene Glykationsendprodukte (AGEs); Hydroethanolischer Jasminum-Sambac-Extrakt (JasHEx); Massenspektrometer; Metabolomik; Global Natural Product Social Molecular Networking (GNPS); Kernfaktor Erythroid 2-verwandter Faktor 2 (Nrf2)

1. Einleitung

Genetische intrinsische Faktoren und extrinsische Wirkstoffe wie ultraviolette Strahlung, Infrarotstrahlung, Xenobiotika und Umweltschadstoffe verursachen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Sie werden durch die Aktivierung der mitochondrialen Atmungskette, von Cytochrom p450 und NADPH-Oxidasen erzeugt [1]. Zu den ROS gehören freie Radikale (Superoxidanion, Hydroperoxylradikal, Alkoxyradikal und Hydroxylradikal) und nichtradikale Moleküle (Wasserstoffperoxid und Singulettsauerstoff) [2]. Wenn antioxidative Systeme überlastet sind, reichern sich ROS in den Zellen an und erzeugen den sogenannten oxidativen Stress, der eine Hauptursache für die Hautalterung ist [3].

Tatsächlich verursacht oxidativer Stress sowohl DNA-Schäden als auch Lipid- und Proteinoxidation zusammen mit der Auslösung des Mitogen-aktivierten Proteinkinasen-Signalwegs (MAPK) (AKT, JNK, ERK und p38) [4]. Dies wiederum fördert die Expression entzündungsfördernder Zytokine, Wachstumsfaktoren und adhäsiver Moleküle durch die Stimulation der Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-κB. Darüber hinaus führt die Aktivierung des MAPK-Signalwegs zu Veränderungen der Hautmatrix, indem sie den Kollagenspiegel senkt. Es beschleunigt den Kollagenabbau, indem es die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihren Gewebeinhibitoren TIMPs moduliert, und reduziert die Synthese von neuem Kollagen, indem es den TGF-Typ-II-Rezeptor/Smad-Signalweg blockiert. Darüber hinaus verändert oxidativer Stress den Zustand der Haut, indem er den epidermalen Kalziumgradienten stört, der für die Integrität und Funktion der Hornhauthülle unerlässlich ist, die Funktion der Talgdrüsen stimuliert und die Degeneration der Melanozyten induziert [5].

Parallel dazu fördert die Bildung veränderter Biomoleküle, sogenannte Advanced Glycation End Products (AGEs), oxidativen Stress in Zellen und Geweben [6]. Die Entwicklung dieser Alterungsbiomarker wird durch verschiedene Umweltfaktoren wie Zigarettenrauch, einen hohen Anteil an raffinierten und einfachen Kohlenhydratdiäten, bei hohen Temperaturen gekochte Lebensmittel und einen sitzenden Lebensstil induziert; AGEs sind stabile und irreversible Produkte, die aus der nichtenzymatischen Reaktion zwischen reduzierenden Zuckern und Proteinen, Nukleinsäuren oder Lipiden entstehen, gefolgt von weiteren Umlagerungen [7]. Tatsächlich ist der Ausgangspunkt der AGE-Bildung die Maillard-Reaktion, bei der Carbonylgruppen reduzierender Zucker reversibel mit freien Aminogruppen von Proteinen, Nukleinsäuren oder Aminophospholipiden reagieren und Schiffsche Basen bilden. Diese Imine wandeln sich spontan in stabileres Ketamin um, sogenannte Amadori-Produkte. Sie produzieren reaktive Dicarbonyle (wie Glyoxal oder Methylglyoxal), die mit funktionellen Lysin- und Arginingruppen von Proteinen reagieren und eine große Vielfalt an AGEs ergeben [8,9]. Sie werden aufgrund ihrer Fähigkeit, Fluoreszenz zu emittieren und Vernetzungen zu bilden, in verschiedene Gruppen eingeteilt.

Die AGE-Wirkung wird durch die Rezeptoren für AGEs (RAGEs) vermittelt, bei denen es sich um Transmembranproteine ​​handelt, die zur Immunglobulin-Superfamilie der Typ-I-Zelloberflächenmoleküle gehören und in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Keratinozyten, Fibroblasten und Makrophagen, exprimiert werden. Die Bindung von AGEs/RAGEs erhöht die ROS-Produktion hauptsächlich durch die Aktivierung von NADPH-Oxidasen (NOXen) und der mitochondrialen Atmungskette, was zu oxidativem Stress und allen oben beschriebenen Folgeeffekten führt [6,8].

