Kohlenmonoxid (CO) lindert wirksam diabetische Nephropathie (DN).
Mar 16, 2022
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Teil Ⅰ: Kohlenmonoxid lindert die Seneszenz bei diabetischer Nephropathie durch Verbesserung der Autophagie
Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & bei al.V
EINLEITUNG
Diabetische Nephropathie (DN) ist eine der häufigsten und schwerwiegendsten diabetischen mikrovaskulären Komplikationen. Statistisch gesehen 20 Prozent -40 Prozent der Patienten mit DN (Diabetische Nephropathie) entwickelt sich 14-mal schneller als andere Nierenerkrankungen zu einer Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD). Darüber hinaus ist das erhöhte kardiovaskuläre Risiko von DN (Diabetische Nephropathie)Patienten trägt wesentlich zu einer hohen Sterblichkeit bei.2 Die komplexe Pathogenese von DN (Diabetische Nephropathie)ist bei dem begrenzt verfügbaren Behandlungsansatz noch unklar. Daher ist es dringend erforderlich, die Pathogenese und therapeutische Mittel zu identifizieren, um den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion von DN zu verhindern (Diabetische Nephropathie).
Seneszente Zellen, die durch einen permanenten Stillstand des Zellzyklus gekennzeichnet sind, haben als „Zombiezellen“ große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Aufgrund der Resistenz gegen Apoptose und der fortgesetzten Produktion des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) werden seneszente Zellen zunehmend als die entscheidende Ursache für altersbedingte Krankheiten erkannt. Altersbedingte Nierenfunktionsstörungen wurden häufig bei DN beobachtet (Diabetische Nephropathie)Patienten und Versuchsmodelle, wie STZ-induzierte (Typ-1-Diabetes (T1D)) und db/db(Typ-2-Diabetes (T2D))-Mäuse. Wichtig ist, dass die Clearance von p16--positiven Zellen gealterter Mäuse die Glomerulosklerose verbesserte. Darüber hinaus linderte das Ausschalten von p21 oder p27 in T1D-Mäusen Proteinurie und glomeruläre Dilatation. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Seneszenz eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von DN spielt (Diabetische Nephropathie). Die Regulierung der Seneszenz in DN (Diabetische Nephropathie)bleibt vage.
Neue Beweise zeigten, dass die Autophagie, ein Mechanismus des Abbaus intrazellulärer Inhalte, ein gültiger Seneszenzregulator ist.“ Obwohl berichtet wurde, dass die Autophagie den Erwerb des seneszenten Phänotyps fördert, wird die Anti-Seneszenz-Wirkung der Autophagie allgemein akzeptiert Es wurde berichtet, dass die Autophagie die Lebensdauer von gealterten Mäusen und älteren Fliegen verlängert.10 Weitere Studien zeigten, dass das Ausschalten von Atg7 die Alterung von Stammzellen verschlimmerte.11 Noch wichtiger, die Deletion von Atg5 verschlimmerte Proteinurie und Fibrose, die Hauptleistung vonNiereAltern.12.13 Daher könnten Medikamente, die auf die Autophagie abzielen, um die Seneszenz zu lindern, eine der vielversprechendsten Strategien für DN sein (Diabetische Nephropathie)Prävention und Behandlung.
Kohlenmonoxid (CO), das durch den Katabolismus von Häm durch Häm-Oxygenase-Enzyme erzeugt wird, ist ein endogenes gasförmiges Molekül. Eine Reihe von Veröffentlichungen enthüllte die entzündungshemmenden, antiapoptotischen und andere schützende Eigenschaften von CO (Kohlenmonoxid), wenn es in niedrigen Dosen angewendet wird.14 Obwohl CO (Kohlenmonoxid)wurde gut untersucht, um Ischämie-Reperfusion oder Renoprotektion zu verleihenNiereTransplantationsmäuse,15 Wirkung und Mechanismus von CO (Kohlenmonoxid)auf DN (Diabetische Nephropathie)sind unklar. Kürzlich zeigte die Literatur, dass CO (Kohlenmonoxid)übertrug eine zytoprotektive Rolle als Autophagie-Aktivator in Inseln, die durch Hypoxie,16 Sepsis-Mäuse7 und gealterte Ratten mit Herzstillstand herausgefordert wurden.18 Darüber hinaus war die Verabreichung von CO (Kohlenmonoxid)linderte die durch Arzneimitteltoxizität verursachte Seneszenz von Endothelzellen.1 Diese Ergebnisse fördern offenbar die potenzielle Vermittlung der durch CO gezielten Autophagie (Kohlenmonoxid)Alterung zu verbessern.
Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Anhäufung von seneszenten Zellen in derNierevon DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse konnten durch CO rückgängig gemacht werden (Kohlenmonoxid)über Autophagie-Aktivierung, wodurch die Nierenfunktionsstörung verbessert wird. Um unsere Hypothese zu testen und die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, wendeten wir die Behandlung des Kohlenmonoxid freisetzenden Moleküls -2 (CORM-2) in vivo an (das experimentelle DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse) und in vitro (Ratten-Mesangialzellen, humane tubuläre Epithelzellen und humane Podozyten).
Nierenfunktion: wie sich Kohlenmonoxid (CO) auswirktDiabetische Nephropathie (DN)
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MATERIALEN UND METHODEN
2.1|Tierversuchsdesign
Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (Charles River) wurden in einem Standard-Hell/Dunkel-Zyklus (12:12 Stunden) mit normaler Ernährung (ND) oder fettreicher Ernährung (HFD) (60 Prozent Energie aus Fett) gehalten ) für 16 Wochen.20 In Woche 17 der Studie erhielten mit HFD gefütterte Mäuse intraperitoneale Injektionen von STZ (50 mg/kg) für 7 Tage, während Mäusen mit ND Vehikel (Citratpuffer, pH =4) injiziert wurde. .5). Eine Woche nach den Injektionen wurden die Blutglukosespiegel eines Schwanzstichs zweimal im Abstand von 24 Stunden gemessen. Als nächstes der DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse mit Glukosespiegeln von 16,9 mmol/l oder mehr wurden zufällig in drei Gruppen mit 15 Tieren in jeder Gruppe eingeteilt (DN (Diabetische Nephropathie), DN (Diabetische Nephropathie)plus CO und DN (Diabetische Nephropathie)plus iCO): eine als DN-Kontrolle bezeichnete Gruppe und andere Gruppen, die mit intraperitonealen Injektionen (zweimal wöchentlich für 16 Wochen) von CORM-2 (3 mg/kg) oder ungültigem CORM-2 behandelt wurden entsteht durch die Freisetzung von CO (Kohlenmonoxid)aus CORM-2 bei Raumtemperatur. Am Ende des Versuchszeitraums wurden die Mäuse anästhesiert, Blutproben wurden durch Enukleation der Augäpfel gesammelt und die Nieren wurden zur Analyse entnommen. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Leitprinzipien für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt, die von den US National Institutes of Health veröffentlicht wurden, und alle Tierverfahren wurden vom Tongji Medical College Council on Animals Care Committee genehmigt.
2.2|Plasmabiochemische und histologische Analyse
Das gesammelte Vollblut und Serum wurden zur Analyse bei -80 Grad gelagert. Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) wurde mit im Handel erhältlichen Assay-Kits (Jiancheng Bioengineering Institute, China) gemessen. Danach wurden die Nieren entfernt und die Oberfläche mit Kochsalzlösung gewaschen. Das Nierengewebe wurde mit Hämatoxylin-Eosin und Masson-Trichrom-Färbung gefärbt und schließlich mit einem Mikroskop betrachtet.
2.3|Elektronenmikroskopie
Kleine Stücke der Nierenrinde wurden in Glutaraldehyd (2,5 Prozent) fixiert und in Araldit eingebettet. Das Gewebe wurde unter Verwendung eines Ultramikrotoms (Leica EM UC7) in ultradünne Schnitte (80-100 nm) polymerisiert. Die dünnen Scheiben auf dem Kupfermaschengitter wurden gefärbt und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (Tecnai G220 TWIN) betrachtet.
2.4|Scherwellen-Elastographie
Am Ende des Versuchszeitraums wurden die Mäuse betäubt und in das Ultraschalllabor (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China) zur Scherwellen-Elastographie mit einem Baldachin-Oszilloskop (Supersonic Imagine) geschickt. Der mittlere Elastizitätsmodul (Eman) wurde verwendet, um die Steifigkeit des Nierenparenchyms zu messen.
