Abstrakt:Es wurde berichtet, dass die Wurzeln von Vitis amurensis durch die Bewertung der Melanogenese und Tyrosinase-hemmenden Aktivitäten das Potenzial haben, die Haut aufzuhellen. In dieser Studie wurden V. amurensis-Wurzeln verwendet, um mithilfe von LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Tyrosinase-Hemmungstest schnell aufhellende Inhaltsstoffe auszuwählen und den Extraktionsprozess für die Verwendung als hautaufhellendes Funktionsmaterial durch die Response-Surface-Methode zu optimieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wurzeln von V. amurensis Tyrosinase-hemmende Wirkungen durch zwei Stilben-Oligomere, ε-Vinifera (1) und Vitamin B (2), zeigten, wie durch LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Bioassay vorhergesagt. Die optimalen Extraktionsbedingungen (Methanolkonzentration 66 Prozent, Lösungsmittelvolumen 140 ml und Extraktionszeit 100 Minuten) für hautaufhellende Inhaltsstoffe wurden mit einer Ausbeute von 6,20 Prozent ermittelt, und die Tyrosinase-Hemmaktivität betrug 87,27 Prozent. Die Beziehung zwischen jedem Faktor und seiner entsprechenden Reaktion wurde durch die Korrelationsanalyse von Pearson bestätigt. Das Lösungsmittelvolumen zeigte einen klaren linearen Zusammenhang mit den Ausbeuten, und die Methanolkonzentration hatte einen starken linearen Zusammenhang mit der Tyrosinase-Hemmaktivität für die Verbindungen 1 und 2 sowie deren Kombination. Insgesamt wurde nachgewiesen, dass LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Bioassay das Potenzial hat, sowohl neue aktive Bestandteile als auch bekannte aktive Bestandteile effektiv zu finden; Vitamine können als neues natürliches potenzielles Bleichmittel vorgeschlagen werden.

Laut einschlägigen StudienCistancheist ein weit verbreitetes Kraut, das als „Wunderkraut, das das Leben verlängert“ bekannt ist. Sein Hauptbestandteil istCistanosid, was verschiedene Auswirkungen hat, wie zAntioxidans, Antiphlogistikum, UndFörderung der Immunfunktion. Der Mechanismus zwischen Cistanche undHautaufhellungliegt in der antioxidativen Wirkung von CistancheGlykoside. Melanin in der menschlichen Haut entsteht durch die katalysierte Oxidation von TyrosinTyrosinaseDa die Oxidationsreaktion die Beteiligung von Sauerstoff erfordert, werden die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthältCistanosid, das ein Antioxidans ist und die Entstehung freier Radikale im Körper reduzieren und so die Melaninproduktion hemmen kann.

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Schlüsselwörter:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS gekoppelt mit Tyrosinase-Hemmtest; Antwortoberflächenmethodik; Pearson-Korrelation

1. Einleitung

Melanin ist für die Farbe der Haut und Haare von Säugetieren verantwortlich und schützt die Haut vor ultravioletten Strahlen. Eine übermäßige Melaninproduktion und Ansammlung von Melanin in der Haut führt jedoch zu hyperpigmentierten Hauterkrankungen wie Sommersprossen, Melasma, Altersflecken, Epheliden und senilen Lentigines. Tyrosinase, bekannt als kupferhaltiges Oxidase-Enzym, spielt eine entscheidende Rolle bei der Melanin-Biosynthese. Das Enzym katalysierte zwei aufeinanderfolgende Oxidationsreaktionen: Der erste Schritt, die Hydroxylierung von L-Tyrosin zu 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA), und der zweite Schritt, die Oxidation von L-DOPA zu Dopaquinon. Dopaquinon ist eine hochreaktive Substanz, die spontan zu Melanin polymerisieren kann [1–3]. Daher können Tyrosinasehemmer zur Behandlung hyperpigmentierungsbedingter Hauterkrankungen und als Hautaufheller eingesetzt werden.

