Studien haben gezeigt, dass Autophagie eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären LD-Ablagerung spielt Teil 2

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2.14. Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay

Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden Zellen in einer 96-Well-Platte mit 5000 Zellen/Well ausplattiert, und ein Kulturmedium wurde gesammelt, um die LDH-Spiegel mit einem Assay-Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) zu messen. Dann wurde die Extinktion der Proben durch das Multiskan-Spektrum (Thermo Fisher Scientific) bei 450 nm nachgewiesen.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 und tiefrote Färbung mit MitoTracker

Lebende Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) oder BODIPY 581/591 C11 (BD-C11) (2.0) inkubiert. μM, InvitrogenTM, Cat D3861) in PBS für 15 min bei 37 Grad Für die MitoTracker Deep Red-Färbung wurden lebende Zellen mit 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) in PBS für 30 min bei 37 Grad inkubiert wurden zweimal in PBS gewaschen und in 3,5 % PFA für 10 min fixiert, gefolgt von Waschen und Gegenfärben mit Hoechst 3342 (Sigma, Kat. B2261) für 10 min, bevor sie zur Abbildung auf Glasobjektträger aufgetragen wurden.wie viel cistanche zu nehmenBilder wurden beobachtet und Fotografien wurden durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen (Olympus, Tokio, Japan).

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2.16. Hoechst- und PI-Färbung

Die Zellen wurden mit Hoechst 33.342 (1 ul verdünnt in 5 0 0 ul PBS, Sigma, Cat B2261) und (oder) PI (0,1 ul verdünnt in 500 ul PBS, Solarbio, (cistanche sleep) CA1020) für 10 min und gefärbt dann fixiert und fluoreszenzmikroskopisch beobachtet (Olympus, Tokio, Japan).

2.17.Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden verdaut und mit D-Hanks gespült, dann mit Annexin V-FITC (5 ul verdünnt in 5 00 ul PBS)/PI (0,1 ul verdünnt in 500 ul PBS) Apoptose-Kit (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian) gefärbt ) nach Herstellerprotokoll. Danach wurden apoptotische Zellen mittels Durchflusszytometrie (Guava easyCyterM 8, Millipore, USA) analysiert. Mitochondriale ROS- und mitochondriale Membranpotentialmessungen wurden wie in 【12】 veröffentlicht durchgeführt. SH-SY5Y-Zellen wurden mit MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, USA) oder mit JC1 (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) bei 37 Grad für 30 Minuten gefärbt. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen dann in kaltem PBS, das 1 Prozent FBS enthielt, für die durchflusszytometrische Analyse resuspendiert. Die Daten wurden mit der FCS Express Software (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA) analysiert.

2.18. Seepferdchen-Atmungsassays

Die mitochondriale Atmungsfunktion in lebenden SH-SY5Y-Zellen wurde mit dem extrazellulären Flussanalysegerät von Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) über Änderungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen. SH-SY5Y-Zellen, die mit 3 × 10³ Zellen/Vertiefung ausgesät wurden, ließ man an den Seepferdchen-Zellkulturplatten haften und erreichten zum Zeitpunkt des Experiments eine Konfluenz von etwa 80 Prozent (Cistanchentee). Am folgenden Tag wurden die Zellen mit Ka und dann vorbehandelt weitere 24 h MPP* ausgesetzt. OCR wurde unter basalen Bedingungen nachgewiesen, gefolgt von der sequentiellen Zugabe von 1 μM Oligomycin, 1 μM FCCP sowie 1 μM Rotenon & Antimycin A.

