TLR9-Aktivierung induziert abweichende IgA-Glykosylierung über APRIL- und IL-6-vermittelte Wege bei IgA-Nephropathie
Mar 11, 2022
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Yuko Makita1, Hitoshi Suzuki1, Toshiki Kano1, Akiko Takahata1, Bruce A. Julian2,3, Jan Novak3 und Yusuke Suzuki1
SCHLÜSSELWÖRTER: APRIL; Galactose-defizientes IgA1; IgA-Nephropathie; IL-6; Immunkomplex
Galaktose-defizientes IgA1 (Gd-IgA1) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entstehung vonIgA-Nephropathie(IgAN). Die pathogenen Mechanismen, die die Gd-IgA1-Produktion antreiben, sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass die Aktivierung des angeborenen Immunsystems über den Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9) an der Gd-IgA1-Produktion beteiligt ist. Von einem proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL) und IL-6 ist auch bekannt, dass sie die Gd-IgA1-Synthese in IgAN verstärken. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir, wie die TLR9-Aktivierung in IgA-sekretierenden Zellen zu einer Überproduktion von nephritogenem IgA in der IgAN-anfälligen ddY-Maus und in humanen IgA1--sekretierenden Zellen führt. Die Injektion des TLR9-Liganden CpG-Oligonukleotide erhöhte die Produktion von aberrant glykosylierten IgA- und IgG-IgA-Immunkomplexen in ddY-Mäusen, die sich wiederum verschlimmertenNierenverletzung. CpG-Oligonukleotid-stimulierte Mäuse hatten erhöhte APRIL-Serumspiegel, die mit denen von anormal glykosyliertem IgA und IgG-IgA-Immunkomplexen korrelierten. In-vitro-,TLR9-Aktivierungverstärkte die Produktion des nephritogenen IgA sowie von APRIL und IL-6 in Splenozyten von ddY-Mäusen und in humanen IgA1--sekretierenden Zellen. Der siRNA-Knockdown von APRIL unterdrückte jedoch vollständig die durch IL-6 induzierte Überproduktion von Gd-IgA1. Die Neutralisierung von IL-6 verringerte die CpG-Oligonukleotid-induzierte Überproduktion von Gd-IgA1. Darüber hinaus vermittelten die APRIL- und IL-6-Signalwege unabhängig voneinander eine TLR9--induzierte Überproduktion von Gd-IgA1. Somit verstärkte die TLR9-Aktivierung die Synthese von aberrant glykosyliertem IgA, das in einem Mausmodell von IgAN die Nierenschädigung weiter verstärkte. Daher verstärken APRIL und IL-6 sowohl synergistisch als auch unabhängig voneinander die Synthese von Gd-IgA1.
Übersetzungserklärung
Eine krankheitsspezifische Therapie, die auf Galactose-defizientes IgA1 abzielt, kann eine zukünftige Behandlung darstellenIgA-Nephropathie. Die Ergebnisse dieser Studie, die die Beteiligung eines proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL) und von Interleukin-6 (IL-6) an der Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA zeigten, unterstützen die Begründung für das Targeting von APRIL und IL{ {3}} bei IgA-Nephropathie (IgAN). Tatsächlich zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie positive Wirkungen des monoklonalen Anti-APRIL-Antikörpers auf murines IgAN1, und eine klinische Studie mit neutralisierenden APRIL-Antikörpern bei Patienten mit IgAN läuft derzeit.
Die IgA-Nephropathie (IgAN), die häufigste primäre Glomerulonephritis,2 verursacht bei 20 bis 40 Prozent der Patienten innerhalb von 20 Jahren nach Beginn dieser Erkrankung eine Nierenerkrankung im Endstadium.3 Obwohl die Pathogenese von IgAN noch vollständig aufgeklärt werden muss, ist sie episodisch makroskopische Hämaturie gleichzeitig mit einer Infektion der oberen Atemwege deutet darauf hin, dass das mukosale Immunsystem eine wichtige Rolle bei den klinischen Manifestationen von IgAN spielt.4
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Abweichende Glykosylierung von IgAist zentral in der Pathogenese von IgAN. Glomeruläres IgA bei Patienten mit IgAN ist auf die Unterklasse IgA1 beschränkt und mit Molekülen angereichert, die einige O-Glykane in der Gelenkregion aufweisen, die einen Mangel an Galactose aufweisen (Galactose-defizientes IgA1 [Gd-IgA1]).5,6 Darüber hinaus sind die Serumspiegel von Gd -IgA1 und IgA1-enthaltendImmunkomplexe(ICs) mit Gd-IgA1-spezifischen Autoantikörpern sind bei Patienten mit IgAN erhöht.7–9 Allerdings sind die Mechanismen der Produktion von Gd-IgA1 noch nicht vollständig verstanden.
Wir haben in dieser Studie das IgAN-anfällige ddY-Mausmodell verwendet. ddY-Mäuse entwickeln glomeruläre Verletzungen, die denen von Menschen mit IgAN nachahmen.10 Obwohl Mäuse keine IgA-Moleküle mit O-Glykanen haben, die typisch für menschliches IgA1 sind, teilen menschliches IgAN und dieses IgAN-anfällige ddY-Mausmodell einige krankheitsspezifische Merkmale, wie z. B. eine Erhöhung des Serumspiegels von anormal glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC.6,11 Tatsächlich induziert eine anormale IgA-Glykosylierung aufgrund eines Mangels an b1,4--Galactosylierung von N-Glykanen murines IgAN aufgrund einer Erhöhung der Serumspiegel mit hohem Molekulargewicht IgA und IgA-haltiges IC mit nachfolgender renaler Ablagerung und glomerulärer Schädigung.12 ddY-Mäuse zeigen Proteinurie und mesangiale proliferative Glomerulonephritis mit gleichzeitiger Ablagerung von IgA und C3 in den Glomeruli. Eine genomweite Assoziationsstudie identifizierte Kandidaten-Loci, die mit der Progression von IgAN in ddY-Mäusen in Verbindung stehen.13 Die Loci umfassen Gene, die funktionell ähnlich denen sind, die mit menschlichem IgAN assoziiert sind.14,15 Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IgAN in ddY-Mäusen und Menschen betroffen sein könnte zumindest teilweise durch die gleichen Anfälligkeitsgene. Obwohl sich die molekularen Eigenschaften von murinem IgA und menschlichem IgA1 unterscheiden, neigt abweichend glykosyliertes IgA dazu, polymere IgA- und IgG-IgA-ICs zu bilden, die anschließend das Fortschreiten der Nierenschädigung im ddY-Mausmodell von IgAN sowie in menschlichem IgAN vorantreiben. Somit hat das ddY-Mausmodell einige Gemeinsamkeiten mit menschlichem IgAN und kann ein nützliches Werkzeug zur Analyse verschiedener pathogenetischer Merkmale von IgAN sein.
Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind Schlüsselmoleküle des angeborenen Immunsystems und wurden mit der Pathogenese von IgAN in Verbindung gebracht.16–20 Von Pathogenen stammende exogene Antigene aktivieren den TLR9-MyD88-Signalweg.21 Dieser Prozess führt zu signifikant erhöhte Synthese von entzündlichen Zytokinen wie Typ-1-Interferon und Interleukin-6 (IL-6).22 Kürzlich haben wir gezeigt, dass sich die TLR9-Aktivierung verschlimmertNierenverletzungbei IgAN-anfälligen ddY-Mäusen mit einer Erhöhung der Serumspiegel von IgA und IgG-IgA-ICs.16 Darüber hinaus sind spezifische TLR9-Polymorphismen mit dem Fortschreiten der Krankheit bei Patienten mit IgAN assoziiert.16 Serumspiegel von Tumornekrosefaktor-a und IL{{ 6}} sind bei Patienten mit IgAN erhöht.23 Darüber hinaus erhöhen IL-6 und IL-4 die Produktion von IgA1 und verstärken den Grad des Galactosemangels, indem sie die Gd-IgA1-Synthese durch IgA erhöhen{{13} }sezernierende Zelllinien von Patienten mit IgAN.24 Diese Befunde deuten darauf hin, dass IL-6 ein Schlüsselmediator dieses Prozesses sein könnte.24,25.
Das Gen des Mitglieds 13 der Tumornekrosefaktor-Liganden-Superfamilie (TNFSF13) kodiert für einen proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL), der ein zentrales Zytokin für die Reifung und das Überleben von B-Zellen ist.26 APRIL teilt einige Signalrezeptoren, die für die Entwicklung von B-Zellen wichtig sind, mit anderen Ligand der TNF-Superfamilie, B-Zell-Aktivierungsfaktor (BAFF). BAFF ist auch an der Affinitätsreifung von B-Zellen beteiligt. Eine genomweite Assoziationsstudie identifizierte TNFSF13 als eines der mit IgAN assoziierten Kandidatengene.27 Tatsächlich sind bei Patienten mit IgAN die Serumspiegel von APRIL erhöht28 und die Spiegel sind mit der Nierenprognose assoziiert.28
Um ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen zu erlangen, die an der Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA über die TLR9-Aktivierung durch die Liganden CpG-Oligodesoxynukleotide (ODNs) beteiligt sind, verwendeten wir IgAN-anfällige ddY-Mäuse und menschliche IgA1--sezernierende Zellen.
ERGEBNISSE
Die Aktivierung von TLR9 verschlimmerte die Nierenschädigung bei ddY-Mäusen durch eine erhöhte Produktion von nephritogenem IgA
TLR9 kann durch die entsprechenden Liganden wie CpG-ODN aktiviert werden. Um die Wirkung der TLR9-Aktivierung in einem Mausmodell von IgAN zu testen, verwendeten wir eine Injektion des Liganden in IgAN-anfällige ddY-Mäuse. Mäuse, denen CpG-ODN injiziert wurde, entwickelten eine mesangiale Proliferation und eine Expansion der extrazellulären Matrix (Abbildung 1a). Die histologischen Scores der Nieren, basierend auf der mesangialen Proliferation und der Expansion der mesangialen Matrix, waren bei Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, signifikant höher als bei Kontrollmäusen (P < 0.01;="" abbildung="" 1a).="" die="" albuminspiegel="" im="" urin="" der="" mäuse,="" denen="" cpg-odn="" injiziert="" wurde,="" waren="" im="" vergleich="" zu="" denen="" der="" kontrollmäuse="" signifikant="" erhöht="" (p="">< 0.{{20}}1;="" abbildung="" 1a).="" nur="" die="" mäuse,="" denen="" cpg-odn="" injiziert="" wurde,="" entwickelten="" mesangiale="" ablagerungen="" von="" iga,="" igg="" und="" komplement="" c3="" (abbildung="" 1b).="" mäuse,="" denen="" cpg-odn="" injiziert="" wurde,="" zeigten="" signifikant="" höhere="" serumspiegel="" von="" iga="" (p="">< 0,01)="" und="" igg="" (p="">< 0,01)="" als="" kontrollmäuse="" (abbildung="" 1c).="" serum-iga="" von="" mäusen,="" denen="" cpg-odn-mäuse="" injiziert="" wurden,="" hatte="" eine="" geringere="" reaktivität="" mit="" ricinus-communis-agglutinin-i="" (rca-i)="" und="" sambucus-nigra-agglutinin-lektinen="" als="" das="" von="" kontrollmäusen="" (abbildung="" 1c),="" was="" auf="" einen="" niedrigeren="" gehalt="" an="" galactose="" und="" sialinsäure="" auf="" n="" -glykane="" von="" murinem="" iga.="" darüber="" hinaus="" war="" der="" serumspiegel="" von="" igg-iga="" ic="" bei="" mäusen,="" denen="" cpg-odn="" injiziert="" wurde,="" signifikant="" höher="" als="" bei="" kontrollmäusen="" (p="">< 0,05;="" abbildung="" 1c).="" darauf="" deuteten="" diese="" befunde="">TLR9-Aktivierungdurch CpG-ODN führte zu einer Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC, was zuImmunkomplexAblagerungen und Nierenschäden.
