Langzeit-Follow-up der Mycoplasma Hyopneumoniae-spezifischen Immunität bei geimpften Schweinen

Abstrakt

Mycoplasma hypopnoe mobile ist der Haupterreger der enzootischen Pneumonie bei Schweinen. Um die durch diese Krankheit verursachten wirtschaftlichen Verluste zu minimieren, wird häufig eine mobile Impfung gegen M. hypopnoe durchgeführt. Das Fortbestehen der durch den M. hyopneumoniae-Impfstoff hervorgerufenen Immunität, insbesondere der zellvermittelten Immunität, bis zum Zeitpunkt der Schlachtung wurde jedoch noch nicht untersucht. Daher erhielten in zwei kommerziellen Betrieben 25 Schweine (n=50) im Alter von 16 Tagen intramuskulär ein kommerzielles Bakterin. Jeden Monat wurde das Vorhandensein von M. hyopneumoniae-spezifischen Serumantikörpern analysiert und die Proliferation von TNF-, IFN- und IL-17A-Produktion durch verschiedene T-Zell-Untergruppen im Blut mithilfe von Recall-Assays bewertet. In beiden Betrieben wurde eine natürliche Infektion mit M. hyopneumoniae angenommen. Allerdings blieben die untersuchten Schweine fast während des gesamten Versuchs negativ auf M. hyopneumoniae. Nach der Impfung wurde keine Serokonversion beobachtet und alle Schweine wurden im Alter von zwei Monaten seronegativ. Die Kinetik der Häufigkeiten der T-Zell-Untergruppen war in beiden Betrieben ähnlich. Mycoplasma hypopnoe mobile-spezifische Zytokin-produzierende CD4+CD8+-T-Zellen wurden im Blut von Schweinen aus beiden Betrieben im Alter von einem Monat gefunden, nahmen jedoch mit zunehmendem Alter deutlich ab. Andererseits wurde eine T-Zell-Proliferation nach in vitro M. hyopneumoniae-Stimulation bis zum Ende der Mastperiode beobachtet. Darüber hinaus wurden nach der M. hyopneumoniae-Impfung keine Unterschiede in der humoralen und zellvermittelten Immunantwort zwischen Schweinen mit und ohne maternale Antikörper beobachtet. Diese Studie dokumentiert die langfristigen, durch den M. hypopnoe-Mobilimpfstoff induzierten Immunantworten bei Mastschweinen unter Feldbedingungen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Einfluss einer natürlichen Infektion auf diese Reaktionen zu untersuchen.

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Schlüsselwörter

Mycoplasma hyopneumoniae, Schweine, Längsschnittstudie, impfstoffinduzierte Immunität, zellvermittelte Immunität

