KLRG1 markiert tumorinfiltrierende CD4-T-Zell-Untergruppen, die mit der Tumorprogression und dem Ansprechen auf die Immuntherapie verbunden sind

Abstrakt

Aktuelle Methoden zur Biomarker-Entdeckung und Zielidentifizierung in der Immunonkologie basieren auf statischen Schnappschüssen der Tumorimmunität. Um die zeitliche Natur der Antitumor-Immunantworten gründlich zu charakterisieren, haben wir ein 34-Parameter-Panel für die spektrale Durchflusszytometrie entwickelt und Hochdurchsatzanalysen in kritischen Kontexten durchgeführt.

Wir nutzten zwei unterschiedliche präklinische Modelle, die die Krebsimmuneditierung (NPKC1) bzw. die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB)-Reaktion (MC38) rekapitulieren, und profilierten mehrere relevante Gewebe an und um wichtige Wendepunkte der Immunüberwachung und -flucht bzw. der ICB-Reaktion.

Ziele beziehen sich auf wichtige Biomoleküle in Zellen, wie Proteine, Enzyme und Rezeptoren. Zielerkennung ist der Einsatz chemischer und biologischer Methoden zur Identifizierung der spezifischen Eigenschaften und Funktionen dieser Biomoleküle für die Anwendung bei der Behandlung von Krankheiten und der Arzneimittelentwicklung.

Unter Immunität versteht man die Fähigkeit des Körpers, dem Eindringen fremder Krankheitserreger und dem Wachstum endogener abnormaler Zellen zu widerstehen. Der Kern des Immunsystems besteht aus Immunzellen und -molekülen, die enge Verbindungen und Wechselwirkungen mit ihren Zielen haben.

Bei der Behandlung von Krankheiten und der Arzneimittelentwicklung ist der Zusammenhang zwischen Zielidentifizierung und Immunität sehr wichtig. Der Wirkungsmechanismus vieler Arzneimittel beruht beispielsweise auf der Zielerkennung, der gezielten Ausrichtung auf bestimmte Proteine, Enzyme, Rezeptoren und andere Moleküle, der Beeinflussung ihrer Funktionen und der Regulierung der Signalübertragung, um therapeutische Wirkungen zu erzielen. Auch Zellen und Moleküle des Immunsystems können Angriffspunkte für Medikamente sein. Krebsmedikamente erzielen beispielsweise therapeutische Wirkungen, indem sie die Immunantwort von Krebszellen beeinflussen und die Zellapoptose und -proliferation regulieren.

Daher kann bei der Arzneimittelentwicklung und der klinischen Behandlung eine umfassende Berücksichtigung der Zielidentifizierung und der Immunitätsfaktoren zu einer wirksameren Arzneimittelentwicklung und einer verbesserten therapeutischen Wirkung führen. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir die Immunität verbessern. Cistanche kann die Immunität stärken. Cistanche ist reich an einer Vielzahl antioxidativer Substanzen wie Vitamin C, Vitamin C, Carotinoiden usw. Diese Inhaltsstoffe können freie Radikale abfangen, oxidativen Stress reduzieren und die Immunität verbessern. Systemwiderstand.

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Die durch maschinelles Lernen gesteuerte Datenanalyse ergab ein Muster der KLRG1-Expression, das eindeutig intratumorale Effektor-CD4-T-Zellpopulationen identifizierte, die in allen Tumormodellen konstitutiv mit der Tumorlast assoziiert sind und in Tumoren verloren gehen, die als Reaktion auf ICB eine Regression durchlaufen. In ähnlicher Weise war eine Helios-KLRG1-plus-Untergruppe tumorinfiltrierender regulatorischer T-Zellen (Tregs) mit dem Fortschreiten des Tumors vom Immungleichgewicht zum Entkommen verbunden und ging auch in Tumoren verloren, die auf ICB reagierten.

Validierungsstudien bestätigten KLRG1-Signaturen in menschlichen Tumor-infiltrierenden CD4-T-Zellen, die mit dem Fortschreiten der Erkrankung bei Nierenkrebs verbunden sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KLRG1- und CD4-T-Zellpopulationen als Untergruppen für die weitere Untersuchung der Krebsimmunität vorgesehen sind, und belegen den Nutzen der longitudinalen spektralen Flussprofilierung als Motor für die Entdeckung dynamischer Biomarker und/oder Ziele.

Einführung

Die Immuntherapie ist heute eine Säule der Krebsbehandlung. Allerdings sind Reaktionen auf die meisten Immuntherapeutika nach wie vor selten, auf eine begrenzte Anzahl von Tumorarten beschränkt und schwer vorherzusagen(1). Die Verbesserung der Ansprechraten und die Entwicklung von Biomarkern, die das Ansprechen vorhersagen, sind zentrale Ziele der Tumorimmunologie, aber dies bleibt eine Herausforderung.

Eine Vielzahl komplexer multizellulärer Interaktionen kann den Ausgang einer Antitumor-Immunantwort bei einem bestimmten Patienten beeinflussen. Daher ist es üblich, dass einzelne Biomarker – oder die therapeutische Modulation einzelner Signalwege – bei einigen, aber nicht bei den meisten Krebspatienten von Nutzen sind.