B-Zellen und dendritische Zellen waren an den CpG-ODN-Antworten beteiligt
Wir untersuchten, welche Zelltypen an der Induktion einer Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA als Reaktion auf CpG-ODN beteiligt sind. B-Zellen und dendritische Zellen (DCs) wurden aus der Milz von ddY-Mäusen unter Verwendung von Anti-Maus-CD19- bzw. CD11c-Antikörpern durch FL-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung isoliert. Die CpG-ODN-Stimulation von isolierten B-Zellen induzierte eine Überproduktion von IgA. Darüber hinaus erhöhte CpG-ODN die IgA-Produktion signifikant, wenn B-Zellen zusammen mit DCs kultiviert wurden (ergänzende Abbildung S1). Diese Ergebnisse legten nahe, dass CpG-ODN B-Zellen direkt aktivierte und dass DCS die IgA-Produktion nach TLR9-Aktivierung weiter verstärkte.
Die Überproduktion von APRIL verstärkte die Synthese von aberrant glykosylierten IgA- und IgG-IgA-ICs
Wir untersuchten, ob APRIL und/oder BAFF an der durch TLR9-Aktivierung induzierten Synthese von nephritogenem IgA beteiligt waren. Die Injektion von CpG-ODN in ddY-Mäuse erhöhte signifikant die Serumspiegel von APRIL und BAFF (Fig. 2a). Die Expressionsniveaus von APRIL in Splenozyten korrelierten mit der Produktion von aberrant glykosyliertem IgA und der Bildung von IgG-IgA IC (Abbildung 2b). Expressionsniveaus von BAFF in Splenozyten korrelierten mit der Produktion von aberrant glykosyliertem IgA, aber nicht mit der Bildung von IgG-IgA IC (Abbildung 2b). Darüber hinaus korrelierten die Serumspiegel von APRIL, aber nicht von BAFF, signifikant mit erhöhten Serumspiegeln von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC bei den CpG-ODN-injizierten Mäusen (Abbildung 2c). Diese Befunde legen nahe, dass sowohl APRIL als auch BAFF an der Produktion von anormal glykosyliertem IgA beteiligt sein könnten, obwohl APRIL möglicherweise stärker an der Produktion von IgG-IgA IC beteiligt ist.
Abbildung 1|CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN)-stimulierte Produktion von nephritogenem IgA. Die Injektion von CpG-ODN erhöhte die Blutspiegel von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA-Immunkomplex (IC) und verschlimmerte die Nierenschädigung bei ddY-Mäusen. (a) ddY-Mäuse vor der Entwicklung vonIgA-Nephropathie(IgAN) wurden 12 Wochen lang dreimal wöchentlich CpG-ODN ip injiziert. In einer histologischen Analyse von glomerulären Läsionen zeigten Mäuse, denen CpG-ODN injiziert wurde, eine mesangiale Zellproliferation und eine Expansion der extrazellulären Matrix. Das rechte Feld zeigt die Bewertung von Nierenverletzungen durch semiquantitatives Scoring. Nierenhistologische Scores, ausgewertet anhand der Prozentsätze von Glomeruli mit den vorstehend erwähnten Läsionen, zeigten, dass die Nierenschädigung bei Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, verschlimmert wurde. Die Albuminspiegel im Urin bei Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, waren im Vergleich zu denen von Kontrollmäusen signifikant erhöht. Balken in den unteren Feldern bedeuten ¼ ± SEM. (b) Immunhistochemische Analyse von glomerulären IgA-, IgG- und C3-Ablagerungen. Nur Mäuse, denen CpG-ODN injiziert wurde, entwickelten mesangiale Ablagerungen von IgA, IgG und C3. (c) Serumspiegel von IgA, IgG und IgG-IgA-ICs waren nach 12-wöchiger CpG-ODN-Behandlung signifikant erhöht. Serum-IgA in Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, zeigte eine signifikant geringere Reaktivität mit Ricinus-communis-Agglutinin-I (RCA-I)- und Sambucus-nigra-Agglutinin (SNA)-Lectinen als IgA in Kontrollmäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Injektion von CpG-ODN die Serumspiegel von aberrant glykosyliertem IgA erhöhte. Einzelne Punkte werden angezeigt. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optische="" dichte.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">