Einführung

Einer der wichtigsten Atemwegserreger bei Schweinen ist Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae). Es ist der Haupterreger der enzootischen Pneumonie, die in den meisten Betrieben endemisch vorkommt und weltweit für erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Schweineproduktion verantwortlich ist [1, 2]. Die Impfung ist die am häufigsten eingesetzte Managementmethode zur Bekämpfung von M. hyopneumoniae, da sie die klinischen Symptome und Leistungsverluste minimieren und die Behandlungskosten senken kann [3]. Das Ziel der M. hyopneumoniae-Impfung besteht darin, erregerspezifische Immunantworten auszulösen, die schnell und effektiv auf eine natürliche M. hyopneumoniae-Infektion reagieren. Die meisten im Handel erhältlichen M. hyopneumoniae-Impfstoffe für Schweine sind für die Verabreichung im Alter zwischen einer und drei Wochen zugelassen [4]. Der Beginn der mobilspezifischen Immunität gegen M. hypopnoe variiert zwischen einer und vier Wochen und zielt darauf ab, während der gesamten Mastperiode bis zur Schlachtung vor Infektionen zu schützen [4]. Insgesamt löst eine Impfung oder Infektion von Schweinen die Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen und CD4+CD8+-T-Zellen aus und sorgt so für eine schnelle Antikörper- und zellvermittelte Immunantwort nach einem zweiten Kontakt mit dem Krankheitserreger [5] . Eine Impfung gegen M. hyopneumoniae kann zu einer Serokonversion und einem Anstieg der M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörper lokal im Atemtrakt führen [6–9]. Bei geimpften Tieren wurden im Vergleich zu nicht geimpften Tieren höhere Spiegel an IFN- --produzierenden Lymphozyten zusammen mit einer höheren Lymphozytenproliferationsrate nach In-vitro-M. hyopneumoniae-Stimulation beobachtet [9–11]. Darüber hinaus wurden nach der M. hyopneumoniae-Impfung polyfunktionale CD4+CD8− und CD4−CD8+ T-Zellen gefunden, die INF- und TNF- produzieren [12]. Es ist jedoch nicht völlig klar, wie lange die durch den Impfstoff gegen M. hypopnoe mobile spezifische Immunität anhält. In den meisten Studien zur Wirksamkeit von M. hyopneumoniae-Impfstoffen werden Schweine bereits einige Wochen nach der Impfung aufgefordert, Husten, Immunparameter, Krankheitserregerlast und Lungenläsionen zu untersuchen [13–16]. Bei der Untersuchung der Langzeitwirksamkeit, meist in Feldversuchen, wurden häufig nur Produktionsparameter und Lungenläsionen bei der Schlachtung untersucht und Immunparameter nicht oder nur unzureichend untersucht [17–20]. Nach unserem Kenntnisstand wurde die durch den M. hyopneumoniae-spezifische Impfung induzierte zellvermittelte Immunität vom Zeitpunkt der Impfung bis zur Schlachtung unter Feldbedingungen noch nicht untersucht. Neben der Ferkelimpfung ist die M. hyopneumoniae-Impfung von Zuchtsauen eine häufig angewandte Eingewöhnungspraxis [21]. Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Zytokin-produzierende CD4+CD8+- und polyfunktionale CD4-CD8-T-Zellen sind nach der Impfung von Zuchttieren vorhanden [22]. Ferkel, die Kolostrum von immunisierten Sauen säugen, weisen hohe Konzentrationen an M. hyopneumoniae-spezifischen maternal abgeleiteten Antikörpern (MDA) und eine zellvermittelte Immunität im Blut auf, die bis zum Absetzen oder sogar länger anhalten kann [7, 22, 23]. Wenn Ferkel in Gegenwart von (hohem) MDA-Gehalt gegen M. hyopneumoniae geimpft werden, fehlt die Serokonversion häufig [24–26]. Allerdings war die Proliferationsreaktion der Lymphozyten nach In-vitro-Stimulation bei mit M. hyopneumoniae geimpften Ferkeln signifikant höher als bei nicht geimpften Ferkeln, unabhängig vom MDA-Spiegel [26]. Obwohl diese Autoren zeigten, dass die zellvermittelte Immunität durch die M. hyopneumoniae-Impfung in Gegenwart hoher MDA-Spiegel ausgelöst wurde, ist eine weitere Differenzierung der T-Zell-Untergruppen und ihrer Zytokinproduktion erforderlich, um bessere Einblicke in diese zellvermittelten Immunantworten zu gewinnen und schließlich der Einfluss einer natürlichen Infektion auf diese Reaktionen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die humoralen und zellvermittelten Immunantworten nach der M. hyopneumoniae-Impfung bei Schweinen in zwei kommerziellen Betrieben zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Serumantikörper sowie die Proliferation und Zytokinproduktion durch verschiedene T-Zell-Untergruppen vom Zeitpunkt der Impfung im Alter von 16 Tagen bis zum Schlachtalter überwacht. Der mögliche Einfluss der M. hyopneumoniae-spezifischen maternalen Immunität auf humorale und zellvermittelte Impfreaktionen bei Ferkeln wurde ebenfalls untersucht.