Darüber hinaus reagieren Proteine ​​der extrazellulären Matrix (ECM), insbesondere Kollagen, sehr empfindlich auf Glykation. Tatsächlich sind die Spiegel der aus Kollagen gewonnenen AGE-Struktur Pentosidin bei alten Probanden deutlich höher als bei jungen Probanden [10]. Die Glykierung von Kollagen verändert nicht nur die mechanischen Eigenschaften des Kollagens selbst, das steifer und spröder wird [11], sondern auch die der extrazellulären Matrix und beeinflusst das Verhalten der ansässigen Zellen (Wachstum, Differenzierung, Motilität, Genexpression und Reaktion darauf). Zytokine) und Matrix-Zell-Interaktionen [12].

In diesem Szenario sind antioxidative Inhaltsstoffe im kosmetischen Bereich sehr gefragt, um die AGE-Bildung und die damit verbundene oxidative Kaskade zu reduzieren: Extrakte aus der Art Jasminum sambac, die zur Familie der Oleaceae gehört, sind wegen ihrer antioxidativen Eigenschaften und ihrer gemeinsamen Verwendung in der Volksmedizin interessant Arzneimittel zur Behandlung von Hauterkrankungen [13]. Pflanzenextrakte weisen jedoch mehrere Nachteile auf, wie z. B. eine schlechte biologische Nachhaltigkeit, die mögliche Kontamination mit Pestiziden, Düngemitteln oder Krankheitserregern sowie die Variabilität ihrer qualitativen und quantitativen Zusammensetzung, die von Jahreszeiten und Umweltbedingungen abhängt. Eine sinnvolle Alternative zu Pflanzen als Quelle bioaktiver kosmetischer Inhaltsstoffe stellen pflanzliche Zellkulturen dar, die mehrere Vorteile bieten: (i) hohe Nachhaltigkeit des Produktionsprozesses, da keine landwirtschaftlichen Flächen benötigt werden; (ii) kontinuierliche Versorgung mit Naturprodukten ohne geografische, saisonale und pflanzliche Reproduktionszyklusabhängigkeit; (iii) kein Risiko einer Kontamination durch Krankheitserreger, Umweltschadstoffe und agrochemische Rückstände; (iv) standardisierte Wachstumsbedingungen, die es ermöglichen, höhere und reproduzierbarere Biomasse- und Metabolitenausbeuten zu erzielen; (v) hohe Vielseitigkeit, da die Konzentration der Verbindungen durch Änderung der Kultivierungsbedingungen optimiert werden kann und (vi) einfachere und weniger zeitaufwändige Extraktionsprotokolle, wodurch der Bedarf an aggressiven Lösungsmitteln verringert wird [14,15].

Hier wurde ein hydroethanolischer Extrakt aus Zellkulturen von Jasminum sambac (JasHEx) untersucht. Das Ziel unserer Studie ist eine umfassende chemische und biologische Charakterisierung von JasHEx, insbesondere die Untersuchung seiner Anti-Glykations- und Anti-Aging-Eigenschaften. Zunächst wurden fortschrittliche massenspektrometrische Ansätze verwendet, um eine detaillierte strukturelle Charakterisierung des Extrakts zu erhalten. Anschließend wurden In-vitro- und Ex-vivo-Experimente durchgeführt, um die biologische Aktivität von JasHEx als Antioxidans nachzuweisen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzliche Gewebekulturen und Extraktvorbereitung