2.5|SA- -gal-Färbung
GefrorenNiereSchnitte und Zellen, die in einer 6-Well-Platte ausgesät wurden, wurden zum Nachweis der SA- -gal-Aktivität mit einem kommerziellen Kit (Beyotime Biotechnology) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Der blaue Fleck wurde als Ansammlungsbereich von seneszenten Zellen angesehen.
2.6|Quantitative Echtzeit-PCR für die mRNA-Expression
Gemäß den Anweisungen (TaKaRa BIO INC) wurde Nierengewebe-RNA unter Verwendung des TRlzol-Reagens extrahiert. Die Expression von mRNA wurde mit einem TB-Green-basierten gRT-PCR-Kit und spezifischen Primern quantifiziert (Tabelle 1). Jede Genexpression wurde mit einer eigenen Standardkurve bewertet, und die mRNA-Konzentration von Gapdh wurde als endogene Kontrolle quantifiziert.
2.7|Western Blotting und Immunpräzipitation
Nierengewebe oder -zellen wurden homogenisiert und lysiert, dann mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Beyotime Biotechnology) quantifiziert. Das Protein wurde abgetrennt und anschließend auf die PVDF-Membranen (Millipore) übertragen. Nach dem Blockieren wurden die Membranen über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert (Tabelle 2). Nach dem Waschen wurden die Membranen mit einem entsprechenden sekundären Antikörper inkubiert. Die Dichte jeder Zielbande wurde mit der Software Image Pro-Plus 6.0 quantifiziert und auf GAPDH als optische Dichte normalisiert. Alle Probengrößen von Tieren oder Zellen waren größer oder gleich 3.
Lysat von Nierengewebe wurde zentrifugiert (14 000 g bei 4 Grad C für 30 Minuten）, und der Überstand wurde mit 20 μl Protein A/G-Agarosekügelchen für 2 Stunden vorgeklärt und über Nacht mit Bcl{{6} inkubiert } oder Maus-IgG-Antikörper.Immunpräzipitate wurden gewaschen, resuspendiert, gekocht und durch Western Blotunter Verwendung von Anti-Beclin-1 (Cell Signaling Technology) und Anti-Bcl-2(Proteintech) wie zuvor beschrieben analysiert .21
TABELLE 1 Quantitative Echtzeit-PCR-Primersequenzen
2.8|Immunfluoreszenz
Das in OCT-Medium eingebettete Nierengewebe wurde in 6-8 μm dicke Gefrierschnitte geschnitten. Nach dem Blockieren mit 10 Prozent normalem Ziegenserum wurden die Schnitte über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Gewebe mit sekundären Antikörpern markiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Objektträger mit DAPI inkubiert und anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus) fotografiert.
2.9|Zellkultur
HBZY-1 wurde in DMEM (Gibco) gehalten und HK-2 wurde in DMEM/F12 (Gibco) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U ml -1 Penicillin/Streptomycin (Gibco ) bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre, die 95 Prozent Luft und 5 Prozent CO enthält (Kohlenmonoxid). HPC, bereitgestellt von Professor Chun Zhang von der Huazhong University of Science and Technology, wurde in RPMI 1640 (Gibco) gepflegt. HPC wurde zunächst bei 33 Grad proliferiert und dann zur Differenzierung auf 37 Grad übertragen, bevor es in Experimenten wie zuvor beschrieben verwendet werden kann.22
2.10|ELIS-Assay
Nachdem HPC unterschiedlich behandelt und für 5 Tage kultiviert worden war, wurde die Hälfte des Überstands zum Nachweis entnommen (freigesetztes VEGF). Die Zellen wurden mit einem Ultraschall-Zellbrecher (SONICS) aufgebrochen, wodurch die Proteine vollständig in den verbleibenden Überstand (Gesamt-VEGF) freigesetzt werden konnten. Dann wurden die VEGF-Konzentrationen unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (MEIMIAN) gemessen. Das Verhältnis von freigesetztem VEGF zu Gesamt-VEGF war die VEGF-Leckrate.
2.11|Gen-Stummschaltung
Knockdown von Atg7 in HK-2-Zellen wurde durch Verwendung eines umgekehrten siRNA-Transfektionsverfahrens erreicht, das in Platten mit sechs Vertiefungen durchgeführt wurde. Sobald sie zu 70 Prozent Konfluenz gezüchtet waren, wurden die Zellen mit siRNA oder verschlüsselter siRNA (RiboBio) unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Nach 48 Stunden Transfektion wurde die Transfektionseffizienz durch Western Blot verifiziert, um die Sequenz (ACTCGAGTCTTTCAAGACT) zu validieren.
