Laccase-Mediator-System unter Verwendung eines natürlichen Mediators als Weißmacher zur Entfärbung von Melanin Teil 1

Abstrakt: In dieser Studie wurde ein Laccase-Mediator-System (LMS) unter Verwendung eines natürlichen Mediators als Aufheller für die Melanin-Entfärbung entwickelt. Sieben natürliche Mediatoren wurden verwendet, um synthetische Mediatoren zu ersetzen und das geringe Redoxpotential von Laccase und den eingeschränkten Zugang von Melanin zum aktiven Zentrum von Laccase erfolgreich zu überwinden. Die Melanin-Entfärbungsaktivität von Laccasen aus Trametes versicolor (lacT) und Myceliophthora thermophila (lacM) wurde durch den Einsatz natürlicher Mediatoren wie Acetosyringon, Syringaldehyd und Acetovanillon, die eine geringe Zytotoxizität zeigten, deutlich gesteigert. Die Methoxy- und Ketongruppen natürlicher Mediatoren spielen eine wichtige Rolle bei der Melaninentfärbung. Die Spezifitätskonstanten von lacT und lacM für die Melaninentfärbung wurden um 247 bzw. 334 erhöht, wenn Acetosyringon als Mediator verwendet wurde. LMS mit Spitze und Acetosyringon könnte auch das im Cellulose-Hydrogel-Film vorhandene Melanin entfärben, was den Hautzustand nachahmt. Darüber hinaus konnte LMS nicht nur synthetische Eumelanin-Analoga entfärben, die durch Oxidation von Tyrosin hergestellt wurden, sondern auch natürliches Melanin, das von Melanomzellen produziert wird.

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1. Einleitung

Laccasen (EC 1.10.3.2, Benzoldiol: Disauerstoffoxidoreduktasen) sind Multikupferproteine, die die Oxidation verschiedener phenolischer und nichtphenolischer Verbindungen über einen radikalkatalysierten Reaktionsmechanismus durch Reduktion von molekularem Sauerstoff katalysieren [1,2]. Laccasen wurden als Biokatalysatoren für biologische Abbauprozesse verwendet, beispielsweise für die biologische Sanierung von Farbstoffen [3,4], Arzneimitteln [5,6], Herbiziden [7] und der Delignifizierung [8–10]. Laccasen wurden auch zur Katalyse der Polymerisation von Farbstoffvorläufern und organischen Verbindungen verwendet [11]. Insbesondere ihre attraktiven Eigenschaften, wie z. B. eine geringe Substratspezifität, die Verwendung von Sauerstoff als endgültigem Elektronenakzeptor, die Bildung von Wasser als Nebenprodukt und kein Bedarf (oder keine Produktion) von Peroxiden, machen sie für biotechnologische und biotechnologische Zwecke interessant Umweltbereiche [1,11,12].

An der katalytischen Aktivität der Laccase sind vier Kupferionen im aktiven Zentrum beteiligt. „Blaues“ Kupfer (T1-Stelle) oxidiert das Substrat und der dreikernige Kupfercluster (T2/T3) empfängt die Elektronen von der T1-Stelle, um den molekularen Sauerstoff zu reduzieren [1,12,13]. Insbesondere das Redoxpotential des T1-Stellen-Cu wird als wesentlicher Faktor für die katalytische Fähigkeit von Laccasen angesehen [14]. Laccasen besitzen ein relativ niedriges Redoxpotential (0,4–0,8 V) im Vergleich zu ligninolytischen Peroxidasen (über 1 V) wie Manganperoxidase und Ligninperoxidase. Laccasen können nichtphenolische Substrate mit einem Redoxpotential über 1,3 V nicht direkt oxidieren [13,14]. Um die Einschränkungen von Laccase zu überwinden, verwenden Laccase-Mediator-Systeme (LMS) niedermolekulare Verbindungen wie 2,20 -Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) (ABTS), { {24}}Hydroxybenzotriazol (HOBt), Violursäure (VLA), N-Hydroxyphthalimid (HPI), N-Hydroxyacetanilid (NHA) und TEMPO, die als Redoxmediatoren wirken, wurden vorgeschlagen [15–17].