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2.19. statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Signifikanz des Unterschieds wurde durch Student's t-Test, Zweiweg-Varianzanalyse oder Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test, bestimmt. Der Unterschied wurde bei P als signifikant angesehen<>

3. Ergebnisse

Ergebnis1. Ka stellt die motorische Dysfunktion wieder her und erhöht die Dopaminspiegel im Striatum von MPTP/p PD-Modellmäusen

Um die neuroprotektive Wirkung der Kaon-PD-Pathogenese zu untersuchen, wurde 4- Monate alten männlichen C57BL/6-Mäusen das Neurotoxin MPTP injiziert, um das MPTP/p-PD-Modell zu etablieren, und sie wurden mit Ka behandelt (Abb. la). Nach Modellinduktion wurden der Rotarod-Test und der Pole-Test verwendet, um die motorische und Verhaltensleistung der Mäuse in den verschiedenen Gruppen zu bewerten. Wie gezeigt, war die Rotarod-Leistungszeit bei mit MPTP behandelten Mäusen deutlich reduziert, und dieser Effekt wurde durch Ka verhindert (Fig. 1b). (Nutzen von Cistanche tubulosa) Ka stellte auch die durch MPTP induzierten Verhaltensdefizite wieder her, wie durch die Verkürzungen der Wendezeit und der Gesamtzeit im Stangentest angezeigt wird (Abb. 1c und d), ohne das Körpergewicht der Mäuse zu beeinflussen (Abb. le). Darüber hinaus zeigte die HPLC-Analyse, dass der Dopaminspiegel im Striatum bei MPTP/p-gereizten Mäusen signifikant verringert war und dieser Spiegel durch die Ka-Behandlung wiederhergestellt wurde (Abb. 1f). (Cistanche tubulosa-Extrakt) Die Ka-Behandlung linderte auch das MPTP/ p-induzierte Reduktion der Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC, ein Metabolit von Dopamin) im Striatum (Abb. 1g).Superman-Kräuter CistancheDiese Ergebnisse legen nahe, dass Ka die motorische Dysfunktion wiederherstellt und die Dopaminspiegel im Striatum bei MPTP-induzierten Parkinson-Mäusen erhöht.

Ergebnis 2. Ka lindert den Verlust von DA-Neuronen im SNpc von MPTP/p PD-Modellmäusen

Als nächstes, um die neuroprotektive Wirkung von Kaon MPTP/p-induzierter neuronaler DA-Beeinträchtigung weiter zu bewerten, untersuchten wir Tyrosinhydroxylase (TH)-Neuronen im murinen SNpc durch Immunfärbung. Wie in Fig. 2a und b gezeigt, induzierte MPTP/p eine signifikante Verringerung der Anzahl von TH-Neuronen, die durch die Ka-Behandlung gemildert wurde. Darüber hinaus stereologische Zählungen der gesamten Neuronen im SNpc, wie von Nissl definiert

Abb.1. Die Ka-Behandlung lindert die motorische Dysfunktion und erhöht die Dopaminspiegel im Striatum von MPTP/p-PD-Modellmäusen.

(a) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. (cistanche tubulosa reddit) (b) Die Zeit am Stab wurde für den Rotarod-Test an drei aufeinanderfolgenden Tagen gemessen. (cd) Für den Stangentest wurde die Zeit für das Umdrehen (Zeit des Wendens) und das Hinabsteigen an einer Stange (Zeit des Kletterns) aufgezeichnet. (e) Das Körpergewicht der Maus wurde am Ende der Studie gemessen. (fg)Dopamin (DA) und Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) im Striatum wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwert ± SEM.n=9-10 für jede Gruppe in (b,c,d);n=6-8 für jede Gruppe in (f,g).ns, nicht signifikant,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">Vorteile von BioflavonoidenKa verbesserte signifikant die MPTP-induzierte Verringerung der TH- und DAT-Proteinexpression, wie durch Western-Blotting gemessen wurde (Abb. 2e-g). Dieser Nachweis bestätigt die neuroprotektive Wirkung von Kaon im PD-Mausmodell.