TABELLE 2 Alle Antikörperlisten
2.12|Überwachen Sie den autophagischen Fluss
Die Plasmide, die den lentiviralen Vektor RFP-GFP-LC3 (Genecopoeia) enthielten, wurden konstruiert und dann gemäß den Anweisungen des Herstellers (GeneCopoeia) in HEK293T-Zellen verpackt. Der Virusüberstand wurde gesammelt, um HK-2- und HBZY-1-Zellen zu infizieren, um den Autophagiefluss zu überwachen. Diese Sonde konnte Autophagosomen (GFP*/RFPt, gelbe Punkte) und Autolysosomen (GFP-/RFPt, rote Punkte) unterscheiden.
2.13|Datenanalyse
Die Daten wurden mit Graph Pad Prism8 analysiert und als Mittelwert ± SEM angezeigt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse bestimmt. Die Signifikanz wurde als P festgelegt<>
ERGEBNISSE
3.1|CO (Kohlenmonoxid)abgeschwächte Nierenfunktionsstörung von DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse
Um die Renoprotektion von CO zu untersuchen (Kohlenmonoxid), ein DN (Diabetische Nephropathie)Modell wurde durch HFD andSTZ (Abbildung 1A) induziert. Nach 34 Wochen experimenteller Fütterung, Blutzucker, Gewicht, dieNiere-Körperverhältnis, Kreatinin und BUN wurden gemessen. Im DN (Diabetische Nephropathie)Gruppe,Niere-Body-Ratio, Kreatinin und BUN waren erhöht, während die Behandlung von CO (Kohlenmonoxid)umgekehrte Anomalien (Tabelle 3). Konsequenterweise ist die Nierenmorphologie von DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse waren extrem gestört mit Abschuppung der Epithelzellen, vakuolärer Degeneration, glomerulärer Bowman-Raumvergrößerung und mesangialer Expansion (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigte die Ultrastruktur des Glomerulus eine Verdickung der Basalmembran und eine Auslöschung des Podozytenfußfortsatzes (Abbildung 1B). Im Gegenteil, CO (Kohlenmonoxid)Die Behandlung normalisierte sich oberhalb negativer morphologischer Veränderungen (Abbildung 1B). Darüber hinaus waren sowohl das in der Nierenrinde abgelagerte fibrilläre Kollagen (Abbildung 1C) als auch die Nierenhärte, gemessen durch Scherwellen-Elastographie, in DN erhöht (Diabetische Nephropathie)Mäuse (Abbildung 1D). Wie erwartet CO (Kohlenmonoxid)signifikant verbesserte Nierenfunktionsstörung von DN (Diabetische Nephropathie)einschließlich Fibrose.
ABBILDUNG 1 CO (Kohlenmonoxid)abgeschwächte Nierenfunktionsstörung von DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse, die durch HFD und STZ induziert wurden.
Ein Schema des experimentellen Designs. B, repräsentative Bilder vonNiereGewebe gefärbt mit H&E (Maßstab: 50 μm), PAS (Maßstab: 10 μm) und ultrastrukturelle Veränderungen in der glomerulären Morphologie, bewertet durch Transmissionselektronenmikroskopie (Maßstab: 1 μm).
Und die statistischen Daten des Verhältnisses von PAS-positiv zur glomerulären Fläche, GBM-Dicke, Fußfortsatzbreite und die Anzahl der Fußfortsätze pro mm GBM (n=3).
C, Repräsentative Bilder des mit Masson-Trichrom gefärbten Nierengewebes und die statistischen Daten des positiven Bereichs (n=3). Maßstabsleiste: 25 μm.
