Polyzystische Nierenerkrankung

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Teil 2: Nierenorganoide, die aus erythroiden Vorläuferzellen von Patienten mit autosomal dominanter polyzystischer Nierenerkrankung erzeugt wurden

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Hintergrund:NiereOrganoide wurden weitgehend aus kommerziell erhältlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen; Es war jedoch eine große Herausforderung, Nieren-Organoid-Modelle von Patienten mit autosomal dominanter Polyzystik effizient herzustellenNiereKrankheit (ADPKD), die sowohl die Embryogenese als auch die Mechanismen der Zystogenese rekapitulieren.

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Methoden: Erythroide Blutvorläufer (EPs) von zwei ADPKD (autosomal dominante polyzystischeNiereKrankheit) Patienten und einem gesunden Spender (HC) wurde als Vergleichskontrolle verwendet, um die vielen technischen Schritte für die Reprogrammierung von EPs und für die Generierung von Organoiden zu normalisieren. EPs wurden durch einen episomalen Vektor in iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) reprogrammiert, die wurden in renale tubuläre Organoide differenziert und dann durch Forskolin stimuliert, um die Bildung von Zysten zu induzieren.

Ergebnisse: Von EPs abgeleitete iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) zeigten alle Merkmale der Pluripotenz und konnten sich in alle drei Keimblätter differenzieren. Aus Einzelzellen wurden nach 28 Tagen in Matrigel 3D-röhrenförmige Organoide generiert. HC und ADPKD (autosomal dominante polyzystischeNiereKrankheit) Organoide bildeten nicht spontan Zysten, aber nach Forskolin-Stimulation wurden zystenähnliche Strukturen in der ADPKD (autosomal dominante polyzystischeNiereKrankheit) Organoide, aber nicht in den HC-abgeleiteten Organoiden.

Fazit: Das haben die Ergebnisse dieser Studie gezeigtNiereOrganoide wurden erfolgreich aus den Blut-EP-Zellen von ADPKD (autosomal dominant polycysticNiereKrankheit) Patienten und einem gesunden Kontrollspender. Dieser Ansatz sollte als mächtiges Werkzeug für das Embryonal beitragenNiereEntwicklungsmodell, das in der Lage ist, die sehr frühen pathophysiologischen Mechanismen der Zytogenese zu rekapitulieren.

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Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir ausführlich ein Verfahren zur Generierung von Nierenorganoiden aus menschlichen iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) beschrieben, die aus den erythroiden Blutvorläuferzellen von Patienten mit ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) gewonnen wurden. Viele somatische Zelltypen wurden erfolgreich in iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) umprogrammiert, einschließlich Blutzellen [Z]. Hier haben wir uns aus mehreren Gründen für die Verwendung von erythroiden Blutvorläufern als Ausgangszelltyp entschieden, wie z. B. ihre genomische Integrität, ihr epigenetisches Gedächtnis und ihre effiziente Reprogrammierung [11,17,18]. Die Effizienz, mit der erythroide Vorläufer in iPSCs umgewandelt wurden, war um zwei Größenordnungen besser (7 Prozent -28 Prozent ) als die Effizienz differenzierter Blutzelltypen (0.0 2 Prozent -0,60 Prozent) oder Fibroblasten (0,74 Prozent)[Z]. Trotz der geringen Häufigkeit dieser Zellen im peripheren Blut können sie leicht isoliert und in vitro expandiert werden, um eine ausreichende Zahl für die Reprogrammierung zu produzieren. Eine der wichtigsten Herausforderungen bei der Etablierung geeigneter iPSCs ist ihre genotypische und phänotypische Variabilität [6], aber es gibt einige technische Strategien, die vorgeschlagen werden, um eine solche Variabilität zu umgehen oder zu reduzieren. In den vorliegenden Experimenten haben wir ein nicht-integrierendes episomales System zur Reprogrammierung verwendet, das keine Genomintegration für die zu exprimierenden Reprogrammierungsgene erfordert [10], was eine geringere Immunogenität ermöglicht und genetisch stabilere Zellen erzeugt [19,20]. Darüber hinaus wurden alle Proben aus derselben Quelle gewonnen, was dazu beiträgt, die epigenetische Variabilität zu minimieren [12] unter der Annahme, dass die Differenzierung der Ausgangszelle die Effizienz der Endergebnisse beeinflussen könnte. Die Analyse der Pluripotenzmarker und die Fähigkeit von iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen), sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren, wurden nebeneinander verglichen, und sie wurden auch mit der embryonalen H9-Zelllinie verglichen, die als positive Kontrolle verwendet wurde . Alle diese Vergleiche zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen ADPKD-Patienten (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung), HCs und H9-Zellen.