Vitis amurensis, eine wild wachsende Rebsorte, ist hauptsächlich in Asien (Korea, China und Japan) verbreitet. Vollreife Früchte werden roh verzehrt und enthalten reichlich Nährstoffe wie Saccharose, Glukose, Eiweiß und Vitamine, weshalb sie als Material für Wein, Saft, Gelees und Marmelade verwendet werden. Darüber hinaus werden seine Blätter in einem Salat verwendet [4]. Seine Wurzeln und Stängel werden als traditionelle Medizin zur Behandlung von Krebs, neuralgischen Schmerzen und Bauchschmerzen eingesetzt [5,6]. Seine Wurzeln bestehen aus Stilbenen (einem Hauptbestandteil), Procyanidinen, Flavonoiden, Triterpenoiden und anderen phenolischen Verbindungen. Bisher wurde die chemische Zusammensetzung der Wurzel hinreichend detailliert untersucht. Insbesondere wurde über verschiedene Stilben-Oligomere berichtet, darunter Resveratrol, Amurensin A, Vitamin A, (plus)-ε-vinifera, Amurensine C–M, Ampelopsin A, D und Ampelopsin E [6]. Der methanolische Extrakt der Wurzel zeigt eine antimelanogene Wirkung gegen die durch das Melanozyten-stimulierende Hormon induzierte Melanogenese in B16F10-Zellen und bei der 3,{13}}Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)-Oxidation über Pilztyrosinase [7]. Darüber hinaus weisen V. amurensis-Extrakte und ihre Wirkstoffe antioxidative, entzündungshemmende, neuroprotektive und antitumorogene Wirkungen auf [7–10].

LC-MS in Kombination mit einem Bioassay kann gleichzeitig das chemische Profil und die biologische Aktivität von Bestandteilen in Naturprodukten bestätigen, ohne dass eine Extraktion und Isolierung erforderlich ist. Daher wird es kürzlich zur effizienten und schnellen Identifizierung bioaktiver Verbindungen in Naturprodukten eingesetzt [11–13].

Optimierung ist ein Prozess, der die maximale Effizienz experimenteller Systeme oder Produkte ermöglicht. Response Surface Methodology (RSM), multivariate Analyse, Versuchsplanung mit mathematischen und statistischen Techniken auf der Grundlage empirischer Modelle und die Darstellung der Korrelation zwischen Versuchsplanung und Ergebnissen als Polynomfunktion sind einige Techniken, die ideale Optimierungsbedingungen mit maximaler Effizienz bieten. RSM ist eine genaue und effiziente Optimierungsmethode, die in verschiedenen Bereichen weit verbreitet ist, darunter Lebensmittelverarbeitung, Chemie, Biologie und Landwirtschaft [14–16]. In den letzten Jahrzehnten ist das Interesse an Arzneimitteln, Kosmetika und funktionellen Lebensmitteln mit Naturprodukten gestiegen; Daher gibt es sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie laufende Forschungsarbeiten, die auf die Entwicklung solcher Produkte abzielen [17,18]. Der erste Schritt dieser Studien umfasst die Extraktion des bioaktiven Bestandteils aus Naturprodukten. Da derzeit zahlreiche Faktoren wie Extraktionszeit, Temperatur, Flüssigkeits-Feststoff-Verhältnis und Lösungsmittelvolumen die extrahierten Bestandteile beeinflussen, ist eine Optimierung zur maximalen Extraktion der bioaktiven Bestandteile erforderlich.

Nach unserem Kenntnisstand wurde selten über Tyrosinase-hemmende Bestandteile und eine Optimierung der Extrakte aus V. amurensis-Wurzeln berichtet [5,19]. Ziel dieser Studie war es daher, den Tyrosinase-Inhibitor aus den Wurzeln von V. amurensis mithilfe von LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Tyrosinase-Inhibitor-Assay schnell zu gewinnen und die Extraktionsbedingungen zu optimieren, um die Verwendung der Wurzeln von V. amurensis als Hautaufhellungsmittel zu erweitern von RSM.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. LC-QTOF-MS gekoppelt mit einem Tyrosinase-Hemmtest unter Verwendung des Wurzelextrakts von V. amurensis

Der 80-Prozent-MeOH-Extrakt der V. amurensis-Wurzel zeigte eine signifikante Tyrosinase-Hemmaktivität (80,7 ± 0,8 Prozent bei 50 µg/ml, Tabelle S1). Um die Tyrosinase-hemmenden Verbindungen in der Wurzel von V. amurensis ohne Isolierung zu identifizieren, wurde LC-QTOF-MS gekoppelt mit einem Tyrosinase-hemmenden Assay durchgeführt. Das chemische Profil des V. amurensis-Wurzelextrakts wurde im ersten Durchlauf ermittelt (Abbildung S1) und die bioaktiven Verbindungen wurden mithilfe eines Tyrosinase-Inhibitionstests von Fraktionen identifiziert, die ab dem zweiten Durchlauf alle 30 s gesammelt wurden (Abbildung 1). Es gab zwei Peaks zwischen 19 und 22 Minuten im Massenchromatogramm, von denen vorhergesagt wurde, dass sie eine signifikante Tyrosinase-Hemmaktivität aufweisen, und ihre Strukturen wurden mithilfe chemischer Profilierung als Stilben-Dimer (1) und Stilben-Tetramer (2) identifiziert (Tabelle 1).