Ergebnis 3. Ka reduziert die Akkumulation von LD-Vakuolen und oxidativen Stress im SNpc von MPTP/p-behandelten Mäusen

Zunehmende Beweise haben die Beteiligung von LDs an NDDs gezeigt [10], konsistent, unsere frühere Arbeit identifizierte erhöhte LDs im SNpc von MPTP-induzierten PD-Mäusen [12].LDs können leicht identifiziert werden und zeigen runde, homogene Strukturen mit geringer Dichte amorpher Inhalt [28]. Normalerweise können LDs über Autophagie abgebaut werden, um eine Akkumulation zu vermeiden [29].Cistanche kaufenUm zu untersuchen, ob Ka LDs bei PD regulieren kann, wurde die Akkumulation von LDs durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) im SNpc von Kontroll-, MPTP/p- und MPTP/p ＋ Ka-Mäusen analysiert. Wie in unserer früheren Arbeit [12] gezeigt, waren die Anzahl und Größe der LDs

erhöhte sich bei MPTP/p-Mäusen im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen (Fig. 3a und b) und war bei Ka-behandelten Mäusen signifikant reduziert (Fig. 3c-e). Darüber hinaus wurden bei Ka-behandelten Mäusen LDs häufiger auch in der Nähe beobachtet, eingeschlossen in oder abgebaut durch Autolysosomen, die als elektronendichte Lipofuszin-Körnchen definiert wurden. Eine weitere histologische Färbung von TH-Neuronen mit BODIPY, einem Farbstoff, der spezifisch neutrale Lipide markiert und häufig zum Nachweis von LDs verwendet wird [30], zeigte, dass sowohl die Anzahl als auch die Größe von BODIPY plus LDs im SNpc bei PD-Mäusen höher waren als bei Kontrollen. und wurden durch Ka-Behandlung signifikant verringert (Abb. 3f-h).

Wenn LDs nicht rechtzeitig abgebaut werden können, können die angesammelten LDs einer Peroxidation unterliegen und zu mitochondrialem ROS-vermitteltem Stress beitragen [4],Distanzdas die Neurotoxizität und das Fortschreiten der Krankheit verstärkt. Daher untersuchten wir weiter die Expressionsprofile von Genen, die mit dem Schutz vor freier FA-Toxizität (Gpx8), der Neutralisierung oxidativer Spezies, Superoxidradikalen (Sod3) und Wasserstoffperoxid (Cat) und dem FA-Metabolismus (Acsbg1 und Dbi) assoziiert sind [31]. , die alle im SNpc von MPTP-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen auffallend verringert waren, und diese Wirkungen wurden in Ka-behandelten PD-Mäusen verbessert ( 3i ). In ähnlicher Weise erhöhte auch MPTP/p die mRNA-Expressionsniveaus

Abb.2. Ka verbessert den Verlust von DA-Neuronen im SNpc von MPTP/p PD-Modellmäusen.

(ab) Mikrofotografien von Tyrosinhydroxylase(TH)-positiven Neuronen (a) und stereologische Zählungen von TH-positiven Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Maßstabsbalken sind wie angegeben. (cd) Mikrofotografien von Cresylviolett-positiven Zellen (c) und stereologische Zählungen von Cresylviolett-positiven Zellen im SNpc (d). Maßstabsleiste, 120 um. (z. B.) Western-Blot-Analyse der TH- und DAT-Proteinexpression im SNpc (e) und quantitative Analyse (f, g). Die quantifizierten Daten sind auf die Kochsalzkontrollgruppe normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Ergebnis 4. Ka schützt SH-SY5Y-Zellen vor MPP plus -induzierter Apoptose