Es wurden mehrere Protokolle entwickelt, um die Differenzierung von iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) zu Nierenorganoiden zu induzieren [13,21]. Basierend auf den von Cruz et al. [6] erhielten wir Strukturen mit den Eigenschaften proximaler Tubuli, einschließlich der Expression von NHE3 und AOP1. Darüber hinaus exprimierten die Organoide NPHS2, was auf das Vorhandensein von Podozyten-ähnlichen Zellen hinweist.

Umgekehrt wurde AQP2 in diesen tubulären Organoiden nicht exprimiert. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien überein, die auf mehrere Einschränkungen bei der Entwicklung von Strukturen hinweisen, die von der Ureterknospe (UB) in vitro abgeleitet sind, wobei die Entwicklung von UB spezifische Protokolle erfordert, da das Zeitfenster für die Zugabe des spezifischen Induktors sehr begrenzt ist [ 6,22,23].

Bei der Generierung von Nierenorganoiden aus iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) wird die gesamte renale Embryogenese in vitro rekapituliert, wobei zunächst die Bildung von kavitierten Sphäroiden aus Einzelzellen erfolgt [14]. Tatsächlich fanden wir heraus, dass undifferenzierte iPSCss (induzierte pluripotente Stammzellen) sowohl von ADPKD-Patienten (autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung) als auch von gesunden Kontrollpatienten Epiblast-ähnliche sphäroide Strukturen bildeten, die morphologisch ähnlich waren. Obwohl in der vorliegenden Studie keine DNA-Sequenzierung der PKD1- und PKD2-Gene durchgeführt wurde, weisen die aktuellen Ergebnisse darauf hin, dass die Art der von den Patienten getragenen Mutation keinen Einfluss auf die typische Epiblastenmorphogenese hatte. Weitere Studien sind noch erforderlich, um die Expression von zentralen Molekülen, die an dieser Phase der Embryonalentwicklung beteiligt sind, genauer zu bewerten.

Gemäß dem von Freedman et al. [14] beobachteten wir, dass sich Sphäroide 26 Tage nach Induktion der Differenzierung in röhrenförmige Organoide differenzierten, und das Timing war sowohl für ADPKD-Patienten (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) als auch für HC ähnlich (Abb. ③). Nichtsdestotrotz bemerkten wir eine gewisse Variabilität in Bezug auf den Zeitplan der Expression und die Niveaus der Differenzierungsmarker. Andererseits war die Morphologie der tubulären Strukturen ähnlich und vergleichbar zwischen Proben von ADPKD-Patienten und HC. Im Gegensatz dazu fand die Gruppe von Cruz et al. bei der Verwendung von iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen), die aus Nierenbiopsien von ADPKD-Patienten (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) stammten, eine höhere Variabilität in der Fähigkeit dieser Zellen, Organoide zu bilden[6].In Zusätzlich zu der großen Vielfalt an Mutationen, die dieser Krankheit innewohnen, können diese Unterschiede in der Effizienz der Gewinnung von Organoiden auch durch die heterogenen Zelltypen erklärt werden, die in Biopsieproben vorhanden sind, im Gegensatz zu den erythroiden Vorläufern, die eine homogenere Zellpopulation darstellen. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass trotz der Variabilität und Unterschiede in der Effizienz verschiedener iPSC-Klone zur Bildung von Nierenorganoiden die Gewinnung letzterer von ADPKD-Patienten (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) ein einzigartiges Modell zur Untersuchung der vielfältigen Formen phänotypischer Manifestationen darstellen kann dieser Krankheit. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass die patientenspezifischen iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen), die vollständig immunkompatibel sind, in Zukunft für individuelle regenerative Therapien verwendet werden könnten, wenn es eine beträchtliche Variabilität der Mutationen in der ADPKD-betroffenen Population gibt , zusätzlich zur Entwicklung eines In-vitro-Modells, um zu überprüfen, ob die sehr frühen phänotypischen Manifestationen auch so vielfältig sind wie das klinische Erscheinungsbild.