2.2. Identifizierung von Tyrosinase-hemmenden Bestandteilen der Wurzel von V. amurensis

Zunächst wurden aus der EtOAc-Fraktion zwei Bestandteile isoliert, von denen erwartet wurde, dass sie eine Tyrosinase-hemmende Aktivität aufweisen, und ihre Bioaktivität wurde bewertet. Die Strukturen der isolierten Verbindungen 1 und 2 wurden mittels 1H-NMR, 13C-NMR und als ε-vinifera (1) [20,21] bzw. Vitamin B (-vinifera, 2) [21–23] identifiziert ESI-MS (Abbildung 2, Abbildungen S2 und S3 und Tabelle S2). Im Tyrosinase-Hemmtest betrugen die IC50-Werte der Verbindungen 1, 2 und Kojisäure 3,51, 10,74 bzw. 27,09 µM. Beide Verbindungen zeigten eine stärkere Tyrosinase-hemmende Wirkung als die Positivkontrolle, Kojisäure, der bekannte hautaufhellende Bestandteil (Tabelle 1 und Abbildung S4). In früheren Studien wurde berichtet, dass ε-vinifera (1) eine Tyrosinase-hemmende Aktivität aufweist [23]; Vitamin B (2) wurde jedoch erstmals in unserer Studie identifiziert.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, korreliert mit den vorhergesagten Daten der LC-MS in Verbindung mit einem Tyrosinase-Hemmtest und Vitamin B (2), Potenzial als neuer Tyrosinase-Hemmer. Darüber hinaus wurden molekulare Docking-Studien durchgeführt, um das Ergebnis der signifikanten Tyrosinase-hemmenden Aktivität der beiden Stilben-Oligomere zu untermauern. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten die Verbindungen 1 und 2 einen höheren Docking-Score als die Positivkontrolle, Kojisäure, was mit unseren experimentellen Daten übereinstimmt. Die Andockergebnisse der Verbindungen standen jedoch im Widerspruch zu unseren experimentellen Ergebnissen. Die Wechselwirkungsmodi der Verbindungen 1 und 2 sind in Abbildung 3 beschrieben. Verbindung 1 bildete 4 Wasserstoffbrückenbindungen, 2 hydrophobe Wechselwirkungen und 1 Pi-Einzelpaar-Wechselwirkung, und Verbindung 2 bildete 11 Wasserstoffbrückenbindungen, 7 hydrophobe Wechselwirkungen und 1 Van-der-Waals-Wechselwirkung und 3 Pi-Einzelpaar-Wechselwirkungen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass Verbindungen in das aktive Zentrum des Zielproteins eingefügt werden können und an katalytische Aminosäurereste binden, die die Tyrosinaseaktivität hemmen können. Darüber hinaus wird berichtet, dass ε-vinifera (1) ein kompetitiver Inhibitor ist, der an dieselbe Stelle bindet, an der L-DOPA an Tyrosinase bindet [23]. Es wurde beobachtet, dass Vitamin B (2) an dieselbe Stelle bindet wie ε-vinifera (1), was bestätigte, dass Vitamin B (2) ein neuer kompetitiver Inhibitor ist.