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Materialen und Methoden

Herdenbeschreibung und Tierauswahl

Two commercial farrow-to-finish farms were included in the study based on the willingness of the farmer to participate. On both farms, circulation of M. hyopneumoniae was assumed based on the presence of the pathogen in tracheobronchial swabs (TBS) taken from fattening pigs in the past. Danbred breeding gilts were reared on farm A and purchased on farm B. On-farm A, the breeding gilts were vaccinated once against M. hyopneumoniae four weeks before first insemination with Ingelvac MycoFLEX® (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany). On-farm B, breeding gilts were vaccinated with Stellamune® Mycoplasma (Elanco, Utrecht, The Netherlands) at six months of age upon arrival at the farm and a second time four weeks later. Furthermore, on-farm B gilts were also booster-vaccinated twice shortly before farrowing. On both farms, sows were not vaccinated against M. hyopneumoniae. Farm A practiced a 5-week batch-farrowing system and piglets were weaned and moved to the nursery unit at approximately 22 days of age. The piglets were vaccinated at 16 days of age against M. hyopneumoniae with an inactivated whole cell J strain-based bacterin (Ingelvac MycoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany), porcine circovirus type 2 (PCV2) (Ingelvac CircoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) (UNISTRAIN® PRRS, HIPRA, Amer, Spain). Pigs were moved to the fattening unit at 9 weeks of age. Farm B worked in a 4-week batch-farrowing system and piglets were weaned and moved to the nursery unit at approximately 22 days of age. Tey was vaccinated at 16 days of age against M. hyopneumoniae with the same vaccine as in farm A (Ingelvac MycoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) and PRRSV (UNISTRAIN® PRRS, HIPRA). The piglets were moved to the fattening unit at 10 weeks of age. On both farms, five breeding animals (two gilts and three sows of mixed parity) were included in the study. The growing process was monitored by the main investigator and from each litter, five healthy piglets (birth weight>1 kg) wurden ausgewählt, die Ohren gekerbt und monatlich von der Geburt bis zur Schlachtung überwacht (n=25 Ferkel/Farm). Eine gegenseitige Pflege der Ohrenferkel war während des gesamten Versuchs nicht gestattet und die Schweine erhielten in beiden Betrieben keine gegen M. hyopneumoniae wirksamen Antibiotika.

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Studiendesign und Stichprobenerhebung

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Fakultät für Veterinärmedizin und der Fakultät für Biowissenschaften der Universität Gent genehmigt (Genehmigungsnummer 2020/31). Von den Sauen wurde während des Abferkelvorgangs Kolostrum gesammelt. Innerhalb von 6 Stunden nach dem Abferkeln wurde den Sauen ein TBS (60 cm Saugkatheter, Medinorm GmbH, Spiesen-Elversberg, Deutschland) und Blut in einem sterilen Serumröhrchen (geronnenes Blut) entnommen. Im Alter von zwei Tagen wurde den Ferkeln Blut in Serumröhrchen entnommen. Im Alter von einem bis sechs Monaten wurde den Ferkeln jeden Monat Blut in sterilen Serum- und EDTA-Röhrchen (nicht geronnenes Blut) sowie ein TBS entnommen. In Betrieb A wurden Schweine im Alter von 177 Tagen geschlachtet, sodass die letzte Probe im Alter von 5,5 Monaten entnommen wurde. In Betrieb B wurden Schweine im Alter von 191 Tagen zum Schlachthof geschickt, sodass die letzte Probe im Alter von 6 Monaten entnommen wurde. Kolostrum- und Serumproben wurden bis zur weiteren Analyse bei -20 Grad und TBS-Proben bei -80 Grad gelagert. Nicht geronnenes Blut wurde sofort für die zellvermittelte Immunitätsanalyse verarbeitet. Digitale PCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae-DNA Um das Vorhandensein von M. hyopneumoniae zu testen, wurde DNA aus den TBS-Proben mithilfe eines kommerziellen Kits (DNeasy® Blood & Tissue Kit, Qiagen, Venlo, Niederlande) und einer digitalen PCR (dPCR) extrahiert ) Das auf das P102-Gen abzielende Protokoll wurde gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt [27]. Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Antikörper Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Antikörper in Serum- und Kolostrumproben wurden mithilfe eines kommerziellen indirekten ELISA (M. hyo Ab-Test, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Proben galten als positiv, wenn das Verhältnis von Probe zu Positiv (S/P) höher als 0,40 war, und als negativ, wenn das Verhältnis von Probe zu Positiv (S/P) gleich oder niedriger als 0,40 war.