Abbildung 2|Die Korrelation zwischen der Überproduktion eines proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL) und fehlerhaft glykosyliertem IgA bei Mäusen, denen CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN) injiziert wurde. (a) Die Injektion von CpG-ODN in ddY-Mäuse erhöhte die Serumspiegel von B-Zell-Aktivierungsfaktor (BAFF) und APRIL. (b) Die Expressionsniveaus von BAFF in ganzen Splenozyten korrelierten mit einer reduzierten Reaktivität mit Ricinus communis-Agglutinin-I (RCA-I)-Lectin, korrelierten jedoch nicht mit der Bildung des IgG-IgA-Immunkomplexes (IC). Unterdessen wurden die Expressionsniveaus von APRIL mit der Produktion von aberrant glykosyliertem IgA und der Bildung von IgG-IgA IC in Verbindung gebracht. (c) Bei Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, waren die Serumspiegel von APRIL mit einer verringerten Reaktivität von IgA mit RCA-I-Lektin und erhöhten IgG-IgA-IC-Spiegeln verbunden. Serumspiegel von BAFF korrelierten nicht mit der Produktion von glykosyliertem IgA und der Bildung von IgG-IgA IC. Balken ¼ bedeuten - SEM. *P < 0.05.="" od,="" optische="">
IL-6 induzierte die Produktion von aberrant glykosyliertem IgA
Die Serumspiegel von IL{{0}} bei Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, waren signifikant höher im Vergleich zu Kontrollmäusen (P < 0,05;="" abbildung="" 3a).="" unter="" verwendung="" von="" splenozyten="" von="" igan-anfälligen="" ddy-mäusen="" untersuchten="" wir,="" ob="" die="" tlr9--induzierte="" zelluläre="" aktivierung="" und="" überproduktion="" von="" aberrant="" glykosyliertem="" iga="" durch="" il-6="" vermittelt="" wurden.="" die="" cpg-odn-stimulation="" verstärkte="" die="" produktion="" von="" il-6="" durch="" splenozyten="" in="" vitro.="" die="" zugabe="" von="" il-6="" zum="" kulturmedium="" von="" splenozyten="" erhöhte="" die="" iga-produktion.="" darüber="" hinaus="" verstärkte="" il-6="" die="" synthese="" von="" aberrant="" glykosyliertem="" iga="" und="" die="" bildung="" von="" igg-iga="" ic="" und="" erhöhte="" die="" april-produktion="" (abbildung="" 3a).="" il-6–neutralisierender="" antikörper="" reduzierte="" das="" cpg-odn–-induzierte="" gesamt-iga,="" die="" anormal="" glykosylierte="" iga-produktion="" und="" die="" igg-iga-ic-bildung="" (abbildung="" 3b).="" diese="" ergebnisse="" weisen="" darauf="" hin,="" dass="" die="" tlr9-aktivierung="" zumindest="" teilweise="" durch="" il-="" 6="" vermittelt="" wurde.="" darüber="" hinaus="" können="" ein="" oder="" mehrere="" andere="" tlr9--vermittelte="" wege="" an="" der="" produktion="" von="" abweichend="" glykosyliertem="" iga="" beteiligt="">
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APRIL und IL-6 verstärkten die Synthese von Gd-IgA1 in humanen IgA1--sekretierenden Zellen
Wir haben weiter getestet, ob APRIL und IL-6 den wichtigsten Mediatoren gemeinsam sind, die die Produktion von nephritogenem IgA in humanen IgA1--sekretierenden Zellen steigern. Die CpG-ODN-Ergänzung verstärkte den Anstieg von IL-6, die Expression von APRIL, die Produktion von APRIL-Protein und die Produktion von IgA und Gd-IgA1 (Abbildung 4a). Die Stimulation mit IL-6 und mit APRIL verstärkte die Produktion von IgA und Gd-IgA1 (Abbildung 4b, c). Die Auswirkungen der CpG-ODN-Stimulation auf die Produktion von IgA und Gd-IgA1 wurden teilweise durch IL-6--neutralisierende Antikörper reduziert (Abbildung 4d). Darüber hinaus reduzierte der kleine, interferierende (si)RNA-Knockdown von APRIL auch die durch IL-6-Stimulation induzierte Produktion von IgA und Gd-IgA1 (Abbildung 4b), was darauf hinweist, dass APRIL und IL-6 synergistisch die Erzeugung von Gd fördern -IgA1.
DISKUSSION
Mesangiales IgA in menschlichem IgAN schließt die IgA1-Unterklasse aus, die eine abnormale O-Glykosylierung zeigt. 29,30 Menschliches IgA1 hat eine Hinge-Region mit O-Glykanen, die bei murinem IgA fehlt.6,31,32 Allerdings ist eine abweichende Glykosylierung von N-Glykanen an der Pathogenese eines Mausmodells von IgAN in ddY-Mäusen beteiligt, mit an Erhöhung von anormal glykosyliertem IgA und IgA-haltigem IC.11,12 Anormale Modifikationen von IgA-Kohlenhydraten in O- oder N-Glykanen sind charakteristische Eigenschaften von nephritogenem IgA-haltigem IC.
Mehrere Studien haben die TLR9-Aktivierung bei der Progression von IgAN gezeigt.17–19 In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die Aktivierung von TLR9 durch ip-Injektion von CpG-ODN bei ddY-Mäusen Nierenverletzungen verschlimmerte, die von glomerulären IgA- und IgG-Ablagerungen begleitet wurden, wahrscheinlich weil von erhöhten Serumspiegeln von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC. Darüber hinaus zeigten wir, dass die TLR9-Aktivierung an der Synthese von Gd-IgA1 in humanen IgA1--sekretierenden Zelllinien beteiligt war.