D, Scherwellen-Elastographie, nachgewiesen mit einem Sonoscope und Quantifizierung des Elastizitätsmoduls als Grad der Nierenfibrose (n=7). *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
TABELLE 3 Stoffwechseldaten von Mäusen in allen Gruppen
3.2|CO (Kohlenmonoxid)gelinderte Seneszenz bei DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse und Nierenzellen, die durch hohe Glukose herausgefordert wurden
Seneszenz gilt zunehmend als Hauptursache für Nierenfibrose, ein Kennzeichen des Alterns.23 Untersuchung der Anti-Seneszenz-Wirkung von CO (Kohlenmonoxid)haben wir eine SA- -gal-Färbung an der Niere durchgeführt. Die vermehrten SA- -gal*- und p16*-Zellen wurden in der gesamten Nierenrinde im DN angesammelt (Diabetische Nephropathie)Gruppe, während Kontrolle und CO (Kohlenmonoxid)-Behandlungsnieren zeigten gelegentlich Positivität (Abbildung 2A, B). Aus der anatomischen Position der Niere wurde die positive Expression von p16 in Mesangialzellen (gelber Pfeil), renalen tubulären Epithelzellen (roter Pfeil) und Podozyten (schwarzer Pfeil) nachgewiesen. Seneszenz, die in DN auftrat (Diabetische Nephropathie)Mäuse wurde weiter unterstützt durch die offensichtliche Hochregulierung klassischer Seneszenz-assoziierter Proteine, einschließlich p53, p21 und p16 (Abbildung 2C). Umgekehrt ist die Verabreichung von CO (Kohlenmonoxid)milderte die obige Alterungsleistung.
Es wurde berichtet, dass der seneszenzbezogene sekretorische Phänotyp, das charakteristische Sekretom seneszenter Zellen, die Mikroumgebung stört und das Fortschreiten der Krankheit erleichtert.2 Daher wurden die mRNA-Spiegel einiger repräsentativer SASP gemessen, einschließlich I-1 , Il-6 , Tgf- , Tnf-a, Vegf, Icam-1 und Vcam-1. Die Ergebnisse zeigten, dass die abnormalen Zunahmen dieses SASP durch CO abgewendet wurden (Kohlenmonoxid)Intervention (Abbildung 2D).
Angesichts der unterdrückenden Seneszenz von CO (Kohlenmonoxid)In vivo untersuchen wir weiter seine Anti-Seneszenz-Wirkung im In-vitro-Modell von 3 Arten von Nierenzellen, einschließlich Ratten-Mesangialzellen (HBZY-1), menschlichen tubulären Epithelzellen (HK-2) und menschlichen Podozyten (HPC). Nach Exposition gegenüber hoher Glukose (HG, 35 mmol/l) zeigten 3 Zelltypen die Zunahme von SA- -gal mit größerer Morphologie an Tag 7 (Abbildung 2E), Tag 5 und Tag 14 (Abbildung 2l) , beziehungsweise. Bemerkenswerterweise zeigte die Erhöhung der LDH-Leckrate von HBZY-1, dass HG-induzierte Zellalterung und -schädigung (Abbildung 2F). Um die geeignete CO-Dosis zu ermitteln (Kohlenmonoxid)wurde HBZY-1 mit verschiedenen Konzentrationen von CORM-2 behandelt. Durch Messung der Leckagerate von LDH (Abbildung 2F), EdU-positiven Zellen (Abbildung 2G) und SA- -gal (Abbildung 2H) stellten wir fest, dass die Konzentration von 1 μmol/L einen besseren Interventionseffekt hatte. Konsequent CO (Kohlenmonoxid)(1 μmol/L） verringerte auch die positive Expression von SA- -gal in HK-2 und HPC (Abbildung 2). Zusammengenommen enthüllten diese Ergebnisse, dass CO (Kohlenmonoxid)spielten sowohl in vivo als auch in vitro eine bemerkenswerte Anti-Seneszenz-Rolle.
ABBILDUNG 2 CO (Kohlenmonoxid)gelinderte Seneszenz bei DN (Diabetische Nephropathie)Mäuse und Nierenzellen, die durch HG herausgefordert wurden.
A, repräsentatives Bild vonNieremit SA- -gal gefärbtes Gewebe und die statistischen Daten des positiven Bereichs (n=3). Der Glomerulus wurde durch den rot gepunkteten Kreis angezeigt. Maßstabsleiste: 25 μm.
B, Die positive Expression von p16 in derNierewurde durch Immunhistochemie gezeigt (n=3). Die gelben Pfeile zeigten Mesangialzellen, die roten Tubulusepithelzellen der Niere und die schwarzen Pfeile Podozyten an. Maßstabsleiste: 25 μm.