Zertifizierter Arabischer Jasmin (Jasminum sambac) wurde von einer örtlichen Baumschule („Ladre di Piante“, Pistoia, Toskana, Italien) bezogen. Jasminum-Sambac-Blätter wurden 1 Minute lang in 70 Prozent Ethanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) eingeweicht und mit 1 Prozent (v/v) handelsüblichem Bleichmittel, ergänzt mit Tween 2{{, oberflächensterilisiert. 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) für 8 Minuten, gefolgt von drei Spülungen in sterilem destilliertem Wasser. Dann wurden die Blätter in Stücke von 0,5–1,0 cm geschnitten und auf MS-Medium voller Stärke [16] kultiviert, das 3 Prozent (w/v) Saccharose enthielt, 0 0,2 mg/L 2,4D und 8 g/L Phyto-Agar. Die Explantate wurden monatlich drei Monate lang auf einem frischen Medium subkultiviert. Sobald ein gelbgrüner, bröckeliger und schnell wachsender Kallus erhalten wurde, wurden die Pflanzenzellen in das flüssige MS-Medium übertragen, das mit 3 Prozent (Gew./Vol.) Saccharose und 0,2 mg/L 2,4D ergänzt war. Die Suspension wurde in einem Kreiselschüttler bei 210 Uhr und 27 °C in einem dunklen Klimaraum gerührt. Die dunkel gewachsenen Zellen wurden jede Woche von kleinen auf große Flaschen vergrößert, bis flüssige Suspensionskulturen von etwa 177 g/L erreicht waren. Die Herstellung des hydroethanolischen Zellkulturextrakts von Jasminum sambac (JasHEx) erfolgte durch Zugabe von 2000 ml einer Lösung aus Ethanol/Wasser (90/10, Vol./Vol.) zu 500 g Zellen. Die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 1500 U/min und 6 Minuten lang bei 3800 U/min unter Verwendung einer Grindomix GM300-Messermühle (Retsch GmbH, Haan, Deutschland) homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde 2 Stunden lang bei 25 °C mit 400 U/min gerührt, wobei Lichteinwirkung vermieden wurde. Die Suspension wurde dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 6300 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, filtriert und dann unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Deutschland) bei 25 °C konzentriert. Schließlich wurde der pH-Wert mit 10 N NaOH auf 7,0 gebracht und dann gefriergetrocknet, bis ein feines Pulver entstand.

2.2. UPLC-MS/MS-Analyse für die chemische Charakterisierung von JasHEx

Es wurde eine zweiphasige Butanol/Wasser-Extraktion erreicht. Die Butanolfraktion wurde getrocknet und in Methanol (10 mg/ml) aufgetaut, bevor die UPLC-MS/MS-Analyse auf einem Q-Exactive Classic-Massenspektrometer durchgeführt wurde, das mit einem UltiMate™ 3000 UPLC-System (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ausgestattet war ). Alle chromatographischen Läufe wurden wie bereits von Ceccacci et al. beschrieben durchgeführt. [17].

2.3. Globale Social-Molecular-Networking-Analysen zu Naturstoffen

Zur Identifizierung von Metaboliten wurde Global Natural Products Social Molecular Networking eingesetzt [18]. Alle nicht von GNPS zugeordneten MS- und MSMS-Signale wurden sorgfältig untersucht und entsprechend der Literatur zugeordnet. Rohdateien wurden vor der Suche in der GNPS-Spektralbibliothek mit der Software MS Converter General User Interface in das mzXML-Format konvertiert. Es wurde mit einer Vorläuferionen-Massentoleranz von 0.025 Da, einer Fragmentionen-Massentoleranz von 0.02 Da, minimal übereinstimmenden Peaks von 2 und einem Bewertungsschwellenwert von 0,7 durchgeführt. Die Ergebnisse wurden manuell bestätigt.

Die Datenvorverarbeitung wurde von Mzmine (Version 2.53, Softpedia, Bukarest, Rumänien) [19] durchgeführt und ein Feature-Based Molecular Networking (FBMN)-Job [20] wurde durchgeführt, wie von Ceccacci et al. berichtet. [17]. Die erhaltenen Netzwerkdateien wurden in Cytoscape (Version 3.9.1, US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Bethesda, MD, USA) importiert [21].