MPP, der aktive Metabolit von MPTP, hemmt Enzyme des mitochondrialen Komplexes und verursacht den Zelltod, der direkt mit PD verbunden ist [32]. Als nächstes untersuchten wir, ob Ka MPPt-induzierte neuronale Apoptose in vitro verhindern könnte. Wie in 4a und b gezeigt, induzierte MPPt (40 &mgr;M, 24 h) die Freisetzung von LDH aus SH-SY5Y-Zellen, und Ka (30 und 60 &mgr;M) schwächte die LDH-Freisetzung signifikant ab, ohne das Zellüberleben zu beeinträchtigen ( 4a ). Da Ka bei einer Konzentration von 30 μM eine erhebliche Schutzwirkung ausübte (Abb. 4b）, wir haben diese Konzentration in nachfolgenden Experimenten verwendet. Die Hoechst/PI-Färbungsergebnisse zeigten auch, dass Ka den Prozentsatz von Zellen mit MPPt-induzierter Chromatinkondensation (Abb. 4c und d) und zellulärer Apoptose signifikant verringerte, wie durch die erhöhte Hoechst-Fluoreszenzintensität (Abb. 4c) und den Prozentsatz von belegt Hoechst/PI-gefärbte Zellen (Hoechst plus /PI') (Abb. 4e). Wie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurde, war MPP plus induzierte Zellapoptose, belegt durch den erhöhten Prozentsatz von Annexin V-gefärbten Zellen (AV /PI und AV plus /PI plus ), durch Ka geschützt ( 4f und g). Darüber hinaus kehrte Ka MPP-induzierte Veränderungen in der Apoptose-assoziierten Proteinexpression deutlich um, wie durch die Hochregulierung von Bcl-2, die Herunterregulierung von Bax (Abb. 4hi-j) und die verringerte Spaltung von Caspase-3 belegt wurde. (Abb. 4h, k). Diese Daten legen nahe, dass Ka die nachteiligen Wirkungen von MPPt auf das Zellüberleben aufheben kann.

Ergebnis 5. Ka unterdrückt MPPt-induzierte LD-Akkumulation und Lipidperoxidation, die mitochondriale Schäden in SH-SY5Y-Zellen vermitteln

Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine unerwartete LD-Akkumulation zu erhöhtem Lipidperoxidations-vermitteltem Stress führen und die mitochondriale Dysfunktion beschleunigen kann, was die Neurodegeneration fördert [10]. Unsere früheren Arbeiten zeigten auch, dass die erhöhten LDs im SNpc mit der PD-Pathologie bei Mäusen assoziiert waren [12]. Um zu untersuchen, ob die Schutzwirkung von Ka mit der LD-Akkumulation in vitro zusammenhängt, führten wir zunächst eine LD-spezifische Färbung in SH-SY5Y-Zellen mit BODIPY 493/503 durch und beobachteten eine erhöhte LD-Ablagerung (erhöhte Konzentrationen neutraler Lipide).

Ergebnis 6. Ka fördert die Autophagie und verringert die mtROS-Produktion in mit MPP plus behandelten SH-SY5Y-Zellen