Abbildung 3|Die Wirkung von CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN) und Interleukin (IL)-6 auf kultivierte Splenozyten von ddY-Mäusen. (a) Serumspiegel von IL-6 in Mäusen, denen CpG-ODN injiziert wurde, waren signifikant höher im Vergleich zu Kontrollmäusen. CpG-ODN-Stimulation erhöhte die Produktion von IL-6 von Splenozyten von ddY-Mäusen in Kultur. Die Inkubation von Splenozyten von ddY-Mäusen mit rekombinantem IL-6 erhöhte die Produktion von Gesamt-IgA und anormal glykosyliertem IgA, was zur Bildung des IgG-IgA-Immunkomplexes (IC) führte. Rekombinantes IL-6 erhöhte die Überproduktion eines proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL). (b) Milzzellen in Kultur wurden mit CpG-ODN in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-6-neutralisierenden Antikörpern stimuliert. Anti-IL-6-Antikörper reduzierte die Produktion von Gesamt-IgA und abweichend glykosyliertem IgA und reduzierte folglich die durch CpG-ODN induzierte Bildung von IgG-IgA IC. Balken ¼ bedeuten ± SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optische="" dichte;="" pbs,="" phosphatgepufferte="" kochsalzlösung;="" rca-i,="" ricinus-communis-agglutinin-i;="" sna,="" sambucus="">
Abbildung 4|Die Wirkung von CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN) oder einer proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL)-Supplementierung auf menschliche IgA1--sekretierende Zelllinien auf IgA1, Galactose-defizientes IgA1 (Gd-IgA1) und Interleukin (IL){{ 9}} Produktion. (a) CpG-ODN-Supplementierung verstärkte die Produktion von IL-6. CpG-ODN verstärkte die Genexpression von APRIL. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass CpG-ODN die Proteinspiegel von APRIL erhöhte. Die Ergebnisse wurden densitometrisch ausgewertet. Die Stimulation mit CpG-ODN induzierte die Produktion von IgA und Gd-IgA1. (b) APRIL kleiner, interferierender RNA-Knockdown (siRNA) reduzierte die IL-6-induzierte Überproduktion von IgA und Gd-IgA1. (c) IgA{{2{{30}}}}-produzierende Zellen, die mit rekombinantem APRIL stimuliert wurden, produzierten mehr IgA und Gd-IgA1. (d) IgA1--sezernierende Zellen wurden nach CpG-ODN-Stimulation mit Anti-IL-6-Antikörper inkubiert. Die durch CpG-ODN induzierte verstärkte Produktion von IgA und Gd-IgA1 wurde durch Anti-IL-6-Antikörper und durch siRNA-Knockdown von APRIL reduziert. Balken ¼ bedeuten ± SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01.="" gadph,="" glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase;="" pbs,="" phosphatgepufferte="">
Wir untersuchten den Mechanismus, durch den die TLR9-Aktivierung eine verstärkte Produktion von aberrant glykosyliertem IgA vermittelte. BAFF und APRIL sind für ihre Rolle beim Überleben und bei der Differenzierung von B-Zellen bekannt. McCarthy et al.33 zeigten, dass BAFF-überexprimierende transgene Mäuse mesangiale IgA-Ablagerungen mit Nierenverletzungen und Harnanomalien entwickeln.33 Kürzlich haben wir gezeigt, dass die Genexpression von APRIL in Tonsillen-Keimzentren von Patienten mit IgAN erhöht ist. Darüber hinaus korrelierte die Überexpression von APRIL in Tonsillen-Keimzentren mit den Gd-IgA1-Serumspiegeln und der Schwere der Erkrankung bei Patienten mit IgAN.34 Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl BAFF als auch APRIL an der Pathogenese von IgAN beteiligt sein könnten. Der Zusammenhang zwischen BAFF/APRIL und der TLR9-Aktivierung ist jedoch unklar. In der vorliegenden Studie erhöhte die TLR9-Aktivierung die Genexpression und die Serumspiegel von APRIL. Serumspiegel von abweichend glykosyliertem IgA korrelierten mit Expressionsspiegeln von BAFF und APRIL in Splenozyten. Die Serumspiegel von IgG-IgA IC korrelierten jedoch mit den Expressionsspiegeln von APRIL, aber nicht von BAFF. Darüber hinaus waren die APRIL-Serumspiegel mit der Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC bei den TLR9--aktivierten Mäusen assoziiert. In IgA1--sezernierenden Zellen induzierte die TLR9-Aktivierung auch eine Überproduktion von Gd-IgA1 über APRIL. Diese Ergebnisse legen nahe, dass APRIL eine wichtige Rolle bei der TLR9--induzierten Überproduktion von nephritogenem IgA und der Bildung von IgG-IgA IC spielt.
Die Reaktion nach Zelltyp zur Bestimmung der Rolle der B- und T-Zellen und DCs sollte geklärt werden. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Rolle von B-Zellen und plasmazytoiden DCs. TLR9 wird von DCs, B-Zellen und Makrophagen, aber nicht von T-Zellen exprimiert.35–37 Der Beitrag von BAFF/APRIL zur T-Zell-unabhängigen Antikörperantwort ist bekannt.38,39 Hier testeten wir, ob die TLR9-Aktivierung die Synthese von verstärken kann anormal glykosyliertes IgA und Bildung von IgG-IgA IC über APRIL in T-Zell-unabhängiger Weise. Wir verwendeten auch geklonte humane IgA1--sezernierende Zelllinien und zeigten, dass die TLR9-Aktivierung die Produktion von Gd-IgA1 über APRIL und IL-6 steigerte, was darauf hindeutet, dass der Prozess T-Zell-unabhängig ist. Darüber hinaus haben wir die Rolle von B-Zellen und DCs bewertet. Wir zeigten, dass für B-Zellen und DCs spezifisches CpG-ODN die Produktion von aberrant glykosyliertem IgA in ganzen Splenozyten erhöhte. Darüber hinaus untersuchten wir, ob die CpG-ODN-Stimulation in vitro die IgA-Produktion steigern kann. Die CpG-ODN-Stimulation von isolierten B-Zellen induzierte eine Überproduktion von IgA. Darüber hinaus erhöhte CpG-ODN die IgA-Produktion signifikant, wenn B-Zellen mit DCs kokultiviert wurden (ergänzende Abbildung S1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die CpG-ODN-Aktivierung zu größeren Ergebnissen führtIgA-Produktion und abweichende Glykosylierungwird T-Zell-unabhängig durch TLR9 vermittelt.