Produktion von T-Zell-Zytokinen

Aus dem frischen, nicht geronnenen Blut wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mithilfe eines Lymphoprep™-Dichtegradienten (Stemcell Technologies, Van - - cover, Kanada) isoliert. Die Isolierung, Stimulation und Färbung der PBMCs erfolgte wie zuvor beschrieben mit einigen geringfügigen Modifikationen [22]. Die Zellen wurden über Nacht (20 Stunden) mit selbst hergestelltem M. hyopneumoniae J-Stamm-Bacterin stimuliert und für jedes Tier waren ein negatives Medium und eine positive Concanavalin A (ConA)-Kontrolle enthalten. Das Bakterin des Stammes M. hyopneumoniae J wurde auf der Grundlage des Protokolls für die Produktion des Bakterins M. hyopneumonia F7.2 C hergestellt [16]. Um die Zytokinproduktion zu untersuchen, wurde Brefeldin A (eBioscience™, San Diego, CA, USA) für die letzten 4 Stunden der Stimulation in jede Vertiefung gegeben, um die Proteinsekretion zu hemmen. Für die extrazelluläre Färbung wurden die PBMCs mit monoklonalen Anti-CD3- (Klon PPT3), Anti-CD4- (Klon 74-12-4) und Anti-CD8- (Klon 11-295-33) Antikörpern inkubiert. Als nächstes entsprechende Sekundärantikörper Anti-Maus-IgG1 APC-Cy7 (Abcam, Cambridge, UK), Anti-Maus-IgG2b FITC (Biolegend, San Diego, CA, USA) und Anti-Maus-IgG2a PE-Cy7 (Abcam, Cambridge, UK) wurden hinzugefügt. Anschließend wurde ein Blockierungsschritt mit Maus-IgG1 (10 µg/ml) durchgeführt. Nach der Oberflächenfärbung wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, und es wurde eine intrazelluläre Färbung auf TNF-, IFN- und IL-17A durchgeführt [22]. Die Daten wurden mit einem CytoFLEX-Durchflusszytometer (Beckman Coulter, Bea, CA, USA) erfasst und die Ergebnisse mit der CytExpert-Software (Beckman Coulter) weiter analysiert. Die Gating-Hierarchie ist in der Zusatzdatei 1 dargestellt.

T-Zell-Proliferationstest

Isolierte PBMCs wurden in vitro mit selbst hergestelltem Bakterin des Stammes M. hyopneumoniae J stimuliert, um die Proliferation von T-Zellen zu beurteilen. Das verwendete Protokoll wurde in einer früheren Studie ausführlich beschrieben [22]. Für die Oberflächenfärbung wurden die Zellen zunächst mit monoklonalen Anti-CD3-, Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörpern und anschließend mit den entsprechenden Sekundärantikörpern Anti-Maus-IgG1 APC-Cy7 (Abcam, Cambridge, UK) und Anti-Maus-IgG2b inkubiert FITC (Biolegend, San Diego, CA, USA) und Anti-Maus-IgG2a AlexaFluor 647 (Biolegend, San Diego, CA, USA) zusammen mit Propidiumiodid. Die Daten wurden mit einem CytoFLEX-Durchflusszytometer erfasst und die Ergebnisse mit der CytExpert-Software weiter analysiert. Die Gating-Hierarchie ist in der Zusatzdatei 2 dargestellt.