Normalerweise werden LDs über Autophagie an Lysosomen abgegeben und können in FAs zerlegt werden, um eine Peroxidation zu vermeiden. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass die Autophagie beeinträchtigt ist, was bei PD eine entscheidende Rolle spielt [2]. Wenn die Autophagie die Portionierung von LDs beinhaltet, die in Lysosomen abgebaut werden sollen (Abb. 6a), wird der Prozess speziell als Lipophagie bezeichnet [2]. Um zu untersuchen, ob Autophagie an der neuroprotektiven Wirkung von Ka beteiligt ist, untersuchten wir die Spiegel von Autophagie-assoziierten Proteinen. Wie in Fig. 6b-d gezeigt, war in kultivierten SH-SY5Y-Zellen die Menge an Mikrotubuli-assoziiertem Protein der leichten Kette 3 (LC3)-II deutlich reduziert, während die Expression von p62 in mit MPP plus behandelten Zellen deutlich erhöht war. wie durch Immunoblotting gemessen, und dieser Effekt wurde durch Ka signifikant umgekehrt. Wir untersuchten weiter die Veränderungen in der Autophagie durch Immunfärbung für LC3. Damit sich Autophagosomen in Zellen ansammeln können, wurde Bafilomycin hinzugefügt, um die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen zu verhindern. Wie gezeigt, wurden erhöhte Zahlen von LC3b-Punkten in MPP*-behandelten Zellen nachgewiesen, was auf einen beeinträchtigten autophagischen Abbau hinweist, und dieser Effekt wurde auch durch Ka umgekehrt (Fig. 6e und f). Diese Ergebnisse zeigen, dass LDs in SH-SY5Y-Zellen durch Autophagie für eine eventuelle Entfernung mobilisiert werden und dass Ka die Autophagie fördern kann, um die Ansammlung von oxidierten Lipiden zu reduzieren. Eine erhöhte Lipidperoxidation kann die mitochondriale Schädigung verschlimmern, indem sie den mitochondrialen oxidativen Stress erhöht [4]. Darüber hinaus reduzierte die Ka-Behandlung signifikant die robuste mtROS-Generation, wie durch MitoSOX-Färbung (Abb. 6g und h) bestimmt, und verringerte die Anzahl dysfunktionaler Mitochondrien, wie durch mitochondrienspezifische Markierungen bestimmt, um zwischen Atmung (MitoTracker tiefrot) und Gesamt ( MitoTracker grün) Mitochondrien (Abb. 6i und j). Um einen direkten Überblick über mitochondriale Veränderungen zu erhalten, haben wir außerdem die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) mit dem Seahorse XF-Analysator erfasst. Wie in Abb. 6k gezeigt, war die Mitochondrienatmung in MPPt-behandelten Zellen verringert, während die Ka-Behandlung diesen durch MPP plus verursachten Schaden offensichtlich umkehrt (Abb. 6k).

Ergebnis7. Die Autophagiehemmung kehrt die unterdrückende Wirkung der Kaon-LD-Akkumulation, der mitochondrialen Dysfunktion und der DA-Neuronenschädigung in vitro um

Um zu untersuchen, ob Autophagie einer der Hauptmechanismen ist, durch die Ka die DA-Neuroprotektion vermittelt, wurde der Autophagie-Inhibitor 3-MA verwendet. Wir fanden heraus, dass die hemmenden Wirkungen von Ka auf MPP#-induzierte Verletzungen, einschließlich einer verringerten LD-Akkumulation (Abb. 7a und b), einer verringerten mtROS-Produktion (Abb. 7c und d) und einer gelinderten mitochondrialen Dysfunktion (Abb. 7e und f) in SH-SY5Y-Zellen wurden durch 3-MA signifikant blockiert. Da LD-Oxidation und mitochondriale Dysfunktion eng mit DA-Neuronentod verbunden sind, untersuchten wir als nächstes primär kultivierte DA-Neuronen. Wir behandelten kultivierte Mittelhirn-TH plus Neuronen mit Ka und/oder MPPf und quantifizierten die Anzahl und Länge von TH plus neuronalen Fortsätzen durch Immunfärbung. Die morphologische Analyse ergab, dass die Anzahl und Länge der neuronalen Fortsätze durch MPP plus deutlich verringert und durch Ka geschützt wurden, und dieser Schutz durch 3-MA weiter aufgehoben wurde (Abb. 7g-i). Diese Daten weisen darauf hin, dass Ka die neuronale DA-Schädigung durch Förderung der Autophagie lindert.