2.4. Quantitative Analyse von Lignanen und Triterpenen

Die gleichen UPLC-Einstellungen wie für die qualitativen Experimente wurden für die quantitative Analyse von Lignanen verwendet, während sie für die der Triterpene verbessert wurden, um zwei Isomerenpaare, Arjunolsäure/asiatische Säure und Oleanolsäure/Ursolsäure, zu trennen. Die Analyse wurde mit einem Q-Exactive Classic Massenspektrometer wie zuvor definiert durchgeführt. Die Trennung wurde mit einem Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, Partikelgröße 5 µm) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus A (5 mM wässrige Ammoniumacetatlösung, pH 9,00 eingestellt durch Ammoniumhydroxid) und B (1{{40}}0 Prozent Acetonitril). eine Gradientenelution von 13–28 Prozent B bei 0–20 Minuten, 28–65 Prozent B bei 20–24 Minuten, 65–75 Prozent B bei 24–28 Minuten, 75–95 Prozent bei 28–28,5 Minuten, 95 Prozent bei 28,5 –32 Min., 95–13 Prozent bei 32–32,1 Min. und 13 Prozent bei 32,1–44 Min. Die Flussrate betrug 0,450 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 5 µL. Sowohl für Lignane als auch für Triterpene wurden Daten mit der von Ceccacci et al. beschriebenen Massenmethode erfasst. [17]. Wir haben Nortachelogenin (#LCA52174) von Biosynth Carbosynth, Matairesinol (#80497) und Maslinsäure (#83209) von PhytoLab GmbH & Co.KG, Secoisolariciresinol (#60372) und Arjunolsäure (#SMB00119) von Sigma-Aldrich (Saint Louis) gekauft , MI, USA), Asiatic Acid (#0027), Oleanolsäure (#0041 S) und Ursolsäure (#0037 S) von Extrasynthèse (Genay, Frankreich). Die Kalibrierungskurven wurden durch Injektion von Standards in einer Konzentration von 0,05 bis 25 µM für Lignane und 0,1 bis 25/250 µM für Triterpene erstellt. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für Standards wurden auf der Grundlage des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N) bestimmt.

2.5. Hautzellkulturen und Explantate

Immortalisierte menschliche Keratinozyten (HaCaT), gekauft von Addexbio Technologies (San Diego, CA, USA), wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) konserviert, das mit 10 Prozent fötalem Rinderserum ergänzt wurde (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) in 95 Prozent Luft, 5 Prozent CO2 und befeuchteter Atmosphäre bei 37 °C. Menschliche Hautfibroblasten (HDF) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) konserviert, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). ) in 95 Prozent Luft, 5 Prozent CO2 und einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ◦C. Hautexplantate, die aus der Haut gesunder weiblicher Spender (im Alter von 31 und 40 Jahren) im Operationszentrum Villa Cinzia (Neapel, Italien) gewonnen wurden, wurden in 24-Transwellplatten in DMEM/FBS plus Antibiotika unter Luft-Flüssigkeit-Bedingungen kultiviert bei 37 ◦C in 5 Prozent CO2-befeuchteter Luft. Gemäß der Deklaration von Helsinki hatten alle Spender ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung des Hautgewebes abgegeben.

2.6. Zytosolischer ROS-Assay in H2O2-gestressten HaCaT-Zellen

Für diesen Prozess wurden 1,8 × 104 HaCaT in 96-Well-Platten ausgesät und 20 h lang gezüchtet. Die Zellen wurden dann 2 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von JasHEx (0,0006 Prozent, 0,002 Prozent und 0,006 Prozent p/v) oder mit 500 µM Ascorbinsäure behandelt, die als Positivkontrolle verwendet wurden. Danach wurden sie in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und bei 37 °C mit 100 µL/Vertiefung einer Lösung inkubiert, die 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM Glucose und 5 mM enthielt µM CM-H2DCFDA (5-(und-6)-Chlormethyl-20,70 -Dichlordihydrofluoresceindiacetat, Invitrogen). Nach 45 Minuten wurde ein PBS-Waschvorgang durchgeführt und die Grundfluoreszenzintensität der Zellen bei 535 nm (Anregung 485 nm) unter Verwendung des Instruments EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen. Anschließend wurde der oxidative Stress durch Zugabe von 450 µM H2O2 induziert und die Fluoreszenz der Proben nach 30 Minuten gemessen.

2.7. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) für den AGE-Nachweis in Glyoxal-belasteten menschlichen dermalen Fibroblastenzellen (HDF).