Diese Mediatoren ermöglichen die Oxidation sperriger Verbindungen über verschiedene Oxidationswege. Das Laccase-ABTS-System oxidiert Substrate, indem es über einen Elektronentransfermechanismus (ET) ein kationisches ABTS-Radikal erzeugt. LMS mit HOBt, VLA, HPI oder NHA erzeugen Nitroxylradikale über den Wasserstoffatomtransfermechanismus (HAT) [1,12,17]. Darüber hinaus reagieren Mediatoren wie TEMPO und seine Analoga über ionische Wege und erzeugen Oxoammoniumionen [1,12,18]. Durch den Einsatz dieser Mediatoren kann eine Vielzahl von Verbindungen in verschiedenen Anwendungen oxidiert werden, beispielsweise beim Farbstoffabbau [3,4], beim Arzneimittelabbau [5,6] und beim Ligninabbau [8–10]. Dennoch sind die Anwendungen synthetischer Mediatoren in industriellen Bereichen aufgrund ihrer potenziellen Toxizität, hohen Kosten und Enzyminaktivierungswirkung begrenzt. Kürzlich wurden von Lignin abgeleitete phenolische Moleküle als natürliche Mediatoren (z. B. Syringaldehyd, Acetosyringon, Vanillin, Acetovanillon, Methylvanillat, Ferulasäure, Sinapinsäure, p-Cumarsäure usw.) untersucht, um synthetische Mediatoren zu ersetzen [1,12]. . Die Vorteile natürlicher Mediatoren sind niedrige Kosten und geringe Toxizität, da sie aus natürlichen und erneuerbaren Quellen gewonnen werden [19].

Melanin ist eine Gruppe natürlicher Pigmente, die bei der Melanogenese durch die oxidative Polymerisation von Tyrosin durch Melanozyten entstehen. Natürliches Melanin kann in fünf Kategorien eingeteilt werden: Eumelanin, Phäomelanin, reines Melanin, Phäomelanin und Neuromelanin [20]. Kürzlich wurden verschiedene medizinische und elektrochemische Anwendungen unter Verwendung von Melanin oder Melaninvorläufern untersucht [20,21]. Die menschliche Hautfarbe wird hauptsächlich durch das Vorhandensein von Melanin bestimmt. In der Kosmetikindustrie wurde die direkte Depigmentierung von Melanin mithilfe von Enzymen für die Entwicklung von Hautaufhellern vorgeschlagen. Mehrere Peroxidasen wurden untersucht, um Melanin zu entfärben. Woo et al. zeigten, dass synthetisches Melanin direkt durch Ligninperoxidase aus P. chrysosporium entfärbt werden kann [22]. Die Gruppen Keneko und Mohorˇciˇc berichteten auch über die enzymatische Entfärbung von Melanin durch Manganperoxidase, die aus Pilzen (Sporotrichum pruinose und Phlebia radiata) isoliert wurde [23,24]. Kim et al. berichteten, dass rohe Enzymmischungen, die Manganperoxidase, Ligninperoxidase und Laccase enthielten, Melanin-Depigmentierungsaktivität zeigten [25]. Wenn Peroxidasen Melanin entfärben, benötigen sie Wasserstoffperoxid (H2O2) als Cofaktor, der die Haut reizen kann. Um den Verbrauch von H2O2 zu reduzieren, wurde daher Glucoseoxidase oder Laccase in das Enzymkombinationssystem eingeführt [26,27]. Laccasen können Melanin ohne den Einsatz von Wasserstoffperoxid entfärben. Khammuang und Sarnthima berichteten, dass Laccase aus Lentinus polycarpous Lév eine Melanin-Entfärbungsaktivität unter Verwendung von ABTS, Vanillin und Vanillinsäure als Mediatoren zeigte [28].