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Datenanalysen

Statistical analyses were performed using IBM SPSS® Statistics Version 27 (IBM, Chicago, IL, USA) to compare results within farms. A descriptive analysis was performed for M. hyopneumoniae-specific antibody levels and the frequency of different T cell subsets. Kolmogorov-Smirnov and Shapiro-Wilk tests were used as tests for the normality of the residuals. For normally distributed data, repeated measures analyses of variance were used and post-hoc pairwise comparisons were made with a Bonferroni correction to assess possible differences between successive sampling moments. For not mally distributed data, a non-parametric Friedman test was used together with a Wilcoxon signed rank test with Bonferroni correction to compare the different sampling moments. Descriptive results were given to discuss whether the presence (S/P>{{0}}.40) oder das Fehlen (S/P kleiner oder gleich 0,40) von MDA beeinflussten die humorale und zellvermittelte Immunität nach der Ferkelimpfung.

Ergebnisse

In jedem Betrieb wurden fünf Schweine aufgrund von Tod oder Verlust einer Ohrmarke vom Versuch ausgeschlossen. Die Daten dieser Schweine wurden bis zum letzten korrekt dokumentierten Probenahmezeitpunkt in die Analyse einbezogen.

Vorkommen einer natürlichen Infektion mit M. hyopneumoniae auf den Farmen

In Betrieb A wurden alle TBS-Proben (von Sauen, Ferkeln und Mastschweinen) negativ auf das Vorhandensein von M. hyopneumoniae-DNA getestet. In Betrieb B wurden alle TBS-Proben von Sauen, Ferkeln und Mastschweinen bis zum Alter von fünf Monaten negativ auf das Vorhandensein von M. hyopneumoniae-DNA getestet. Im Alter von sechs Monaten wurden vier Mastschweine mit 300, 7, 22 und 14 M. hyopneumoniae-Organismen/µL DNA positiv auf M. hyopneumoniae getestet.

Persistenz von M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern bei Schweinen

In beiden Betrieben hatten vier von fünf Sauen beim Abferkeln M. hyopneumoniae-spezifische Antikörper im Serum und Kolostrum (Abbildungen 1A und C). Zwei Tage alte Ferkel, die Kolostrum dieser Sauen säugten, hatten M. hyopneumoniae-spezifische maternale Antikörper (MDA vorhanden), während Ferkel seronegativer Sauen ebenfalls seronegativ waren (MDA fehlte) (Abbildungen 1B und D). Trotz der Impfung im Alter von 16 Tagen sank in beiden Betrieben der Gehalt an M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern im Serum der Schweine im Alter von zwei Tagen auf einen Monat, von einem Monat auf zwei Monate und von zwei Monaten auf signifikant drei Monate alt (Abbildung 1E). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den späteren Probenahmezeitpunkten festgestellt. Ab einem Alter von zwei Monaten waren alle Schweine, mit Ausnahme von zwei in Betrieb A im Alter von vier Monaten, M. hyopneumoniae-seronegativ. Die M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörperspiegel von Ferkeln mit MDA nahmen mit der Zeit ab und erreichten im Alter von zwei Monaten die gleichen Werte wie bei Ferkeln ohne MDA (Abbildung 1F).