Beispielsweise gibt es drei immunbezogene Biomarker, die derzeit in großem Umfang klinisch eingesetzt werden; (i) Tumormutationslast (TMB), direkt gemessen oder abgeleitet über das Vorhandensein deaktivierender Mutationen in der DNA-Reparaturmaschinerie (2-4), (ii) PD-L1-Expression durch Immunhistochemie (IHC) (5) und (iii) bereits bestehende Immunität, gemessen am Vorhandensein von CD8-T-Zellen in und um Tumoren, genannt Immunoscore(6).

Während jeder in bestimmten Kontexten signifikant mit dem Ansprechen auf eine Immuntherapie verbunden ist, bleiben die Sensitivität und Spezifität dieser Prädiktoren suboptimal(7). Diese unimodalen Ansätze sind wahrscheinlich nicht in der Lage, die komplexen Mechanismen, die der Antitumorimmunität zugrunde liegen, vollständig zu erfassen, einschließlich der dynamischen Natur solcher Reaktionen, die über Gewebe hinweg und im Laufe der Zeit auftreten.

Daher kann die Anwendung hochmultiplexierter Einzelzell-Immunprofilierungsansätze zur Biomarkererkennung und Zielerkennung auf gewebeübergreifende, longitudinale Weise nuancierte Immunphänotypen mit größerem prädiktiven und translationalen Nutzen liefern.

Zu diesem Zweck haben wir ein 34-Parameter-Spektraldurchflusszytometrie-Panel und eine hochdimensionale Datenanalysepipeline entwickelt, um Immunphänotypen auf Proteinebene abzufragen, die mit verschiedenen Phasen des Krebsimmuneditierungszyklus verbunden sind, einschließlich Immunflucht und Tumorwachstum sowie Immun-Checkpoint Blockadereaktion (ICB) in präklinischen Modellen.

Wir haben ein Profil der NPK-C1- und ICB-behandelten MC38-Modelle erstellt und dabei mehrere Gewebe (Tumor, ableitende bzw. nicht ableitende Lymphknoten und Blut) über und um wichtige Wendepunkte in der Tumorprogression analysiert. Dies erleichterte die tiefgreifende Charakterisierung der Dynamik, die der natürlichen und ICB-induzierten Tumorregression, dem Übergang zum Immungleichgewicht und dem anschließenden Übergang vom Gleichgewicht zum unkontrollierten Tumoraustritt zugrunde liegt. Validierungsstudien an menschlichen Einzelzelldatensätzen zu Nierenkrebs bestätigten die translationale Relevanz dieser Ergebnisse.

Materialen und Methoden

Mäuse. Männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (5-6 Wochen alt) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) gekauft. Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der Verwendung 6-8 Wochen alt. Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften des NIH und der American Association of Laboratory Animal Care gehalten. Alle Experimente und Verfahren für diese Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Columbia University Medical Center genehmigt.

Zelllinien. Die NPK-C1-Zelllinie (ursprünglich LM7304) wurde von Dr. Cory AbateShen von der Columbia University bereitgestellt. Weitere Einzelheiten finden Sie in früheren Referenzen (8,9). NPK-C1-Zellen wurden in R10 gehalten, bestehend aus RPMI-Medium (Corning; Corning, NY), ergänzt mit 10 Prozent FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38-Kolonkarzinomzellen wurden von Kerafast gekauft und in D10, bestehend aus DMEM (Corning; Corning, NY), ergänzt mit 10 Prozent FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD), kultiviert.

Tumorprovokation und Therapieinjektionen. NPK-C1-Zellen bei 70-90 Prozent Konfluenz oder MC38-Zellen bei 50-75 Prozent Konfluenz wurden mit 0.05 Prozent Trypsin (Gibco, Gaithersburg, MD) geerntet und mit gewaschen PBS, gezählt und bei 10x106 Zellen/ml in eiskaltem PBS resuspendiert. Am Tag 0 wurden 6-8 Wochen alten Mäusen 1x106 NPK-C1- oder MC38-Zellen in die rechte Flanke implantiert. Die Tumormessungen wurden in den Dimensionen X, Y und Z (größter Durchmesser, kleinster Durchmesser bzw. größte Höhe) alle 2-3 Tage mit einem digitalen Messschieber aufgezeichnet und das Tumorvolumen wurde durch Multiplikation von X*Y*Z berechnet. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) oder Ratten-IgG2a-Isotyp-Antikörper (Bio ml pro Maus an den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach der MC38-Implantation.

Gewebeentnahme. Nach der Euthanasie der Maus wurden etwa 200 μl Blut mittels Herzpunktion unter Verwendung einer mit 0,2 Prozent Heparin (StemCell Technologies; Vancouver, BC) beschichteten Spritzennadel isoliert und in Röhrchen mit 10 μl 0,5 M auf Eis gelegt EDTA (Corning; Corning, NY). Tumordrainierende und nichtdrainierende Leistenlymphknoten wurden präpariert und in 48-Wellplatten mit 150 μl R10-Medium auf Eis gelegt.