2.3. Optimierung der Wurzelextraktion von V. amurensis mittels RSM

Um die Wurzeln von V. amurensis als hautaufhellendes Funktionsmaterial zu nutzen, wurden die optimalen Extraktionsbedingungen durch das Box-Behnken-Design (BBD) entwickelt, um die Extraktionsausbeute und die Tyrosinase-Hemmaktivität zu maximieren. Die Auswirkungen unabhängiger Reaktionen wie Extraktionsausbeute, Tyrosinase-Hemmaktivität, Menge an Verbindung 1, Menge an Verbindung 2 und Menge der Summe der Verbindungen 1 und 2 auf die drei unabhängigen Variablen (Extraktionszeit, MeOH/Wasser-Konzentration usw.) Lösungsmittelvolumen) gemessen (Tabelle 2). Der Variablenbereich wurde als Extraktionszeit (40, 70 und 100 Min.), MeOH-Konzentration (40, 70 und 100 Prozent) und Lösungsmittelvolumen ( 35, 87,5 und 140 ml) basierend auf einem vorläufigen Einzelfaktorexperiment (Daten nicht gezeigt). Die aus den geplanten Experimenten erhaltenen Werte wurden mithilfe einer Regressionsanalyse als Polynome der Korrelationen zwischen Variablen ausgedrückt (Tabellen S4–S13 und Abbildung S5). Als Ergebnis der Durchführung einer individuellen Optimierung für jede Reaktion (Tabelle 3) wurde erwartet, dass die Ausbeute 6,21 Prozent beträgt, wenn sie mit 100.00 min, MeOH 64,78 Prozent, 140.{42} extrahiert wird. } ml. Die Tyrosinase-hemmende Aktivität (Prozent) wurde mit 65,22 Minuten, MeOH 100.00 Prozent, 140,{51}} ml-Bedingungen extrahiert und es wurde ein Wert von 90,37 Prozent vorhergesagt. Die Menge von Verbindung 1 bei 65,74 Minuten, MeOH 100.00 Prozent, 35,00 ml, wurde mit 37,45 µg/mg vorhergesagt, und die Menge von Verbindung 2 bei 70,00 Minuten, MeOH 70,00 Prozent, und 92,24 Für ml wurde ein Wert von 86,77 µg/mg vorhergesagt. Darüber hinaus wurde erwartet, dass der Gesamtgehalt der Verbindungen 1 und 2 einen Maximalwert von 108,10 µg/mg aufwies, wenn er unter Bedingungen von 75,20 Minuten, MeOH 100,00 Prozent und 35,00 ml extrahiert wurde. Experimente unter optimierten Bedingungen ergaben 6,19 ± 0,36 Prozent, eine Tyrosinase-Hemmaktivität 91,72 ± 3,48 Prozent, einen Gehalt an Verbindung 1 von 36,54 ± 1,78 µg/mg, einen Gehalt an Verbindung 2 von 85,74 ± 16,57 µg/mg und die Summe der Verbindungen 1 und {{85} },10 ± 19,11 µg/mg wurden erhalten, und die einzelnen Antworten für jede Variable wiesen eine Differenz von 5 Prozent oder weniger von den theoretisch vorhergesagten Werten auf. Eine Optimierung der Mehrfachreaktion wurde durchgeführt, um die Extraktionsausbeute und die Tyrosinase-Hemmaktivität zu maximieren (Tabelle 3). Die optimierten Bedingungen waren wie folgt: Extraktionszeit 100 Minuten; MeOH-Konzentration: 66,38 Prozent; und Lösungsmittelvolumen: 140 ml. Unter diesen Bedingungen wurde eine Ausbeute von 5,95 ± 1,13 Prozent und eine Tyrosinase-Hemmaktivität von 85,93 ± 1,57 Prozent ermittelt. Diese Werte entsprachen den vorhergesagten Werten von 6,20 bzw. 87,25 Prozent. Zusätzlich wurde die Korrelation zwischen jeder Variablen und der entsprechenden Antwort mithilfe der Pearson-Korrelation analysiert (Tabelle 4). Die Extraktionsausbeute zeigte eine klare lineare Beziehung zwischen der Extraktionszeit und der MeOH-Konzentration und eine negative lineare Beziehung zur Menge der Verbindung 1. Darüber hinaus zeigte die Tyrosinase-Hemmaktivität eine starke lineare Beziehung zwischen der Menge der Verbindung 2 und der Menge der Summe der Verbindungen 1 und 2 und eine klare lineare Beziehung zu Verbindung 1. Daher war die Tyrosinase-Hemmaktivität der V. amurensis-Wurzel proportional zu beiden Verbindungen 1 und 2, zeigte jedoch eine stärkere lineare Beziehung zur Menge von Verbindung 2 als zu Verbindung 1.

3. Materialien und Methoden

3.1. Allgemeine experimentelle Verfahren

Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (MPLC) wurde unter Verwendung einer Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Ein System ist mit einer Hochleistungs-Flash-Chromatographie-Pumpe (HPFC), einem variablen Dual-Wellenlängen-Detektor und einem Kollektor ausgestattet. NMR-Spektren wurden mit einem Bruker SPECTROSPIN 300 MHz-Spektrometer (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) aufgenommen. Methanol-d4, ein NMR-Lösungsmittel, wurde von Cambridge Isotope Laboratories, Inc. bezogen. Acetonitril (ACN), Wasser und Methanol (MeOH) in chromatographischer Qualität wurden von ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Republik Korea) bezogen. L-Tyrosin, Pilztyrosinase, Kojisäure und Ameisensäure wurden von Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA) bezogen.

3.2. Pflanzenmaterial

Die Wurzel von V. amurensis wurde aus Gyeongbuk, Korea, bezogen und auch von Omniherb (Daegu, Republik Korea) gekauft. Sie wurden von Dr. Prof. Ki Yong Lee vom College of Pharmacy der Korea University identifiziert. Ein Belegexemplar (KUP-HD071) wurde im Labor für Pharmakognosie des College of Pharmacy der Korea University hinterlegt.