Kinetik der Häufigkeit von T-Zell-Untergruppen bei Schweinen

Im Laufe des Lebens eines Schweins verändert sich die Häufigkeit der verschiedenen T-Zell-Untergruppen im Blut aufgrund der Reifung des Immunsystems und des Kontakts mit Mikroorganismen [28]. Um die Kinetik der verschiedenen T-Zell-Untergruppen zu untersuchen, wurden die Blut-PBMCs aus der nicht stimulierten Mediumkontrolle mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Im Alter von einem Monat betrug die Häufigkeit (durchschnittlicher %) von CD4−CD8+-T-Zellen 13,6 ± 2,8 % bzw. 1 0,5 ± 3,4 % bei Schweinen aus Betrieb A und B. Diese Häufigkeit stieg im Alter von zwei Monaten auf beiden Betrieben deutlich an und nahm im Alter von drei Monaten auf Betrieb A wieder deutlich ab. Ab dem Alter von drei Monaten blieb sie auf Betrieb A stabil, während auf Betrieb B mit sechs Jahren wieder ein deutlicher Anstieg zu beobachten war Monate alt (Abbildung 2A). In beiden Betrieben war die Häufigkeit von CD4+CD8− T-Zellen im Alter von einem Monat mit 37,5 ± 6,0 % (Betrieb A) und 42,3 ± 5,9 % (Betrieb B) am höchsten. Diese Häufigkeit nahm im Alter von zwei Monaten deutlich ab. Auf Betrieb A stabilisierte sich die Häufigkeit ab zwei Monaten, während der Rückgang auf Betrieb B langsamer erfolgte (Abbildung 2B). Im Alter von einem Monat betrug das CD4/CD8-Verhältnis 2,8 (Betrieb A) und 4,{31}} (Betrieb B). Das Verhältnis sank im Alter von zwei Monaten und blieb ab dem Alter von drei Monaten in beiden Betrieben unter 1,0. Die Häufigkeit von CD4-CD8-T-Zellen bei einmonatigen Schweinen betrug 31,1 ± 7,2 % und 25,6 ± 5,4 % in den Betrieben A und B. In beiden Betrieben blieb die Häufigkeit im Alter von zwei Monaten ähnlich, stieg danach jedoch deutlich an und erreichte die höchsten Werte im Alter von fünf Monaten (Abbildung 2C). Die Häufigkeit von CD4+CD8+-T-Zellen war im Alter von einem Monat mit 3,3 ± 1,1 % bzw. 4,{54}} ± 1,0 % in den Betrieben A und B am niedrigsten. Diese Häufigkeit nahm im Alter von zwei Monaten deutlich zu. Auf Betrieb A blieb er danach stabil, während er auf Betrieb B bis zum Alter von vier Monaten allmählich weiter anstieg und im Alter von fünf Monaten wieder deutlich abnahm (Abbildung 2D).

Abbildung 1 Vorhandensein von Mycoplasma hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern bei Sauen und Schweinen. A, C

Abbildung 2 Monatliche Häufigkeit (%) von CD3+-T-Zell-Untergruppen im Blut von Schweinen. A

Abb. 3 Persistenz zirkulierender, proliferierender CD3+-T-Zellen bei Schweinen. A, B

Proliferation von T-Zellen

Die durch M. hypopnea moniae stimulierten PBMCs wurden analysiert, um den Prozentsatz proliferierender T-Zellen zu untersuchen. Wie in den Abbildungen 3A und B dargestellt, waren nach In-vitro-Stimulation mit M. hyopneumoniae-Bakterin zu jedem Zeitpunkt der Probenahme in beiden Betrieben proliferierende CD3+-T-Zellen im Blut von Schweinen vorhanden, obwohl der Prozentsatz bei einigen Tieren höher war Betrieb A. Auf Betrieb A nahm der Prozentsatz der proliferierenden T-Zellen im Alter von sechs Monaten im Vergleich zum Prozentsatz im Alter von fünf Monaten deutlich ab, während auf Betrieb B keine signifikante Verringerung oder Erhöhung des Prozentsatzes der proliferierenden T-Zellen zu verzeichnen war untersucht werden. Die CD4-CD8-T-Zellen waren die dominante Untergruppe der CD3+-T-Zellen, die sich als Reaktion auf die Stimulation durch M. hyopneumoniae in beiden Betrieben vermehrte, gefolgt von der Untergruppe der CD4+CD8-T-Zellen (Abbildungen 3 C und 3). D).