Ergebnis 8. Die Stummschaltung von Atg5 hob die Ka-vermittelte Verhinderung von neuronalem Verlust in vivo auf

Um weiter zu bestätigen, dass Ka vor MPTP/p-induziertem TH plus neuronalem Verlust in einer Autophagie-abhängigen Weise schützt, haben wir Atg5 durch Mikroinjektion eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das eine zuvor charakterisierte shRNA gegen Atg5 exprimiert, in das bilaterale Mittelhirn stummgeschaltet (Abb .8a), wie zuvor beschrieben [25]. In vorläufigen Experimenten beobachteten wir, dass die Atg5-shRNA-Transfektion für 2 Wochen eine ausreichende GFP-Expression in TH-plus-Neuronen erreichte (Abb. 8b) und die ATG5-Expression im SNpc der injizierten Mäuse hemmte (Abb. 8c). Wir fanden heraus, dass der Atg5--Knockdown die neuroprotektive Wirkung von Ka umkehrte, wie durch die hochregulierte Proteinexpression von TH (Abb. 8d und e) und die erhöhte Anzahl von TH plus Neuronen (Abb. 8f und g) belegt wurde. Diese Daten unterstützen weiter den Beitrag der Autophagie zur Schutzwirkung von Ka bei PD-Mäusen. Zusammenfassend bestätigten wir, dass Ka vor MPTP/p-induzierten Verletzungen schützt, indem es die LD-Oxidation und die mitochondriale Dysfunktion durch die Förderung der Autophagie reduziert.

4. Diskussion

Die vorliegende Studie zeigte, dass das natürliche kleine Molekül Ka ein Schlüsselfaktor war, durch den die autophagische Signalübertragung die oxidative Toxizität von Lipiden hemmen könnte. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Autophagie-Weg eine wichtige Regelschleife ist, durch die Ka die LD-Peroxidation und die anschließende mitochondriale Schädigung lindert, und konzentrierten sich auf die Rolle der durch die Autophagie regulierten LD-Toxizität bei der Linderung der mitochondrialen Schädigung, während gleichzeitig die Neurodegeneration aufgrund von übermäßigem oxidativem Stress verhindert wird (Abb. 9).

LDs sind die intrazellulären Orte der neutralen Lipidspeicherung [5] und sind entscheidend für den Lipidstoffwechsel und die Energiehomöostase, während eine LD-Dysfunktion mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde [16]. Es häufen sich Hinweise darauf, dass die Rollen, die LDs in Biologie und Pathologie spielen, wesentlich breiter sind als bisher angenommen. Im ZNS hat sich gezeigt, dass erhöhte LDs in Neuronen und Glia an neurodegenerativer Pathologie beteiligt sind [10,36]. Im Einzelnen wurden LDs sowohl in den Axonen von in vitro kultivierten Aplysia-Neuronen [37] als auch in Gehirnschnitten nachgewiesen Modelle der Huntington-Krankheit [38]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Neuronen besonders empfindlich auf Lipidtoxizität reagieren und die Ansammlung von LDs, die nicht rechtzeitig entfernt werden können, zu einer beschleunigten LD-Peroxidation führt und zu einer Neurodegeneration führen kann [17].

Die Lipidakkumulation in hyperaktiven Neuronen ist nicht nur wegen der Anfälligkeit dieser Lipide für Peroxidation toxisch. Darüber hinaus kann der Inhalt der überschüssigen LDs in nichtoxidative Stoffwechselwege gelangen und eine übermäßige Produktion von Ceramid auslösen, das für Zellen toxisch ist [39]. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass FAs in LD-defekten Zellen in Acylcarnitine umgewandelt werden können, die dann eine mitochondriale Dysfunktion und ROS-Produktion verursachen [40]. Diese Prozesse haben wahrscheinlich spezifische und tiefgreifende Folgen in hyperaktiven Neuronen, da dysfunktionale Mitochondrien die Fähigkeit zum FA-Verbrauch beeinträchtigen und die mtROS-Produktion weiterhin eine Lipidperoxidation der Membran verursacht.