3.3. LC-Q-TOF-Massenspektrometrie

Die LC wurde unter Verwendung einer Agilent 1260-Serie (Agilent, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt, die eine binäre Pumpe, einen Online-Entgaser, einen automatischen Probengeber, einen thermostatisch gesteuerten Säulenraum und einen Photodiodenarray-Detektor umfasste. Die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Shiseido CapCell PAK C18-Säule (5 µm, 4,6 mm, ID × 15 0 nm) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus Wasser (Lösungsmittel A) und ACN (Lösungsmittel B), die beide 0,1 Prozent Ameisensäure enthielten. Die Gradientenbedingungen waren wie folgt: 0–5 Min., 10 Prozent B, 5–30 Min. und linearer Anstieg von B von 10 auf 90 Prozent. Die Fellow-Rate wurde auf 0,6 ml/min eingestellt; 5 µL bzw. 20 µL der Proben wurden für die LC-Q-TOF-MS-Analyse bzw. LC-Q-TOF-MS gekoppelt mit Tyrosinase-Hemmungstest injiziert. Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines Agilent 6530 Q-TOF-Massenspektrometers (Agilent, Santa Clara, CA, USA) mit einer Elektrospray-Ionisationsschnittstelle (ESI) im negativen Modus durchgeführt. Daten mit einem Massenbereich von m/z 50–1000 wurden im Schwerpunktmodus erfasst. Die Massenparameter waren wie folgt: Kapillarspannung, 4000 V; Verneblerdruck: 40 psi; Splitterspannung, 175 V; Skimmerspannung, 65 V; Trocknungsgastemperatur, 325 ◦C; Mittrocknungsgasrate: 12,0 l/min; Kollisionsenergie 10, 20, 30 und 40 eV. Die Anpassung der Aufnahmeparameter und die Datenverarbeitung wurden mittels LC-MS/MS-Datenerfassung unter Verwendung von Q-TOF der Serie 6530 (Version B.05.00) (MassHunter Workstation-Software, Agilent, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt.

3.4. LC-Q-TOF-MS gekoppelt mit einem Tyrosinase-Hemmtest

LC-Q-TOF-MS gekoppelt mit einem Tyrosinase-Hemmtest wurde unter Verwendung der in der vorherigen Studie etablierten Methode durchgeführt [24]. Kurz gesagt, der Test erfolgte in zwei Durchläufen. Im ersten Durchgang wurde das chemische Profil der Probe mittels LC-Q-TOF-MS ermittelt. Im nächsten Lauf wurde das Eluat nach dem Durchlaufen des LC-Systems unter den angegebenen LC-Q-TOF-Bedingungen alle 30 s in 96-Well-Platten gesammelt. Die Tyrosinase-hemmende Aktivität der gesammelten Fraktionen wurde unter Verwendung eines Tyrosinase-hemmenden Tests bewertet.

3.5. Isolierung von Tyrosinase-inhibitorischen Verbindungen aus der Wurzel von V. amurensis

Zur Isolierung von Tyrosinase-inhibitorischen Verbindungen, die mithilfe von LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit dem Tyrosinase-Inhibitor-Assay identifiziert wurden, wurde die Wurzel von V. amurensis (3,01 kg) dreimal mit 80 Prozent extrahiert MeOH für 60 Min. bei Raumtemperatur unter Verwendung von Ultraschall. Das extrahierte Lösungsmittel wurde filtriert und konzentriert, um einen Rohextrakt (215,7 g) zu erhalten, der in Wasser suspendiert und nacheinander mit n-Hexan, Ethylacetat (EtOAc) und n-BuOH verteilt wurde. Die EtOAc-Fraktion (25,85 g) wurde einer Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von n-Hexan:EtOAc unter Gradientenbedingungen (20:1 → 0:1) unterzogen, um sieben Fraktionen (E1–E7) zu ergeben. Fraktion E4 wurde mittels MPLC und 100 g SNAP KP-Sil, einer Kieselgelkartusche und Dichlormethan:MeOH unter Gradientenbedingungen (97:3 → 0:100) getrennt, um sieben Unterfraktionen (E4–1 bis E4–7) zu ergeben. . Verbindung 2 (417,0 mg) wurde aus E4–5 erhalten. Die Unterfraktion E4–4 wurde auf MPLC unter Verwendung von SNAP 25 g Ultra, einer Kieselgelkartusche und Chloroform:MeOH:H2O unter Gradientenbedingungen (50:4:1 → 15:4:1) erneut chromatographiert, um sieben Fraktionen zu ergeben ( E4–4–1 bis E4–4–7). Verbindung 1 (396,0 mg) wurde aus E4–4–5 erhalten, die als einzelner Fleck auf einer Dünnschichtchromatographieplatte (TLC) beobachtet wurde.