Für diesen Schritt wurden 1,5 × 104 HDF in 96-Well-Platten ausgesät und 2 Tage lang gezüchtet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen 1{{10}} Minuten lang mit 100 µL 4-prozentigem Formaldehyd in PBS fixiert. Anschließend wurden sie eine Woche lang bei 50 °C mit JasHEx (0,0006 Prozent und 0,002 Prozent p/v) oder der Positivkontrolle von 1 µM Aminoguanidin in Gegenwart von 0,5 Prozent Glyoxal behandelt. Nach der Inkubation wurden sie für einen Enzymimmunoassay (ELISA) unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen AGE (Abcam ab23722) verarbeitet.

2.8. ImmunoHistoFluoreszenz-Assay an Methyl-Glyoxal-belasteten Hautexplantaten zum Nachweis von Fibrillin-1

Hautexplantate wurden von zwei Patienten im Alter von 31 und 40 Jahren gewonnen. Aus jeder Hautbiopsie wurden drei Stanzungen für jede Behandlung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erzeugt. Am ersten Tag wurden die Stempel mit JasHEx (0.002 Prozent und 0,006 Prozent p/v) oder der Positivkontrolle (1 mM Aminoguanidin) behandelt und nach 24 Stunden 500 µM Methyl- Glyoxal wurde hinzugefügt. Die Behandlungen wurden insgesamt sieben Tage lang alle zwei Tage aufgefrischt. Am Ende des Zeitraums wurden die Stanzen für die histologische Analyse verarbeitet, in 4 Prozent PFA fixiert, in 15 Prozent Saccharose, dann in 30 Prozent Saccharose inkubiert und in OCT-Verbindung (optimale Schnitttemperatur) bei –80 °C kryogelagert . Ein Kryoschnitt von 5 µm wurde mit dem Kryostat CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, USA) durchgeführt. Objektträger mit Kryoschnitten wurden 30 Minuten lang in PBS hydratisiert und 1 Stunde lang in eine „Blockierungslösung“ (6 Prozent BSA, 5 Prozent Serum, 20 mM MgCl2, 0,2 Prozent Tween) gegeben. Anschließend wurden sie mit dem primären Anti-Fibrillin-1-Antikörper (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) inkubiert. für 16 h bei 4 ◦C. Die Objektträger wurden 30 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann 1 Stunde lang mit dem sekundären Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 546-Antikörper (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) inkubiert. Die Kerne wurden 10 Minuten lang mit DAPI (40, 6-5 Diamidino-2-Phenylindol) 1 g/ml in PBS gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der ImageJ-Software (Version 1.53a, National Institutes of Health, USA) analysiert.

2.9. AlphaLISA-Assay zur Messung des Gehalts an Prokollagen Typ I C-Peptid (PIP).

In diesem Schritt wurden 8 × 103 HDF in eine 96-Well-Platte ausgesät und 24 Stunden lang mit JasHEx (0.0006 Prozent, 0,002 Prozent, behandelt. und 0,006 Prozent p/v) oder mit TGF- (2,5 ng/ml). Nach der Behandlung wurden die Zellen gemäß den Anweisungen des Alpha-LISA-hPIP-Kollagen-Kit-Anbieters (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)) verarbeitet.

2.10. Nrf2-Luciferase-basierter Transkriptionsaktivierungstest

Hier wurden 6 × 103 HaCaT-Zellen in einer 96-Well-Platte ausgesät und 16 Stunden lang gezüchtet. Danach wurden sie einem Nrf2-Luciferase-basierten Transkriptionsaktivierungstest unter Verwendung des ARE-Reporterkits BPS Bioscience (San Diego, CA, USA, #60514) unterzogen. Ein transfektionsbereiter ARE-Luciferase-Reportervektor (der ein Firefly-Luciferase-Gen unter der Kontrolle von ARE-responsiven Elementen enthält, die sich stromaufwärts eines Minimalpromotors befinden) wurde zusammen mit einer internen Kontrolle (einem konstitutiv exprimierenden Renilla-Luciferase-Vektor) vorübergehend in HaCaT-Zellen co-transfiziert X-TREME-Gen-HP-DNA-Transfektionsreagenz (Roche, Basilea, Schweiz, #6366244001). Nach 24-stündiger Transduktion wurden die Zellen 2 Stunden lang mit dem Extrakt (0,0006 Prozent, 0,002 Prozent und 0,006 Prozent p/v) oder der Positivkontrolle Resveratrol (50 µM) behandelt. Danach wurden sie dem Luciferase-Assay mit dem Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Rom, Italien #E2920) unterzogen. Kurz gesagt, die Zellen wurden 10 Minuten lang mit Glühwürmchen-Luciferase-Substrat inkubiert, bevor die Lumineszenz in einem 96--Well-Plattenlesegerät (Victor Nivo, Waltham, MA, USA) gemessen wurde. Das Verhältnis der Lumineszenz von Glühwürmchen und Renilla wurde berechnet, um die Transkriptionsaktivität von Nrf2 zu normalisieren und zu vergleichen.