Daher sollte die LD-Homöostase in Neuronen gut kontrolliert werden, was entscheidend ist, um Toxizität zu vermeiden und letztendlich die Gesundheit des Gehirns zu erhalten. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass das kleine natürliche Molekül Ka die neuronale LD-Toxizität hemmt, die sich in einer erhöhten LD-Akkumulation, einer erhöhten Lipidperoxidation und einer hochregulierten Genexpression im Zusammenhang mit der Lipidtoxizität in MPP#-befallenen SH-SY5Y-Zellen manifestiert. Noch wichtiger ist, dass wir auch gezeigt haben, dass die Ka-Behandlung die 45 reduziert]. erhöhte Anzahl von in Zellen abgelagerten LC3B-Pünktchen. Defekte Lipophagie in verletzten SH-SY5Y-Zellen wurde durch Behandlung mit Ka rückgängig gemacht. Infolgedessen verringerte Ka die Akkumulation von oxidierten LDs, beschädigten Mitochondrien und der mtROS-Erzeugung in MPP#-behandelten SH-SY5Y-Zellen. Wichtig ist, dass die Hemmung der Autophagie durch 3-MA die Ka-vermittelte Eliminierung von oxidierten LDs und geschädigten Mitochondrien aufhob und die Schädigung von DA-Neuronen in vitro linderte. Darüber hinaus kehrte die Hemmung der Autophagie durch Atg5-Knockdown in vivo die schützenden Wirkungen der neuronalen Degeneration von Kaon DA im MPTP-induzierten PD-Mausmodell um. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Ka die mit LD-Toxizität in Zusammenhang stehende mitochondriale Schädigung hemmt, indem es die Autophagie in einem experimentellen PD-Modell fördert.

Es häufen sich Hinweise darauf, dass eine erhöhte mtROS-Erzeugung ein primäres Merkmal hochaktiver Neuronen ist und bei vielen NDDs, einschließlich PD, beobachtet wurde [46]. Berichte darüber, ob ROS eine Ursache oder Folge der LD-Bildung ist, sind widersprüchlich [47,48]. Interessanterweise zeigten unsere In-vitro-Ergebnisse, dass die pharmakologische Hemmung der LD-Peroxidation mit o-Tocopherol die mtROS-Erzeugung und Anomalien des mitochondrialen Membranpotentials verhinderte und die mitochondriale Reduktion linderte, wie die Tomm20-Färbung in SH-SY5Y-Zellen belegt, was die Idee stützt, dass die LD-Peroxidation eine Rolle spielt ursächliche Rolle bei der MPP-induzierten mitochondrialen Dysfunktion und der Entstehung von mtROS. Es ist jedoch möglich, dass erhöhte ROS zunächst die LD-Bildung beschleunigen und anschließend LDs eine weitere ROS-Bildung induzieren und die intrazellulären und mitochondrialen ROS-Spiegel verschlimmern.

In der vorliegenden Studie zeigten wir, dass Mäuse mit MPTP-induzierter Parkinson eine hohe LD-Akkumulation aufwiesen, die von einem erhöhten Verlust von DA-Neuronen, beschleunigtem ROS-vermitteltem Stress und Verhaltensdefiziten begleitet wurde. Die Ka-Behandlung verhinderte die LD-Toxizität in vitro und verbesserte den DA-Neuronenverlust und Verhaltensdefizite im PD-Mausmodell, und diese Wirkungen waren von der Autophagie abhängig. Daher ist es vernünftig zu schlussfolgern, dass Ka die Autophagie fördert und diese verstärkte Autophagie die oxidierte LD-Akkumulation verringert, die mtROS-Produktion reduziert und mitochondriale Schäden in DA-Neuronen lindert, was zur Hemmung der LD-Toxizität beiträgt und dadurch die PD-Pathologie abschwächt (Abb 9).

Finanzierung

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81903587), des von der China Postdoctoral Science Foundation (Nr. 2019M661807) finanzierten Projekts, der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Nr. BK20190120) und der Open Project of Chinese Materia Medica First-Class Discipline of Nanjing University of Chinese Medicine (No. 2020YLXK006) und the Drug Innovation Major Project (No.2018ZX09711001-003-007).

Dieser Artikel ist aus Redox Biology 41 (2021) 101911 entnommen