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

2.2. Melanin-Entfärbung durch LMS

Die gesättigte Melaninlösung (1,4 mg/ml) wurde durch Auflösen von 3 mg synthetischem Melanin in 1,3 ml 10 mM NaOH hergestellt. Die Lösung wurde 5 Minuten lang bei 8500 U/min zentrifugiert, um das ungelöste Melanin zu entfernen, und der Überstand wurde mit 0.1 M Zitronensäurephosphatpuffer (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 oder 7) und als Substratlösung für LMS verwendet. Die Melaninkonzentration in der Substratlösung betrug 63 µg/ml und wurde spektrophotometrisch bei 475 nm bestätigt. Die 0,8 ml Melaninsubstratlösung wurden mit 0,1 ml Mediatorlösung (0–1 mM) in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gemischt. Die Melanin-Entfärbungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,1 ml Laccase-Lösung (15,8 µg (0,6 U) lacT oder 19,2 µg (1,8 U) lacM) zu einer Mischung aus Melanin und dem Mediator bei 25 °C in einem schüttelnden Wasserbad mit 120 U/min eingeleitet . Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert und die Absorption des Überstands bei 475 nm gemessen. Die Entfärbungsausbeute (Prozent) wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Entfärbung (Prozent) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetische Untersuchung der Melanin-Entfärbung durch LMS

2.4. Zytotoxizität natürlicher Mediatoren

Die Melanomzelllinie B16F10 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) wurde verwendet, um die Zytotoxizität natürlicher Mediatoren für LMS zu bestimmen. Zur Messung der Zytotoxizität der Mediatoren wurde ein Neutralrot-Assay (NR) durchgeführt [29]. NR misst die Lebensfähigkeit lebender Zelllysosomen. Melanomzellen mit einer Konzentration von 3 × 104 Zellen wurden in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verteilt. Nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Zellen mit natürlichen Mediatoren (1, 2, 5, 10, 22 und 46 mM) behandelt. Nach zusätzlicher Kultivierung für 2 Tage wurden die Zellen mit 50 µg/ml NR-Lösung, gelöst in DMEM, behandelt und 3 Stunden lang inkubiert. Nach dem Entfernen des Überstands durch Absaugen wurde eine NR-Desorptionslösung (1 Prozent Eisessig, 49 Prozent Ethanol und 50 Prozent destilliertes Wasser) zur Farbextraktion verwendet. Nach dem Extraktionsprozess wurde die Absorptionsänderung bei 540 nm gemessen.

2.5. Vorbereitung und Entfärbung des Melanin/Cellulose-Hydrogelfilms

Um die Entfärbungsaktivität von LMS für den Melanin/Zellulosefilm zu messen, wurde der vorbereitete Hydrogelfilm in eine 1 × 2 cm große Folie geschnitten. Der Hydrogelfilm wurde in 4 ml 0,1 M Zitronensäurephosphatpuffer (pH 5,5) eingetaucht; Anschließend wurden dem Puffer 0,5 ml 1 mM Acetosyringon und 0,5 ml Spitzenlösung (2,5 U) zugesetzt. Die Entfärbungsreaktion wurde in einem Wasserbad unter Schütteln bei 120 Uhr und 25 °C für 3 Stunden durchgeführt. Nach der Reaktion wurde der Film mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Innenseite der Küvette befestigt, um die Änderung der Spektren im Bereich von 400–800 nm mit einem UV/Vis-Spektrophotometer zu messen. Unter den gleichen Bedingungen wurden auch Kontrollreaktionen ohne lacM oder Mediatoren durchgeführt. Eine Freisetzung des Melanins aus dem Film oder eine Farbveränderung des Melanin/Zellulosefilms wurde unter den Reaktionsbedingungen nicht festgestellt. Darüber hinaus wurde die Änderung der Farbparameter (L*-, a*- und b*-Werte) des Melanin/Cellulosefilms nach der Entfärbungsreaktion durch LMS auch mit einem Kolorimeter (KONICA MI NOLTA, Tokio, Japan) aufgezeichnet. Die Werte ∆L (metrischer Helligkeitsunterschied), ∆E (Gesamtfarbunterschied), YI (Gelbheitsindex) und WI (Weißheitsindex) wurden mithilfe der folgenden Gleichungen ermittelt [30–32]:

2.6. Herstellung von natürlichem Melanin

Natürliches Melanin wurde aus B16F10-Melanomzellen gewonnen. Die Zellen wurden mit Alpha-Melanozyten-stimulierendem Hormon behandelt, um Melanin zu produzieren. Nach 4 Tagen Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA eingefangen und 10 Minuten lang beschallt. Der Überstand wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 8000 U/min gewonnen und anschließend mit 6 M HCl auf pH 1,5 eingestellt. Die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 100 °C gekocht, um die restlichen Proteinfraktionen zu hydrolysieren. Die Lösung, die natürliches Melanin enthielt, wurde mit Aceton gewaschen, gefolgt von Chloroform und Ethanol, und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, um Rückstände wie Zellen, Medienkomponenten und Proteinfraktionen zu entfernen [33,34]. Alle Waschvorgänge wurden mehr als zweimal durchgeführt. Schließlich wurde natürliches Melanin durch Gefriertrocknung gewonnen und als Substrat für LMS verwendet.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Die Wirkung von Mediatoren auf die Melaninentfärbung durch LMS

Die Wirkung verschiedener Mediatoren auf die Melanin-Entfärbungsreaktion durch LMS wurde anhand von zwei Laccasen aus T. versicolor (lacT) und M. thermophila (lacM) untersucht (Abbildung 1).Wenn lacT ohne einen Mediator für die Melanin-Entfärbung verwendet wurde, betrug die Entfärbungsausbeute nach 5 Stunden Reaktion nur 1 Prozent. Wenn HOBt als Mediator für lacT verwendet wurde, erhöhte sich die Entfärbungsausbeute leicht auf 2 Prozent nach 5 Stunden Reaktion. Die Verwendung verschiedener synthetischer Mediatoren wie HOBt, ABTS, VLA und TEMPO bei der Laccase-katalysierten Oxidation phenolischer oder nichtphenolischer Verbindungen steigerte die Reaktionsgeschwindigkeiten erheblich [10,15]. Wenn der Zugang von Zielverbindungen zum aktiven Zentrum der Laccase durch ihre sterische Hinderung begrenzt ist, können durch Laccase gebildete Mediatorradikale die Zielverbindungen durch den Elektronentransfer- oder Wasserstoffatomtransfermechanismus effizient oxidieren [12]. HOBt ist aufgrund seines hohen Redoxpotentials (1,1 V) einer der am häufigsten verwendeten synthetischen Mediatoren bei LMS [6]. Aufgrund seiner potenziellen Zelltoxizität und der Fähigkeit, Laccase zu inaktivieren, ist HOBt jedoch kein guter kosmetischer Inhaltsstoff. Daher haben wir sieben natürliche Mediatoren, Acetosyringon, Syringaldehyd, p-Cumarsäure, Vanillin, Vanillinsäure, Vanillylalkohol und Acetovanillon, für die Melanin-Entfärbungsreaktion durch LMS ausgewählt. Interessanterweise wirken alle natürlichen Mediatoren als effizientere Mediatoren für die Melaninentfärbung durch Mangel als HOBt. Bei Verwendung von Acetosyringon, Syringaldehyd und p-Cumarsäure betrugen die Entfärbungsausbeuten nach 5-stündiger Reaktion 28 Prozent, 22 Prozent bzw. 18 Prozent. Diese Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit natürlicher Mediatoren für die Melanin-Entfärbungsreaktion durch LMS. Die Mediatoren im LMS werden durch Laccase zu Mediatorradikalen oxidiert, und die Mediatorradikale induzieren die Oxidation und Entfärbung von Melanin. Wenn Mangel ohne einen Mediator für die Melanin-Entfärbung während einer ausreichenden Reaktionszeit verwendet wurde, um den Gleichgewichtszustand zu erreichen, betrug die Entfärbungsausbeute nach 24-stündiger Reaktion 7 Prozent. Die natürlichen Mediatoren, mit Ausnahme von Vanillinsäure, wirken als wirksamere Mediatoren als HOBt für die Melaninentfärbung durch lacT nach 24-stündiger Reaktion. Die Entfärbungsausbeute nach 24-stündiger Reaktion mit Vanillinsäure als Mediator war geringer als nach 5-stündiger Reaktion. Dies kann durch die geringe Stabilität der oxidierten Radikalform der Vanillinsäure verursacht werden. Bei Verwendung von Acetosyringon, Syringaldehyd und Acetovanillon betrugen die Entfärbungsausbeuten nach einer 24-stündigen Reaktion 34 Prozent, 30 Prozent bzw. 31 Prozent. p-Cumarsäure steigerte die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit wirksamer als Acetovanillon, während Acetovanillon im Gleichgewichtszustand eine höhere Entfärbungsausbeute induzierte als p-Cumarsäure.