Abbildung 4 Zirkulierende Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Zytokin-produzierende CD4+CD8+-T-Zellen im Blut von Schweinen in beiden Betrieben. A

Produktion von T-Zell-Zytokinen

Um einen besseren Einblick in das Vorhandensein und die Persistenz von M. hyopneumoniae-spezifischen T-Zellen bei Schweinen zu erhalten, wurde die TNF-, IFN- und IL-17A-Produktion durch Blut-PBMCs, die in vitro mit M. hyopneumoniae-Bakterin stimuliert wurden, untersucht Durchflusszytometrie. Wie in Abbildung 4 dargestellt, produzierten stimulierte CD4+CD8+-T-Zellen in beiden Betrieben Zytokine, was bei Schweinen jüngeren Alters stärker ausgeprägt war. Der Prozentsatz der TNF- + CD4+CD8+ T-Zellen nahm bei Schweinen im Betrieb A im Alter von einem bis zwei Monaten und im Alter von zwei bis drei Monaten im Betrieb B deutlich ab. A Ein signifikanter Rückgang der IFN- + CD4+CD{12}}-T-Zellen wurde bei Schweinen in beiden Betrieben im Alter von ein bis zwei Monaten und im Alter von zwei bis drei Monaten in Betrieb B. Te beobachtet Der Prozentsatz der CD4+CD8+-T-Zellen, die sowohl TNF- als auch IFN- produzieren, nahm bei Schweinen im Alter von ein bis zwei Monaten in Betrieb A und von zwei bis drei Monaten in Betrieb B signifikant ab. Nach einem Monat Mit zunehmendem Alter war der Prozentsatz der IL-17A+ CD4+CD8+-T-Zellen höher als der Prozentsatz im Alter von zwei Monaten, aber dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant. Die vier Tiere in Betrieb B, die im Alter von sechs Monaten positiv auf M. hyopneumoniae getestet wurden, hatten eine ähnliche Zytokinproduktion durch CD4+CD8+-T-Zellen wie die Tiere, die negativ auf M. hyopneumoniae waren. Zusätzlich zur CD4+CD8+-T-Zell-Untergruppe beobachteten wir auch Unterschiede in der Zytokinproduktion durch andere T-Zell-Untergruppen in Betrieb B. Abbildung 5 zeigt Daten zu klaren Reaktionen und signifikanten Unterschieden in der Zytokinproduktion durch die anderen T-Zell-Untergruppen, die nur in Betrieb B auftraten. Für die anderen Parameter und auf Betrieb A wurden keine Unterschiede in der Zytokinproduktion von CD4−CD8+, CD4+CD8− oder CD4− beobachtet CD8− T-Zellen. Der Prozentsatz der TNF- + CD4+CD8− T-Zellen stieg signifikant an, während der Prozentsatz der IFN- + CD4−CD8+ T-Zellen von einem auf zwei Monate signifikant abnahm Alter. Bemerkenswert ist, dass das Schwein, das im Alter von sechs Monaten M. hyopneumoniae-positiv war und 7 M. hyopneumoniae-Organismen/µL DNA aufwies, hohe Prozentsätze an TNF- + CD4+CD8− und IL-17 aufwies. A+ CD4−CD8+ T-Zellen in seinem Blut. Die anderen M. hyopneumoniae-positiven Schweine hatten im Alter von sechs Monaten einen ähnlichen Prozentsatz an Zytokin-produzierenden T-Zellen wie die M. hyopneumoniae-negativen Schweine.