Unstimulierte Organoide, die von Patienten mit HCor ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) stammten, bildeten nicht spontan Zysten. Die typische Morphologie von Zysten und die Expression von Cystogenese-Markern waren in keiner Probe nachweisbar, sogar die organoide Differenzierung in Kultur bis zum Abschluss von 35 Tagen verlängert. Es wurde gezeigt, dass Zellproliferation allein keine Zysten produziert [24]. Darüber hinaus ist ein drittes unabhängiges Ereignis (bekannt als Third-Hit) erforderlich, um die Zystenbildung und das Wachstum in vivo zu beschleunigen [23]. Umgekehrt trat eine durch Forskolin induzierte Zystenbildung bei den Organoiden von ADPKD-Patienten auf, nicht jedoch bei denen von HC. Bemerkenswerterweise wurden Zysten, obwohl vorhanden, in den ADPKD-Proben selbst in Gegenwart von Forskolin zu einem geringen Prozentsatz beobachtet, wie auch von Freedman et al. [14] in Organoiden, die aus dem CRISPR/Cas9-Modell der ADPKD-Krankheit gebildet wurden. Einige Hypothesen können aufgestellt werden, um die geringe Häufigkeit von Zysten zu erklären, die in dem vorliegenden Modell gefunden werden. 1) Organoide, die in einem 3D-Suspensionsmilieu kultiviert wurden, zeigten im Vergleich zu anhaftenden Organoiden eine viel höhere Zystogeneseeffizienz [6], was darauf hinweist, dass die Mikroumgebung direkt an der Zystogenese beteiligt ist. 2) Das in der vorliegenden Studie verwendete experimentelle Protokoll bildete proximale Tubulus-Organoide, aber nicht distale Teile des Nephrons [23]. Obwohl alle Nephronsegmente Zysten einschließlich proximaler Tubuli [25] hervorbringen können, scheinen diejenigen, die von Sammelrohren stammen, größer und in höherer Anzahl zu sein als solche aus anderen Segmenten [26], 3) Schließlich wurde kürzlich gezeigt, dass der Ursprung von Zysten möglicherweise mit dem Vorhandensein mehrerer PKD1-Mutationen zusammenhängen, die die Schwere der Erkrankung bestimmen, und dass die Zystenbildung in den Sammelrohren mit der Schwere der Erkrankung assoziiert war [27, 28].

Zusammenfassend zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass es möglich ist, Organoide mit dreidimensionalen Strukturen ähnlich der Nierenvorläuferarchitektur unter Verwendung von iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) zu erzeugen, die aus erythroiden Vorläufern reprogrammiert wurden, die leicht von ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) isoliert werden konnten. Patienten und dass diese Organoide in der Lage sind, unter Forskolin-Stimulation Zysten zu bilden. Diese vielversprechende Methodik enthüllt eine Methode zum besseren Verständnis der sehr frühen genetischen, phänotypischen und physiologischen Schritte bei der Zystenbildung im Rahmen der ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung).

Verweise

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26530876

2. Watnick TJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatische Mutation in einzelnen Leberzysten unterstützt ein Zwei-Treffer-Modell der Zystogenese bei autosomal dominanter polyzystischer Nierenerkrankung. Mol Cell, 2: {{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Y. Pei, T. Watnick, N. He, K. Wang, Y. Liang, P. Parfrey, et al.: Somatische PKD2-Mutationen in einzelnen Nieren- und Leberzysten unterstützen ein „Zwei-Treffer“-Modell der Zystogenese bei der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung Typ 2. JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Ein kritischer Entwicklungsschalter definiert die Kinetik der Nierenzystenbildung nach Verlust von Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al.: Nierenschäden sind ein dritter Hit, der die schnelle Entwicklung der polyzystischen Nierenerkrankung bei Erwachsenen fördert. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al.: Die organoide Zystogenese zeigt eine entscheidende Rolle der Mikroumgebung bei der menschlichen polyzystischen Nierenerkrankung. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Induktion pluripotenter Stammzellen aus Fibroblastenkulturen. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al.: Reduziertes ciliäres Polycystin-2 in induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten mit polyzystischer Nierenerkrankung mit PKD1-Mutationen. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Derivation of Transgene-Free Induced Pluripotent Stem Cells from a Single Drop of Blood.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12PMID:27532818

10. YuJ, Hu K., Smuga-Otto K., Tian S., Stewart R., Slukvin Il, et al.: Human duced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Die Differenzierungsstufe bestimmt das Potenzial hämatopoetischer Zellen für die Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Nierenorganoide: Eine in vivo-ähnliche In-vitro-Technologie. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https:/ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al.: Modellierung von Nierenerkrankungen mit CRISPR-mutierten Nierenorganoiden, die von menschlichen pluripotenten Epiblasten-Sphäroiden stammen. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al.; Einheitliche Kriterien für die Ultraschalldiagnose von ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K., Ueno M., Kamiya D., Nishiyama A., Matsumura M., Wataya T., et al.: Ein ROCK-Inhibitor ermöglicht das Überleben dissoziierter menschlicher embryonaler Stammzellen. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N., Ahfeldt T., Rigamonti A., UtikalJ., Cowan C., Hochedlinger K.: Ein hocheffizientes System zur Generierung und Untersuchung humaninduzierter pluripotenter Stammzellen. Zelle/Stammzelle. 3: 340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420