3.6. Tyrosinase-Hemmtest

Die Tyrosinase-hemmende Aktivität wurde mit einer zuvor beschriebenen Methode mit geringfügiger Modifikation bewertet [25]. Die zwei Mikroliter Probe und 50 µL 0,1 U/µL Pilztyrosinase wurden in 96-Well-Platten behandelt und bei 37 ◦C inkubiert. Nach 15 Minuten wurden 5 0 µL 1 mM L-Tyrosin hinzugefügt und dann 15 Minuten lang bei 37 °C umgesetzt. Die Menge an gebildetem Dopachrom wurde bei 495 nm mit einem Spectra Max 19{{20}}-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) gemessen. Die Tyrosinase-Hemmaktivität wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Tyrosinase-Hemmung (Prozent)=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, wobei S die Absorption von Probe, Tyrosinase und L ist -Tyrosin; S0 ist die Absorption der Probe und des L-Tyrosins; C ist die Absorption von Tyrosinase und L-Tyrosin und C0 ist die Absorption von L-Tyrosin. Als Positivkontrolle wurde Kojisäure, ein bekannter Tyrosinase-Inhibitor, verwendet. Die IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) berechnet.

3.7. Molekulare Docking-Studien

Das molekulare Andocken wurde unter Verwendung der Software SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) mit Kristallstrukturen von PPO3, einer Tyrosinase aus Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W), durchgeführt. Alle Wassermoleküle des Zielproteins wurden entfernt und die Ligandenvorbereitung erfolgte nach dem „Sanitize“-Vorbereitungsprotokoll in SYBYL-X 2.1.1. Die Protein-Ligand-Affinität wurde mit dem Tripos-Kraftfeld berechnet und als Gesamtpunktzahl ausgedrückt. Die angedockte Position des Liganden aus dem Protein-Ligand-Komplex wurde im Discovery Studio 2017 R2 Client-Programm (Biovia Co., San Diego, CA, USA) visualisiert.

3.8. Experimentelles Design und statistische Analyse

Mithilfe der BBD mit drei Variablen und drei Ebenen (MINITAB Release 14.12.0 Statistical Software) wurde eine optimierte Bedingung für die Extraktion von Bestandteilen mit maximaler Tyrosinase-Hemmaktivität aus der Wurzel von V. amurensis erstellt. Basierend auf den vorläufigen Ergebnissen des Einzelfaktor-Experiments wurden die unabhängigen Variablen einschließlich Extraktionszeit (X1), MeOH- und Wasserkonzentration (X2) und Flüssigkeitsvolumen (X3) sowie eine Reihe ihrer Variablen ausgewählt (Tabelle S3). Die Variablen für RSM wurden unter Verwendung der drei Ebenen −1, 0 und 1 codiert. Insgesamt wurden 15 Experimente entworfen, darunter 3 Replikate im Zentrum des Designs (Tabelle 2). Als unabhängige Antworten wurden Ausbeute (Prozent), Tyrosinase-Hemmaktivität (Prozent), die Menge an Verbindung (1) (µg/mg) und die Menge an Verbindung (2) (µg/mg) gemessen. Die Tyrosinase-hemmende Aktivität des Extrakts wurde bei einer Konzentration von 50 µg/ml bewertet. Jede Antwort wird mithilfe der folgenden Polynomgleichung zweiter Ordnung ausgedrückt:

wobei R die Antwort bezeichnet; 1, 2 und 3 sind die linearen Koeffizienten; 12, 23 und 13 sind die Interaktionskoeffizienten zwischen drei Variablen; und 11, 22 und 33 sind die quadratischen Koeffizienten.
Darüber hinaus wurde die Korrelationsanalyse nach Pearson durchgeführt, um das Vorhandensein einer linearen Beziehung zwischen jeder Variablen und der Reaktion festzustellen. Der Korrelationskoeffizient von Pearson hat eine starke lineare Beziehung zwischen {{0}}.7 und 1.0, eine klare lineare Beziehung zwischen 0.3 und 0.7, eine schwache lineare Beziehung zwischen {{10}}.1 und 0.3 und keine oder eine vernachlässigbare lineare Beziehung zwischen 0.0 und 0,1. Die positive und negative Korrelation wird abhängig davon ausgedrückt, ob der Korrelationskoeffizient nach Pearson positiv oder negativ ist.