2.11. Analyse der Expression der Gene SOD-1(NM_000454.5) und OH-1(NM_002133.3) in HaCaT-Zellen

Für diesen Prozess wurden 1,5 × 105 HaCaT-Zellen pro Vertiefung 16 Stunden lang in 6-Well-Platten gezüchtet und 6 Stunden lang mit dem Extrakt (0,002 Prozent und 0,006 Prozent) inkubiert p/v) oder 50 µM Resveratrol als Positivkontrolle. Am Ende der Inkubation wurde die Gesamt-RNA mit dem „GenElute™ Total RNA Purification“-Kit (von Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) extrahiert und bei 37 °C mit DNase I (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) behandelt 30 Minuten bei ◦C, um genomische DNA-Verunreinigungen zu entfernen. 500 ng Gesamt-RNA wurden mit dem Enzym Reverse Transkriptase (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) retrotranskribiert. Semiquantitative RT-PCRs wurden unter Verwendung des Universalpaars durchgeführt Primer 18S Primer/Kompetitor (Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) als interne Standards. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5-prozentigem Agarosegel aufgetrennt und mit dem iBright-Instrument (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) betrachtet. Die Sequenzen der zur Amplifikation verwendeten Primer waren die folgenden: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Stickoxid-Assay in LPS-stimuliertem RAW 264.7

Die NO-Konzentration wurde in RAW 264.7 murinen Makrophagen bestimmt, die mit einer Konzentration von 1,5 × 105 Zellen/Well in 96-Well-Platten für 24 Stunden ausgesät und mit dem Extrakt ({{1 0}}.0006 Prozent, 0,002 Prozent und 0,006 Prozent p/v) oder mit 10 µM TPCK (Positivkontrolle) für 2 Stunden, vor der Inkubation mit 2 µg/ml LPS für 18 Stunden. Die in Nitrit umgewandelte NO-Menge wurde durch Zugabe von Griess-Reagenz (Lösung von N-(1-Naphthyl)ethylendiamin und Sulfanilsäure, Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) berechnet und nach 30 Minuten Die Absorption wurde bei 540 nm mit dem Multiwell-Plattenlesegerät (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen.

3. Ergebnisse

3.1. Qualitative und quantitative Analyse von Hydro-Ethanol-Extrakt aus Jasminum-sambac-Zellkultur (JasHEx)

Es wurde eine UPLC-MS/MS-Analyse von JasHEx durchgeführt und hochauflösende spektrometrische Daten mithilfe von Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) analysiert, einem webbasierten Massenspektrometriesystem, das bei der Annotation von Naturstoffen (NPs) hilft [18]. . Insbesondere wurde eine GNPS-Spektralbibliothek durchgeführt, um eine Online-Dereplikation zu erreichen. Chemische Spezies, die nicht durch GNPS identifiziert wurden, wurden entsprechend der Literatur zugeordnet. Wie in den Abbildungen 1 und 2 sowie Tabelle 1 dargestellt, wurden mehr als 50 Verbindungen identifiziert, die zu mehreren Klassen von Sekundärmetaboliten, hauptsächlich Polyphenolen und Terpenen, gehören. Tatsächlich enthält JasHEx-Extrakt Phenolsäurederivate, Lignane (Secoisolariciresinol, Nortrachelogenin und Matairesinol) und Triterpenoide (Arjunolsäure, Asparaginsäure, Maslinsäure, Oleanolsäure und Ursolsäure).

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