IL-6 ist dafür bekannt, die Proliferation von Immunglobulin-produzierenden Zellen und die terminale Differenzierung von Plasmazellen zu akzentuieren.40–42 Darüber hinaus könnte IL-6 auch ein primärer Zytokinkandidat für die Differenzierung von follikulären T-Helferzellen sein .43,44 Follikuläre T-Helferzellen sind für die B-Zell-Affinitätsreifung, Klassenwechsel-Rekombination und die Bildung von Gedächtnis-B-Zellen und -Plasmazellen im Keimzentrum unerlässlich.43,44 In einem Lupus-Mausmodell ist IL-6 ein Mangel verhinderte die Differenzierung von follikulären T-Helferzellen und die Expansion von B-Zellen im Keimzentrum, was zu einer verringerten Autoantikörperproduktion führte.45 Die vorliegende Studie verdeutlichte, dass die TLR9-Aktivierung durch CpG-ODN die IL-6-Produktion in Milzzellen von murinem IgAN verstärkte. IL-6 induzierte eine Überproduktion von aberrant glykosyliertem IgA und IgG-IgA IC in einem Mausmodell von IgAN. In humanen IgA1--sekretierenden Zellen bestätigten wir, dass IL-6 die Produktion von Gd-IgA1 steigerte.24 Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-6 eines der Hauptmoleküle sein könnte, das eine Überproduktion von nephritogenem IgA induziert vermittelt durch TLR9-Aktivierung.
APRIL spielt eine wichtige Rolle beim IgA-Klassenwechsel und der plasmazytoiden Differenzierung.46,47 IL-6 fördert die terminale Differenzierung von B-Zellen zu IgA-sezernierenden Plasmazellen.41,42 Die vorliegende Studie zeigte, dass IL{{7} } Stimulation induzierte die Produktion von APRIL. Dann stellten wir die Hypothese auf, dass es eine Assoziation zwischen APRIL und IL-6 gab, die durch die TLR9-Aktivierung vermittelt wurde, die die Produktion von anormal glykosyliertem IgA induzierte. Wir fanden heraus, dass der IL-6-neutralisierende Antikörper die CpG-ODN-induzierte Überproduktion von Gd-IgA1 nicht vollständig blockierte und dass der siRNA-Knockdown von APRIL die durch IL-6 induzierte Überproduktion von Gd-IgA1 reduzierte. Diese Daten deuteten darauf hin, dass APRIL und IL-6 synergistisch die durch TLR9-Aktivierung vermittelte Produktion von Gd-IgA1 förderten. Darüber hinaus reduzierten sowohl der IL-6-neutralisierende Antikörper als auch der siRNA-Knockdown von APRIL die Produktion von IgA und Gd-IgA1 stärker als der IL-6-neutralisierende Antikörper allein. Somit beinhaltet der TLR9-Aktivierungsweg synergistische Wirkungen von IL-6 und APRIL auf die Antikörperproduktion und Glykosylierung (Abbildung 5). Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass IL-6 in Kombination mit APRIL die Bildung und das Überleben von Plasmazellen induzierte.48,49 Zukünftige Studien sind jedoch erforderlich, um die interzellulären Signalwege zwischen APRIL und IL-6 in zu klären die Produktion von nephritogenem IgA.
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Abschließend,TLR9-Aktivierungverschlimmerte die Nierenschädigung in einem Mausmodell von IgAN durch Steigerung der Produktion von aberrant glykosyliertem IgA und der Bildung von IgG-IgA IC. In diesem Prozess verstärkte die durch die TLR9-Aktivierung induzierte Überproduktion von APRIL und IL-6 die Produktion von nephritogenem IgA. Darüber hinaus stellte die vorliegende Studie klar, dass APRIL und IL-6 sowohl synergistisch als auch unabhängig wirken, um abweichend glykosyliertes IgA zu produzieren. Diese Ergebnisse können die zukünftige Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für IgAN beeinflussen.
Abbildung 5|Die synergistische Rolle zwischen Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9), einem proliferationsinduzierenden Liganden (APRIL), und Interleukin (IL)-6 in IgA-produzierenden Zellen bei IgA-Nephropathie (IgAN). Die TLR9-Aktivierung induzierte die Produktion von APRIL und IL-6, was dazu führte
die Überproduktion von anormal glykosyliertem IgA. APRIL und IL-6 wirken synergistisch, um die Bildung von anormal glykosyliertem IgA zu fördern. Zusätzlich dazu, dass APRIL die Produktion von IL-6 induziert, wie zuvor berichtet, kann IL-6 auch die Synthese von APRIL verstärken. Darüber hinaus fördern APRIL und IL-6 unabhängig voneinander die Produktion von aberrant glykosyliertem IgA. NF-kB, Kernfaktor-kB.
METHODEN
Tiere und Versuchsprotokolle
Die IgAN-anfällige ddY-Maus ist ein bekanntes Modell für spontanes IgAN mit variablem Auftreten und Ausmaß der glomerulären Schädigung, das menschliches IgAN nachahmt.10 ddY-Mäuse werden basierend auf der Manifestation in 3 Gruppen eingeteiltNierenschäden: Mäuse mit frühem oder spätem Beginn und ruhende Mäuse. Eine früh einsetzende Erkrankung bei ddY-Mäusen zeigt sich mit Proteinurie und glomerulären IgA-Ablagerungen nach einem Alter von 20 Wochen.13 Daher haben wir ddY-Mäuse im Alter von 18 Wochen verwendet, um zu bewerten, ob die TLR9-Aktivierung das IgAN in diesem Modell verschlimmert. Insgesamt 30 weibliche ddY-Mäuse (SLC Japan, Shizuoka, Japan) wurden in der Tiereinrichtung der Juntendo University, Tokyo, Japan gehalten. Die Mäuse wurden mit normalem Futter (Oriental Yeast Co., Tokio, Japan) und Wasser nach Belieben gefüttert und in einem speziellen pathogenfreien Raum untergebracht. Das Versuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Fakultät der Juntendo-Universität genehmigt. Im Alter von 6 Wochen wurden die Mäuse zufällig in 2 Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe erhielt 12 Wochen lang dreimal pro Woche CpG-ODN ip injiziert; der zweiten Gruppe (Kontrolle) wurde Nicht-CpG-ODN injiziert. CpG-ODN und Nicht-CpG-ODN wurden chemisch synthetisiert (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Japan). Sequenzen des ODN sind TCGTCGTT TTCGGCGCGCGCCG oder TGCTGCTTTTGGGGGGCCCCCC (50/30) für CpG- bzw. Nicht-CpG-ODNs.