3.9. Quantitative Analyse der Tyrosinase-inhibitorischen Verbindungen 1 und 2

Die Menge jeder Verbindung 1 und 2 in Extrakten, die unter den vorgesehenen 15 Versuchsbedingungen erhalten wurden, wurde mithilfe der Kalibrierungskurven gemessen (Tabelle 2). Die Kalibrierungskurven für die Verbindungen 1 und 2 wurden anhand der Fläche unter der UV-Chromatogrammkurve (33 0 nm, erfasst bei Konzentrationen von 0,1–1000 µg/ml bzw. 7,81–1000 µg/ml) bestimmt. Die LC wurde unter Verwendung eines Waters 2695 LC-Systems (Waters, Santa Clara, CA, USA) unter den gleichen Bedingungen wie für das LC-System durchgeführt, das in Materialien und Methoden, LC-Q-TOF-Massenspektrometrie, beschrieben ist.

4. Schlussfolgerung

ε-Viniferin (1) und Vitamin B (2) aus V. amurensis-Wurzeln wurden mittels LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Tyrosinase-Hemmtest als hautaufhellende Bestandteile charakterisiert. Insbesondere Vitamin B (2) wurde in dieser Studie erstmals als Tyrosinase-hemmende Verbindung identifiziert und ε-Vinifera (1) und Vitamin B (2) zeigten eine stärkere Tyrosinase-hemmende Wirkung als die Positivkontrolle, Kojisäure. Die Optimierungsbedingungen mit maximaler Tyrosinase-Hemmwirkung und maximalem Ertrag an V. amurensis-Wurzeln wurden anhand der Extraktionszeit (100 Minuten), der MeOH-Konzentration (66,38 Prozent) und des Flüssigkeitsvolumens (140 ml) ermittelt. Das Ergebnis zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen experimentellen und vorhergesagten Werten. Folglich hat LC-Q-TOF-MS in Verbindung mit einem Bioassay das Potenzial bewiesen, neben den bekannten aktiven Bestandteilen Vitamin B (2), die als neuer natürlicher potenzieller Aufheller vorgeschlagen werden können, effektiv neue aktive Bestandteile zu finden.

Zusatzmaterialien: Folgendes ist online verfügbar, Abbildung S1: MS-Chromatogramm im negativen Ionisationsmodus (A); UV-Chromatogramm bei 280 nm (B) von Extrakten aus V. amurensis-Wurzeln, Abbildung S2: 1H- und 13C-NMR-Spektren von Verbindung 1 (300 und 75 MHz, CD3OD), Abbildung S3: 1H- und 13C-NMR-Spektren der Verbindung 2 (300 und 75 MHz, CD3OD), Abbildung S4: Sigmoidaldiagramm und IC50 der Positivkontrolle, Verbindungen 1 und 2, Abbildung S5: Reaktionsoberflächen- und Konturdiagramme, die die Wirkung der Extraktionsparameter zeigen (X1: Extraktionszeit, min; X2: MeOH-Konzentration, Prozent; X3: Lösungsmittelvolumen, ml). (A) Ertrag; (B) Tyrosinase-hemmende Aktivität; (C) Verbindung 1; (D) Verbindung 2; (E) Summe der Verbindungen 1 und 2, Tabelle S1. Tyrosinase-hemmende Aktivität von Extrakten aus V. amurensis-Wurzeln, Tabelle S2: 1H- und 13C-NMR-Daten der Verbindungen 1 und 2 in CD3OD (δ in ppm), Tabelle S3: Unabhängige Variablen und Niveaus für die Reaktionsoberflächenmethodik, Tabelle S4: Geschätzte Regression Koeffizient für Ausbeute, Tabelle S5: Varianzanalyse für Ausbeute, Tabelle S6: Geschätzter Regressionskoeffizient für Tyrosinase-Hemmaktivität, Tabelle S7: Varianzanalyse für Tyrosinase-Hemmaktivität, Tabelle S8: Geschätzter Regressionskoeffizient für Verbindung 1, Tabelle S9: Analyse von Varianz für Verbindung 1, Tabelle S10: Geschätzter Regressionskoeffizient für Verbindung 2, Tabelle S11. Varianzanalyse für Verbindung 2, Tabelle S12: Geschätzter Regressionskoeffizient für die Summe der Verbindungen 1 und 2, Tabelle S13: Varianzanalyse für die Summe der Verbindungen 1 und 2.
Autorenbeiträge: Konzeptualisierung, KYL; Methodik, K.-EO, HS und KYL; Software, K.-EO und HS; Validierung, HS; Formale Analyse, K.-EO und HS; Untersuchung, K.-EO, HS, MKL und KYL; Datenkuration, K.-EO, HS, BP und KYL; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, K.-EO und HS; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, HS, MKL, BP und KYL; Aufsicht, MKL, BP und KYL Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.
Finanzierung: Diese Forschung wurde durch ein von der koreanischen Regierung finanziertes Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1A2B4003403 und NRF-2019R1A6A1A03031807) sowie durch ein Stipendium des Korea Health Technology R&D Project durch die Korea Health Industry Development unterstützt Institut (KHIDI), finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Soziales der Republik Korea (HF20C0038).
Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Die in dieser Studie präsentierten Daten sind im Zusatzmaterial verfügbar.
Interessenskonflikte:Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Probenverfügbarkeit: Nicht verfügbar