C, Die Proteinspiegel von Seneszenzmarkern, bestimmt durch Immunoblots und densitometrische Analyse von p53, p21 und p16 (n=3).
D, Vielfache Änderungen der Expressionsniveaus von SASP-mRNA (Il-1 , Il-6, Tgf- , Tnf- , Vegf, Icam-1 und Vcam-1) (n Größer oder gleich 4).
E, HBZY{{0}}, das NG (5 mmol/L) oder HG (35 mmol/L) ausgesetzt war, wurde mit SA- -gal von Tag 0 bis Tag 7 und statistischen Daten von SA gefärbt - -gal-positive Zellen bei 5 und 7 d (n=3). Maßstabsleiste: 50 μm.
F, Die LDH-Freisetzungsrate von HBZY{{0}}, behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von CORM-2 (0,1, 1, 10 und 100 μmol/L) (n=6).
G, Der Anteil von EdU-positivem HBZY-1, behandelt mit unterschiedlichen Konzentrationen von CORM-2 (n=3).
H, SA- -gal-Färbung in HBZY-1 behandelt mit unterschiedlichen Konzentrationen von CORM-2 (n=3). Maßstabsleiste: 50 μm.
I, Repräsentative Bilder von SA- -gal von HPC (Tag 5) und HK-2 (Tag 14) mit der Verabreichung von CORM-2 (1μmol/L) und statistischen Daten (n { {6}}). Maßstabsleiste: 50 μm. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
3.3|CO (Kohlenmonoxid)aktivierte Autophagie und verbesserter Autophagiefluss in vivo und in vitro
Eine wachsende Zahl von Forschungsarbeiten deckte die negative Regulation der Autophagie auf Alterung und CO auf (Kohlenmonoxid)gilt als Autophagie-Aktivator. Um die Auswirkungen von CO auf die Autophagie in DN zu untersuchen (Diabetische Nephropathie)wurde eine Reihe von Autophagie-assoziierten Proteinen gemessen. Im Vergleich zu diabetischen Mäusen ist CO (Kohlenmonoxid)Die Behandlung erhöhte signifikant die Expression des Autophagie-Initiationsproteins Beclin-1 (Abbildung 3A) und verringerte das Autophagie-Substrat p62 (Abbildung 3B), reduzierte jedoch das Verhältnis von LC3Il zu LC3l, dem Marker des Autophagosoms (Abbildung 3C). Frühere Beweise deuteten darauf hin, dass dieser Widerspruch auf einen blockierten Autophagiefluss zurückzuführen sein könnte, der durch die Dysfunktion des Lysosoms verursacht wird.25 Die Ergebnisse zeigten, dass die Lysosomen-verwandten Proteine Cathepsin B und LAMP2 im DN erhöht waren (Diabetische Nephropathie)plus COgroup im Vergleich zum DN (Diabetische Nephropathie)Gruppe (Abbildung 3D). Darüber hinaus unterstützte die Kolokalisierungsanalyse von LC3 puncta und LAMP2, dass CO (Kohlenmonoxid)deutlich die Akkumulation von Autophagosomen reduziert und die Anzahl der Autolysosomen erhöht (Abbildung 3E).
Konsequenterweise wurde die Dysfunktion von Autophagie und Lysosom in vitro gefunden, wie durch Proteinspiegel und lysosomale Sonden gezeigt wurde (Abbildung 3F, G). Außerdem wurden HK-2 und HBZY-1 mit Lentivirus RFP-GFP-LC3 transfiziert, um den Autophagiefluss zu überwachen. Unter der Bedingung von HG waren die Puncta der Autophagosomen erhöht und die Autolysosomen in HBZY-1 und HK-2 verringert, was durch die Behandlung mit Chloroquin (CQ) nicht weiter verändert wurde. CO (Kohlenmonoxid)erhöhte die Anzahl der Autolysosomen und verringerte die Autophagosomen, was durch die Zugabe von CQ gehemmt wurde (Abbildung 3H, I). Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass CO (Kohlenmonoxid)aktivierte Autophagie und verbesserter Autophagiefluss in vivo und in vitro.