Die Wirkung des Mediators auf die Entfärbungsreaktion durch LMS unter Verwendung von lacM war auch der durch LMS unter Verwendung von lacT erzielten Wirkung sehr ähnlich. Wenn Spitze ohne einen Mediator für die Melanin-Entfärbung verwendet wurde, betrug die Entfärbungsausbeute nach 5 Stunden Reaktion nur 2 Prozent. HOBt als Mediator für lacM steigerte die Entfärbungsausbeute während der 5-stündigen Reaktion nicht. Alle natürlichen Mediatoren mit Ausnahme von p-Cumarsäure und Vanillin fungierten als wirksame Mediatoren der Melanin-Entfärbung durch lacM. Bei Verwendung von Acetosyringon und Syringaldehyd betrugen die Entfärbungsausbeuten nach 5 Stunden Reaktion 25 Prozent bzw. 22 Prozent. p-Cumarsäure und Vanillin wurden jeweils als wirksame Mediatoren verwendet, sie konnten jedoch die Entfärbungsrate bei LMS unter Verwendung von Spitze nicht wirksam steigern. Dies kann durch die geringere Substratspezifität von lacM für p-Cumarsäure und Vanillin verursacht werden. Die Entfärbungsausbeuten nach 24-stündiger Reaktion von lacM mit p-Cumarsäure und Vanillin waren denen ähnlich, die mit lacT erhalten wurden. Dies weist darauf hin, dass die oxidierten Formen von p-Cumarsäure und Vanillin Melanin effizient entfärben können, obwohl ihre Oxidationsrate durch lacM viel geringer war als die durch lacT. Wenn lacM ohne Mediator während einer ausreichenden Reaktionszeit zur Melanin-Entfärbung verwendet wurde, betrug die Entfärbungsausbeute nach 24-stündiger Reaktion 5 Prozent. Die natürlichen Mediatoren, mit Ausnahme von Vanillinsäure, wirken nach 24-stündiger Reaktion auch als effizientere Mediatoren als HOBt für die Melanin-Entfärbung durch lacM. Wenn Acetosyringon, Syringaldehyd und Acetovanillon als Mediatoren für lacM verwendet wurden, betrugen die Entfärbungsausbeuten nach 24-stündiger Reaktion 34 Prozent, 28 Prozent bzw. 31 Prozent. Wenn Vanillinsäure als Mediator sowohl für lacT als auch für lacM verwendet wurde, zeigte sie die niedrigste Entfärbungsausbeute. Dies kann durch die geringe Stabilität der oxidierten Radikalform der Vanillinsäure verursacht werden. Khammuang und Sarnthima berichteten, dass Vanillin und Vanillinsäure als Mediatoren für die Melaninentfärbung unter Verwendung von Laccase aus Lentinus polycarpous verwendet werden könnten [28]. Allerdings zeigten sie eine viel geringere Entfärbungsaktivität für Melanin als Acetosyringon, wenn sie als Mediatoren für LacT und Lace verwendet wurden.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass natürliche Mediatoren bei der Melaninentfärbung durch LMS wirksamer sind als HOBt. HOBt gilt aufgrund seines hohen Redoxpotentials und der katalytischen Rolle der NOH-Gruppe von HOBt als effizienter Synthesemediator für Laccase [5]. Die Effizienz von Mediatoren bei der Oxidation von Zielsubstraten hängt in hohem Maße von der Fähigkeit zur Bildung stabiler Radikale sowie der sterischen Hinderung durch sperrige Alkylsubstituenten ab und nicht vom Redoxpotential der Mediatoren [19,35]. Die geringe Stabilität des oxidierten Zwischenprodukts von HOBt wurde durch Cyclovoltammetrie bestimmt [6]. Daher kann die geringe Entfärbungsausbeute durch LMS unter Verwendung von HOBt auf die geringe Stabilität von HOBt unter den Reaktionsbedingungen von Laccase zurückzuführen sein. Obwohl das Redoxpotential von Syringaldehyd niedriger war als das von HOBt, zeigte Syringaldehyd eine relativ höhere Stabilität als HOBt [6].