Verweise

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-Triazol-verknüpfte 5-Benzyliden(thio)barbiturate als neuartige Tyrosinaseinhibitoren und Radikalfänger. Bogen. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Identifizierung von 6, 7, 40 -Trihydroxyisoflflavon als wirksamem Tyrosinase-Inhibitor. Biowissenschaften. Biotechnologie. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Tyrosinase-Inhibitor aus schwarzer Reiskleie. J. Agrar. Lebensmittelchem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Lied, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Ein Überblick über Chemie und Pharmakologie. Phytomedizin 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Betulinsäure, isoliert aus der Wurzel von Vitis amurensis, hemmt die durch 3-Isobutyl-1--Methylxanthin induzierte Melanogenese über die Regulierung der MEK/ERK- und PI3K/Akt-Signalwege in B16F10-Zellen. Lebensmittelchem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, ich.; Hung, ND; Bae, K. Antioxidative und Lipoxygenase-hemmende Wirkung von Oligostilbenen aus den Blättern und Stängeln von Vitis amurensis. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht-Wurzel inhibierte die Melanozyten-stimulierende Hormon-induzierte Melanogenese in B16F10-Zellen. Nutr. Res. Üben. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Resveratrol-Oligomere aus Vitis amurensis schwächen Amyloid-induzierten oxidativen Stress in PC12-Zellen ab. Biol. Pharm. Stier. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Starke Hemmung des Lewis-Lungenkrebswachstums durch Hexanol A aus den Wurzeln von Vitis amurensis durch apoptotische und antiangiogene Aktivitäten. Karzinogen 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Entzündungshemmende Wirkung von Procyanidinen aus Samen wilder Weintrauben (Vitis amurensis) in LPS-induzierten RAW 264.7-Zellen. Oxid. Med. Zelle. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Identifizierung antioxidativer Bestandteile aus Polygonum aviculare mittels LC-MS gekoppelt mit DPPH-Assay. Nat. Prod. Wissenschaft. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, ich.; Park, B.; Lee, KY Charakterisierung hemmender Bestandteile der NO-Produktion aus Catalpa ovata mittels LC-MS gekoppelt mit einem zellbasierten Assay. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Höfte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit online gekoppelter UV-, massenspektrometrischer und biochemischer Detektion zur Identifizierung von Acetylcholinesterase-Inhibitoren aus Naturprodukten. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Response Surface Methodology (RSM) als Werkzeug zur Optimierung in der analytischen Chemie. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Anwendung der Reaktionsoberflächenmethodik und künstlicher neuronaler Netzwerkmethoden bei der Modellierung und Optimierung des Biosorptionsprozesses. Bioresour. Technol. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Experimentelles Design I. Screening. Trendanalyst. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sonnig.; Shi, L.; Xue, P. Optimierung der ultraschallunterstützten Extraktion durch Reaktionsoberflächenmethode, Antioxidationskapazität und Tyrosinase-hemmende Aktivität von Anthocyanen aus roter Reiskleie. Lebensmittelwissenschaft. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Gleichzeitige Optimierung der mikrowellenunterstützten Extraktion phenolischer Verbindungen und der antioxidativen Aktivität von Avocadosamen (Persea americana Mill.) mithilfe der Reaktionsoberflächenmethode. J. Anal. Methoden Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Trennung von fünf Oligostilbenen aus Vitis amurensis mittels Fellow-Rate-Gradient-Hochleistungs-Gegenstromchromatographie. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Entzündungshemmende Wirkung von Resveratrol und Oligostilbenen aus Vitis thunbergii var. Taiwaniana gegen Lipopolysaccharid-induzierte Arthritis. J. Agrar. Lebensmittelchem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polyphenole, isoliert aus Blättern von Vitis thunbergii var. Taiwaniana reguliert den APP-bezogenen Signalweg. Bioorg. Med. Chem. Lette. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Neuartige Oligostilbene aus Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Münsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Traubenrohrextrakte als multifunktionale verjüngende kosmetische Zutat: Bewertung der Sirtuin-Aktivität, der Tyrosinase-Hemmung und des Bioverfügbarkeitspotenzials. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Oh, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Charakterisierung von Tyrosinase-hemmenden Bestandteilen aus den oberirdischen Teilen von Humulus japonicus mittels LC-MS/MS-gekoppeltem Online-Assay. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Synthese und biologische Bewertung von Resveratrol-Derivaten als Melanogenese-Inhibitoren. Molecules 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

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