3.4|CO (Kohlenmonoxid)gelinderte Seneszenz durch Verbesserung der Autophagie in vitro
Um die Rolle der Autophagie im Anti-Seneszenz-Mechanismus von CO weiter zu untersuchen (Kohlenmonoxid)wurde eine Kombination aus CORM-2 und Autophagie-Inhibitoren in Nierenzellen verwendet, die HG ausgesetzt waren. Zwei Arten von Inhibitoren, Wortmannin (WORT), um die Initiierung der Autophagie zu blockieren, und CQ, um den Autophagiefluss einzuschränken, kehrten die Reduktion von SA- -gal durch CO effektiv um (Kohlenmonoxid)in 3 Arten von Nierenzellen (Abbildung 4A). Konsequent CO (Kohlenmonoxid)signifikant den Anteil an EdU-Zellen erhöht, die durch zwei Inhibitoren in HBZY-1 (Abbildung 4B) und HK-2 (Abbildung 4C) gehemmt wurden von CO (Kohlenmonoxid), gezeigt durch die reduzierte Expression von p53, p21 und p16, fehlte nach der Zugabe von Autophagie-Inhibitoren (Abbildung 4D). In ähnlicher Weise zeigte die Immunfluoreszenzanalyse, dass Autophagie-Inhibitoren die Abnahme von p53-- und p16--positiven Zellen durch CO blockierten (Kohlenmonoxid)in HK-2 (Abbildung 4印) und HPC (Abbildung 4F). Darüber hinaus blockierte die Stille von Atg7 (Abbildung 4G) die Schutzwirkung von CO (Kohlenmonoxid), gezeigt durch erhöhte SA- -galt-Zellen und verringerte EdU*-Zellen in HK-2(Abbildung 4H). Die oben genannten Ergebnisse legen nahe, dass CO (Kohlenmonoxid)unterdrückte Seneszenz durch Verbesserung der Autophagie.
3.5|Aktivierte Autophagie kann SASP in DN abbauen (Diabetische Nephropathie)Mäuse
Wir haben die spezifische Beziehung zwischen Autophagie und Seneszenz weiter untersucht. Die Forschung zeigte, dass Autophagie die Seneszenz linderte, indem GATA4 selektiv abgebaut wurde, das NF-KB positiv regulierte, um SASP freizusetzen.26 Dementsprechend wurde eine große Menge an SASP im DN entwickelt (Diabetische Nephropathie)Gruppe (Abbildung 2D), und die Expression und Kerntranslokation von p65 wurden erhöht (Abbildung 5A). Der Proteinspiegel von GATA4 blieb jedoch unverändert, was darauf hindeutet, dass GATA4 möglicherweise nicht die Bildung von SASP in einem hohen Glukosezustand vermittelt (Abbildung 5B). Darüber hinaus zeigten Studien, dass das durch die Kombination von mTOR, spätem Autophagosom und Lysosom gebildete TOR-Autophagie-Raumkopplungskompartiment (TASCC) die Seneszenz beschleunigte, indem es die Sekretion von SASP erhöhte.27 Immunfluoreszenzergebnisse zeigten jedoch, dass es keine dreifache Kolokalisierung von mTOR, LC3 gab und LAMP2, was auf die fehlgeschlagene Bildung von TASCC in den Nieren hinweist (Abbildung 5C).
Wie wir wissen, funktioniert die Autophagie beim Abbau von zytosolischen Bestandteilen, was hauptsächlich durch Autolysosomen erfolgt, die durch die Fusion von Autophagosom und Lysosom gebildet werden. Es wurde berichtet, dass Autophagie die Sekretion von IL-1 reduziert, indem sie pro-IL-1 in LPS-stimulierten Makrophagen abbaut.28 Interessanterweise fanden wir heraus, dass IL-1 (grün) gemeinsam lokalisiert war mit LC3 puncta (rot) und LAMP2 (rosa) im CON und DN (Diabetische Nephropathie)plus CO (Kohlenmonoxid)Gruppen (Abbildung 5D, der rote Pfeil), die den Schnittpunkt zwischen SASP und Autophagieabbau anzeigen. Ebenso im Vergleich zum DN (Diabetische Nephropathie)Gruppe hatten auch andere Zytokine von SASP, einschließlich IL-6, TGF- und VEGF, eine bescheidene, aber offensichtliche Kolokalisierung mit LC3 puncta und LAMP2 im CON und DN plus CO (Kohlenmonoxid)Gruppen (Abbildung 5E-G, der rote Pfeil), unter denen VEGF am offensichtlichsten mit Autolysosomen kolokalisiert war (Abbildung 5G). Allerdings die überlappende gelbe Färbung im DN (Diabetische Nephropathie)Gruppe zeigte, dass SASP nur zusammen mit LC3 puncta lokalisiert war (Abbildung 5D-G, der weiße Pfeil). Darüber hinaus wurde der Proteinspiegel von VEGF in HPC nach Zugabe von Autophagie-Agonisten (ABT737 und Rapamycin) oder CORM-2 gemessen. Obwohl es keinen signifikanten Unterschied im Gesamtproteinspiegel von VEGF (Abbildung 5H) gab, war das Vorhandensein sowohl von Autophagie-Agonisten als auch von CO (Kohlenmonoxid)reduzierte deutlich die Freisetzung von VEGF in durch HG induziertem HPC ( 5I , J). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein Teil von SASP über Autophagie abgebaut wird.