Bestimmung von IgA, IgG, IgG-IgA IC und abweichend glykosyliertem IgA in Mäuseserum
Blutproben wurden aus der bukkalen Vene entnommen. Serum-IgA, -IgG und -IgG-IgA-IC wurden durch Sandwich-Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) unter Verwendung der modifizierten Methode basierend auf unserem vorherigen Bericht gemessen.50 Lektin-Bindungsassays waren verwendet, um auf die Glykoform von IgA zuzugreifen. Biotinyliertes RCA-I (Vector Laboratories, Burlingame, CA) und Sambucus nigra-Rindenlektin (Vector Laboratories), die an Galactose gebundene Galactose bzw. Sialinsäure (überwiegend in a2,6-Verknüpfung) erkannten, wurden in diesem Assay verwendet.51 Verdünnte Seren wurden mit 100 ng IgA pro Vertiefung zugegeben. Mit diesen Proben wurden mit 1 mg/ml Ziegen-Anti-Maus-IgA (100 ml/Vertiefung) beschichtete Mikrotiterplatten zur Quantifizierung von Serum-IgA inkubiert und anschließend biotinyliertes Sambucus nigra-Agglutinin oder RCA-I zugegeben. Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (ExtrAvidin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wurde aufgetragen. Serumspiegel von abweichend glykosyliertem gebundenem IgA wurden in Einheiten ausgedrückt (1 Einheit als optische Dichte 1,0, gemessen bei 490 nm). Die Serumspiegel von APRIL und BAFF wurden unter Verwendung eines Maus-APRIL-ELISA-Kits (MyBioSource, San Diego, CA) und eines Maus-BAFF-ELISA-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen.
Assay für Gd-IgA1, produziert von humanen IgA1--sekretierenden Zellen
Ein Sandwich-ELISA für Gd-IgA1 wurde unter Verwendung von Gd-IgA1–-spezifischen Antikörpern (IBL, Japan) konstruiert.52 Gd-IgA1–spezifischer Antikörper (7,5 mg/ml), verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wurde auf eine ELISA-Platte für 18 aufgetragen Stunden bei Zimmertemperatur. Proben wurden aufgetragen und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem 1:1000--verdünnten Meerrettichperoxidase-konjugierten Maus-Anti-Human-IgA1-a1--Ketten-spezifischen monoklonalen Antikörper (Southern Biotech, Birmingham, AL) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit SIG-MAFAST o-Phenylendiaminlösung (Sigma-Aldrich) entwickelt und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 M Schwefelsäure (Wako, Osaka, Japan) gestoppt. Die Konzentrationen von Gd-IgA1 wurden unter Bezugnahme auf eine Standardkurve (4--Parameter logistische Kurvenanpassung) der optischen Dichte bei 490 nm extrapoliert und in Einheiten ausgedrückt. Enzymatisch erzeugtes Gd-IgA1 aus humanem Plasma-IgA152 wurde seriell verdünnt (1,37–1000 ng/ml), um eine Standardkurve zu erstellen. In dieser Studie wurde 1 Einheit als 1 ng/ml des Standard-Gd-IgA1.52 definiert
Bewertung der Nierenschädigung bei ddY-Mäusen
Nierenwere removed after perfusion with normal saline solution. Renal tissue specimens for microscopic examination were fixed in 20% formaldehyde, embedded in paraffin, cut into 3-mm-thick sections, and then stained with periodic acid–Schiff. Specimens were quantitatively analyzed to determine the percentage of glomeruli with segmental and global sclerosis and/or mesangial cell proliferation and/or increase in the mesangial matrix. Each section was scored semiquantitatively for percentages of glomeruli with aforementioned lesions (0, 0%; 1, 1% to 24%; 2, 25% to 49%; and 3, >50 Prozent von 20 Glomeruli).13,53,54 Die maximale Gesamtpunktzahl für jeden Abschnitt betrug 9. Nierenproben für die Immunfluoreszenz wurden in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura Finetek Japan Co., Tokio, Japan) getaucht und bei –80 Grad gelagert Die Proben wurden in 3- mm dicke Schnitte geschnitten, mit Aceton bei –20 Grad für 5 Minuten fixiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, mit einem Blockierungsmittel (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japan) blockiert. bei Raumtemperatur für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: Ziegen-Anti-Maus-IgA, Alexa-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG und Ratten-Anti-C3 (Bethyl Laboratories). Nach 3 weiteren Waschgängen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden die Objektträger mit Eindeckmedium (Dako, Tokyo, Japan) fixiert. Proben wurden analysiert und unter Verwendung von konfokaler Lasermikroskopie (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) abgebildet.
Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit
RNA aus Milzzellen wurde unter Verwendung von Torizol-Lösung (Invitrogen, Tokyo, Japan) extrahiert und mit RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Valencia, CA) gereinigt. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit wurde unter Verwendung des Applied Biosystems 7500 Real-Time-Polymerase-Kettenreaktionssystems unter Verwendung von SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) und spezifischen Primern durchgeführt: Maus-TLR9-Vorwärtsprimer TCTCCCAACATGGTTCTCCGTCG, Rückwärtsprimer TGCAGTCCAGGCCATGA; Maus-MyD88-Vorwärtsprimer GCACCTGTGTCTGGTCCATT, Rückwärtsprimer CTGTTGGA CACCTGGAGACA; und das Housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Vorwärtsprimer CATTGTGGAAG GGCTCATGA, Rückwärtsprimer TCTTCTGGGTGGCAGTGATG. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: Vorheizen bei 95 Grad für 20 Sekunden und dann 40 Denaturierungszyklen bei 95 Grad für 3 Sekunden und Annealing und Verlängerung bei 60 Grad für 30 Sekunden. Homo sapiens-spezifische TaqMan-Genexpressionsassays (Life Technologies, Carlsbad, CA) wurden für die Primer von APRIL, Hs00601664_g1, Mm03809849-s1 und BAFF, Mm01168134-m1 erworben . Die Zyklusbedingungen der TaqMan-Polymerase-Kettenreaktion waren wie folgt: Vorheizen bei 95 Grad für 20 Sekunden und dann 40 Denaturierungszyklen bei 95 Grad für 3 Sekunden und Annealing und Verlängerung bei 60 Grad für 30 Sekunden
In-vitro-Studien mit Splenozyten von ddY-Mäusen
Splenozyten wurden in Medium des Roswell Park Memorial Institute – 1640, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum, 100 mg/ml Streptomycin und 100 E/ml Penicillin, kultiviert. Rote Blutkörperchen wurden in Lysepuffer für rote Blutkörperchen (R7757; Sigma-Aldrich) bei Raumtemperatur 1 Minute lang lysiert, gefolgt von Waschen in Roswell Park Memorial Institute–1640-Medium.50 Zellkulturen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad gehalten 5 Prozent CO2. Als TLR9-Ligand wurde CpG-ODN der Klasse C (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG) verwendet. Rekombinantes IL-6, Anti-IL-6-Antikörper und Ratten-IgG1-Isotypkontrolle wurden von R&D Systems bezogen. Die Zellen wurden entweder mit mittleren oder empfohlenen Konzentrationen von CpG-ODN, 10 ng/ml rekombinantem IL-6 und 100 ng/ml Anti-IL6-Antikörper kultiviert. IgA, aberrant glykosyliertes IgA, IgG-IgA IC und APRIL, produziert von Splenozyten, wurden durch ELISA nach 72--stündiger Inkubation in vitro gemessen.
In-vitro-Studien mit humanen IgA1--sekretierenden Zelllinien
B-Zellen aus dem Blut einer gesunden Person wurden mit Epstein-Barr-Virus unsterblich gemacht, subkloniert, um IgA1--sezernierende Zelllinien zu erhalten, und wie beschrieben kultiviert.9 Außerdem bestätigten wir die Expression von Rezeptoren für APRIL/BAFF und IL -6. Die Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute-1640-Medium, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum, Streptomycin und Penicillin, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5 % CO2 kultiviert. Als TLR9-Ligand wurde CpG-ODN der Klasse B (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT) verwendet. Rekombinantes IL-6, rekombinantes APRIL, Anti-IL-6-Antikörper und Ziegen-IgG-Kontrollantikörper wurden von R&D Systems bezogen. Die Zellen wurden entweder mit mittleren oder empfohlenen Konzentrationen von CpG-ODN, 50 ng/ml rekombinantem IL-6, 40 ng/ml rekombinantem APRIL und 100 ng/ml Anti-IL-6-Antikörper für 72 Stunden kultiviert
Western-Blotting
Überstände von IgA1--sekretierenden Zellen wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5 % bis 15 % Gradientenplattengelen getrennt. Die Gele wurden auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen und mit Antikörpern inkubiert, die spezifisch für APRIL (Abcam Inc., Cambridge, MA) und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Abcam Inc) waren. Die Blots wurden durch Chemilumineszenz unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz (GE Healthcare, Tokio, Japan) und eines Lumineszenzdetektors (Konica Minolta Healthcare, Tokio, Japan) sichtbar gemacht. Die Ergebnisse wurden densitometrisch ausgewertet.
APRIL siRNA-Knockdown
Humane IgA1--sezernierende Zellen wurden in 24--Well-Kulturplatten kultiviert und mit APRIL-spezifischer siRNA (GS8741, Qiagen) oder siRNA-Non-Targeting-Kontrolle (GS10673, Qiagen) unter Verwendung des Transfektionsprotokolls gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert . Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen 72 Stunden mit 50 ng/ml rekombinantem IL-6 (R&D Systems) inkubiert. Nach der Inkubation wurden Zellen und Überstände zur Messung von IgA und Gd-IgA1 geerntet.
statistische Analyse
Die Korrelation zwischen verschiedenen Parametern wurde unter Verwendung einer Varianzanalyse analysiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Medianwerte ausgedrückt. P-Werte < {{0}},05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="" betrachtet.="" alle="" statistischen="" analysen="" wurden="" mit="" graphpad="" prism="" version="" 6.0="" für="" windows="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca)="">
ZistanchezumNiereKrankheitssymptome
OFFENLEGUNG
Alle Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.
DANKSAGUNGEN
Diese Studie wurde teilweise vom JSPS KAKENHI Grant No. 18K08252 und dem Practical Research Project for Renal Diseases der Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, unterstützt. JN und BAJ wurden teilweise durch die Zuschüsse DK078244 und DK082753 der National Institutes of Health unterstützt. Wir danken Frau Terumi Shibata für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken auch Frau Takako Ikegami und Frau Tomomi Ikeda (Division of Molecular and Biochemical Research, Juntendo University Graduate School of Medicine) und Frau Tamami Sakanishi (Division of Cell Biology, Juntendo University Graduate School of Medicine) für ihre hervorragende technische Unterstützung .
ERGÄNZUNGSMATERIAL
Ergänzende Datei (PDF)
Abbildung S1. CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN)-aktivierte B-Zellen und dendritische Zellen (DCs) verstärken die IgA-Produktion weiter. B-Zellen und DCs wurden aus der Milz von ddY-Mäusen isoliert. Die CpG-ODN-Stimulation erhöhte die IgA-Produktion in den isolierten B-Zellen. Dieser Anstieg wurde durch die Co-Kultivierung von B-Zellen mit DCs weiter verstärkt. *P < 0.05.="" die="" detaillierten="" methoden="" werden="" in="" den="" ergänzenden="" methoden="" bereitgestellt.="" ergänzende="">
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