Wie in Abbildung 2 dargestellt, weisen die in dieser Arbeit verwendeten natürlichen Mediatoren verschiedene Substituenten (z. B. Hydroxyl, Methoxy, Carboxyl, Keton oder Aldehyd) an unterschiedlichen Positionen am Benzolring auf [12,19]. Mediatoren mit zwei Methoxygruppen (Acetosyringon und Syringaldehyd) zeigten höhere Entfärbungsraten als solche mit einer Methoxygruppe. Die durch p-Cumarsäure ohne Methoxygruppe erzielte Entfärbungsrate hing von der Art der Laccase ab. Die p-Cumarsäure mit lacT zeigte eine höhere Entfärbungsrate als diejenigen mit einer Methoxygruppe, während p-Cumarsäure mit lacM die niedrigste Entfärbungsrate in der 5-Stunden-Reaktion zeigte. Fillat et al. zeigten ähnliche Ergebnisse auch für die Entfärbung von Flexodruckfarben durch Pilzlaccasen mit natürlichen Mediatoren [36]. Die phenolischen natürlichen Mediatoren (Acetosyringon, Methylspritze und Syringaldehyd) mit zwei Methoxysubstituenten im Ring wurden durch Laccase schneller oxidiert als p-Cumarsäure ohne Methoxygruppe. Dies deutet darauf hin, dass Methoxygruppen als Elektronendonoren eine wichtigere Rolle spielen als die Doppelbindung der Seitenkette der p-Cumarsäure. Beim Vergleich der Mediatoren mit einer Methoxygruppe stieg die Entfärbungsausbeute in der folgenden Reihenfolge: Acetovanillon > Vanillin > Vanillylalkohol > Vanillinsäure. Acetovanillon, das über eine Ketongruppe verfügt, zeigte eine höhere Entfärbungsrate und Ausbeute als die Mediatoren mit Aldehyd-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen. Acetosyringon mit einer Ketongruppe zeigte auch eine höhere Entfärbungsrate und Ausbeute als Syringaldehyd mit einer Aldehydgruppe.

In den folgenden Experimenten wurden Acetosyringon, Syringaldehyd und Acetovanillon, die eine hohe Fähigkeit zur Melaninentfärbung zeigten, als Mediatoren für LMS zur Entfärbung von Melanin ausgewählt. Die Wirkung des Mediators auf die Entfärbungsreaktion durch LMS wurde im Zeitverlauf untersucht (Abbildung S1). Die Entfärbungsreaktion unter Verwendung von lacT mit Acetosyringon, Syringaldehyd und Acetovanillon führte zu einer Entfärbungsausbeute von 21 Prozent, 18 Prozent bzw. 1 Prozent nach 1 Stunde Reaktion. Die Entfärbungsreaktion unter Verwendung von lacM mit Acetosyringon und Syringaldehyd führte zu einer Entfärbungsausbeute von 19 Prozent bzw. 18 Prozent nach einer Stunde Reaktion. Bei Verwendung des gleichen Mediators zeigten beide Laccasen ähnliche Reaktionsprofile. Acetosyringon und Syringaldehyd steigerten die Entfärbungsrate während der ersten Reaktion deutlich. Diese Ergebnisse zeigen, dass Acetosyringon und Syringaldehyd mit Dimethoxygruppen die anfängliche Entfärbungsrate durch LMS wirksamer steigerten als Acetovanillon mit einer Methoxygruppe. Fillat et al. berichteten auch, dass die Methoxygruppen in den Ringstrukturen von Mediatoren als Beschleuniger für die Oxidation von Substraten wirken [36]. Andererseits war die Entfärbungsausbeute nach 24-stündiger Reaktion durch Acetovanillon ähnlich der durch Syringaldehyd, obwohl Acetovanillon die Reaktionsgeschwindigkeit moderat steigerte.

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