ABBILDUNG 4 CO (Kohlenmonoxid)gelinderte Seneszenz durch Verbesserung der Autophagie in vitro. HBZY-1, HPC und HK-2 wurden mit HG, CORM-2 und Autophagie-Inhibitoren (WORT: 200 nM und CQ: 5 μmol/L) behandelt.
A, Die Färbung und positive Zellen von SA- -gal in 3 Arten von Nierenzellen (n=3). Maßstabsleiste: 25 μm.
B, C, Zellproliferation bestimmt durch EdU-Färbung in HBZY-1 und HK-2 und Quantifizierung des Anteils positiver Zellen (n=3). Maßstabsleiste: 50 μm.
D, Expression von Seneszenz-verwandtem Protein (p53, p16 und p21) in HBZY-1 (n=5).
E, F, Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von p53 und p16 und Quantifizierung des Anteils positiver Zellen in HK-2 und HPC (n=3). Maßstabsleiste: 50 μm.
G, Die Proteinexpressionsniveaus von Atg7 in HK-2, stummgeschaltet mit siRNA (drei Sequenzen).
H, Repräsentative Bilder von SA- -gal (Maßstabsbalken: 50 μm) und EdU-Färbung (Maßstabsbalken: 25 μm) und Quantifizierung des Anteils positiver Zellen in HK-2 (n {{4 }}). *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
3.6|CO (Kohlenmonoxid)aktivierte die Autophagie teilweise durch Dissoziation des Beclin-1-Bcl-2-Komplexes
Es wurde berichtet, dass die Dissoziation des Beclin-1-Bcl-2-Komplexes die Autophagie verbessert und vorzeitiger Alterung einschließlich altersbedingter Nierenveränderungen vorbeugt.21 Zusätzlich wird CO (Kohlenmonoxid)aktivierte Autophagie durch Beclin-1 in den Sepsis-Mäusen.1/Daher untersuchten wir, ob die Dissoziation der komplexvermittelten Aktivierung der Autophagie durch CO (Kohlenmonoxid). Co-Immunpräzipitationsergebnisse zeigten, dass CO (Kohlenmonoxid)reduzierte Beclin-1-Bcl-2-Bindung in DN (Diabetische Nephropathie) Mäuse (Abbildung 6A). Außerdem verglichen mit der Behandlung von HG und CO (Kohlenmonoxid), die kombinierte Verwendung von HG, CO (Kohlenmonoxid)und das Beclin-1-Bcl-2-Komplex-Dissoziationsmittel ABT737 aktivierten die Autophagie von HBZY-1 weiter, was durch unverändertes LAMP2, verringertes p62 und erhöhtes LC3ll/LC3l-Verhältnis belegt wird (Abbildung 6B). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die kombinierte Nutzung von CO (Kohlenmonoxid)und ABT737 regulierten die Expression von p53, p21 und p16 in HBZY-1 weiter herunter (Abbildung 6C) und verringerten die SA- -galt-Zelle in HBZY-1, HK{{9} } und HPC (Abbildung 6D), was darauf hindeutet, dass ABT737 die Anti-Seneszenz-Wirkung von CO verstärkt (Kohlenmonoxid). Diese Beobachtungen legten nahe, dass CO (Kohlenmonoxid)könnte die Autophagie aktivieren, indem es den Beclin-1-Bcl-2-Komplex dissoziiert, um die Seneszenz zu lindern.