Die Tumoren wurden geerntet, massiert und bis zu 50 mg Tumor gewürfelt und in X-Vivo 15-Medien (Lonza; Basel, Schweiz) in 5-ml-Eppendorf-Röhrchen auf Eis gegeben. DNase (40 μl einer 20 mg/ml-Lösung; Roche; Basel, Schweiz) und Collagenase D (125 μl einer 40 mg/ml-Lösung; Roche; Basel, Schweiz) wurden den Tumorproben vor der Inkubation auf einem Schüttler bei 37 °C zugesetzt 30 Minuten. Die Verdauungsreaktionen wurden durch Vortexen (30 Sekunden) und Zugabe von 5 ml R10-Medium gelöscht. Tumorverdauungen wurden durch 70-μm-Filter (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) filtriert und pelletiert. Blutproben wurden durch zwei aufeinanderfolgende {{14}minütige Inkubationen in 2 ml ACK-Puffer (Quality Biological; Gaithersburg, MD) und Abschrecken in R10 vor dem Pelletieren RBC lysiert. Die Lymphknoten wurden mit einem 1-ml-Spritzenkolben in der 48-Well-Platte physisch aufgelöst, dann wurden die Suspensionen durch {{19}um-Filter filtriert. Alle Proben wurden zum Färben in 96-Wellplatten mit U-Boden gegeben.

Durchflusszytometrie. Die Proben wurden mit PBS gewaschen. Abgestorbene Zellen wurden durch Resuspension in 100 μl PBS plus Live/Dead Fixable Blue-Farbstoff (1:500; Invitrogen; Waltham, MA) gefärbt. Dieser und alle weiteren Färbe- oder Fixierungsschritte wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler lichtgeschützt durchgeführt. Die Proben wurden 2x mit PBS gewaschen und dann in FACS (PBS plus 3 Prozent FBS plus 1 mM EDTA plus 10 mM HEPES) resuspendiert, ergänzt mit TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) und TruStain Monozytenblocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) und auf Eis gelegt.

Oberflächenantikörper wurden in optimalen Verdünnungen (siehe Ergänzungstabelle S1) in FACS, ergänzt mit Brilliant Stain Plus-Puffer (BD; Franklin Lakes, NJ), hergestellt und dann in einer Blockierungslösung zu den Proben gegeben. Nach der Färbung wurden die Proben 2x mit FACS-Puffer gewaschen und in 100 μl FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit-Puffer (eBioscience; San Diego, CA) fixiert. Die Proben wurden zweimal mit 1X Permeabilisierungspuffer (1X PW) gewaschen und dann in 1X PW plus intrazellulären Antikörpern gefärbt. Die Proben wurden dann zweimal in 1X PW gewaschen, dann in 100 μl FluoroFix-Puffer (BioLegend: San Diego, CA) fixiert, zweimal mit FACS gewaschen, dann in 200 μl FACS resuspendiert und in den 96-Well-Platten zur Aufnahme am folgenden Tag versiegelt Cytek Aurora 5-Laserzytometer.

Gleichzeitig gefärbte Splenozytenproben wurden für Einzelfärbungskontrollen verwendet. Analyse und Statistik. Längsprofilierungsexperimente wurden jeweils einmal für die Modelle MC38 und NPK-C1 durchgeführt. Insgesamt wurden n=10-25 Mäuse pro Zeitpunkt ausgewertet. Durchflusszytometriedaten wurden in FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ) analysiert und die hochdimensionalen Plugin-Algorithmen UMAP und FlowSOM wurden von FlowJo Exchange heruntergeladen. Bis zu 30.000 lebende CD45 plus tumorinfiltrierende Zellen und bis zu 15.000 lebende CD45 plus Blut- oder LN-abgeleitete Zellen pro Probe wurden für eine hochdimensionale Analyse verkettet.

Die gesamte Dimensionsreduzierung und Clusterbildung wurde in FlowJo durchgeführt. Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism v9.3.1 durchgeführt. Die Pearson-Korrelation wurde verwendet, um Korrelationskoeffizienten zu generieren, und ungepaarte Student-T-Tests mit Welch-Korrektur wurden verwendet, um Clusterhäufigkeiten zwischen Gruppen zu vergleichen. Einzelzellanalytische Methoden wurden bereits beschrieben (10,11).

Das KLRG1-Regulon wurde aus dem Konsensus-metaVIPER-KLRG1-Regulon von Obradovic et al. (11) extrahiert. Um die KLRG1-Regulon-Signatur zu berechnen, passen wir ein zufälliges Waldregressionsmodell mit Regulon-Genen als Merkmalen und KLRG1 als Ziel an und berechnen dann die Gini-Wichtigkeitswerte der Regulon-Gene, um deren Einfluss auf die KLRG1-Expression zu bestimmen. Der KLRG1-Regulon-Score jeder Zelle wurde durch die gewichtete Summe der Expressionsmaße aller Regulon-Gene in der Zelle mit Wichtigkeits-Scores als Gewichtungen angegeben.

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