Abbildung 5 Zirkulierende Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Zytokin-produzierende T-Zell-Untergruppen im Blut von Schweinen im Betrieb B. A

Auf jedem Betrieb war M. hyopneumoniae-spezifisches MDA im Serum von 20 zwei Tage alten Ferkeln vorhanden und fehlte im Serum von fünf Ferkeln, die von Sauen ohne M. hyopneumoniae-spezifische Serumantikörper stammten. Um zu untersuchen, ob MDA einen Einfluss auf die durch M. hyopneumoniae-spezifische Impfung induzierte zellvermittelte Immunität hatte, wurde zwischen Ferkeln mit und ohne MDA unterschieden und die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen hinsichtlich der T-Zell-Untergruppen untersucht, die signifikant waren Unterschiede wurden bei der Zytokinproduktion beobachtet (Abbildungen 6A–E). Im Betrieb B war der Prozentsatz an TNF- + CD4+CD8+-T-Zellen bei einmonatigen Schweinen mit MDA tendenziell höher als bei einmonatigen Schweinen Schweine ohne MDA. Bei den anderen Zytokin-produzierenden CD4+CD8+-T-Zellen waren die durchschnittlichen Prozentsätze zwischen den beiden Gruppen von Schweinen im Alter von einem Monat in jedem Betrieb ähnlich. Im Laufe der Zeit gab es einen abnehmenden Trend bei den durchschnittlichen Prozentsätzen der Zytokin-produzierenden CD4+CD8+-T-Zellen im Blut von Schweinen, wobei im Alter von sechs Monaten nur geringe bis keine Unterschiede zwischen Schweinen mit und ohne Zytokin-produzierenden Zellen auftraten MDA (Abbildungen 6A–C). Dasselbe wurde für IFN- -produzierende CD8+-T-Zellen im Blut von Schweinen in Betrieb B beobachtet (Abbildung 6D). Im Alter von einem und zwei Monaten war der durchschnittliche Prozentsatz an TNF- + CD4+CD8− T-Zellen in Betrieb B für Schweine mit oder ohne MDA ähnlich, während er im Alter von sechs Monaten höher war von TNF- -produzierenden CD4+CD8− T-Zellen wurde im Blut von Schweinen ohne MDA beobachtet (Abbildung 6E).

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Diskussion

Dies ist die erste Studie, die Einblicke in die langfristigen durch M. hyopneumoniae-spezifischen Impfstoff induzierten Immunreaktionen bei Schweinen von der Geburt bis zur Schlachtung unter Feldbedingungen liefert. Eine humorale Immunantwort im Serum, bewertet mit dem IDEXX ELISA, fehlte nach der Impfung, es waren jedoch zellvermittelte Immunantworten vorhanden. Die Proliferation von T-Zellen nach in vitro M. hyopneumoniae-Stimulation wurde bis zum Ende der Mastperiode beobachtet. Darüber hinaus waren im Alter von einem Monat nach der Impfung gegen M. hyopneumoniae M. hyopneumoniae-spezifische Zytokin-produzierende CD4+CD8+-T-Zellen vorhanden, zu denen auch Gedächtnis-T-Zellen gehören, die jedoch mit zunehmendem Alter abnahmen . Mütterliche Antikörper schienen die humoralen und zellvermittelten, durch den Impfstoff induzierten Immunantworten während des Lebens des Schweins nicht zu beeinflussen, mit Ausnahme des Vorhandenseins von TNF- + CD4+CD8+-T-Zellen . Um die Persistenz und Unterschiede in der Immunantwort bei mit M. hyopneumoniae geimpften Ferkeln auf Betriebsebene zu bewerten, haben wir zwei kommerzielle Betriebe einbezogen. Obwohl die Zirkulation von M. hyopneumoniae in beiden Betrieben angenommen wurde, blieben die untersuchten Schweine während des gesamten Versuchs M. hyopneumoniae-negativ, mit Ausnahme von vier Schweinen in Betrieb B am Ende des Versuchs, was es uns ermöglichte, die Persistenz der durch den Impfstoff induzierten Infektion zu untersuchen Immunreaktionen ohne den Einfluss einer natürlichen Infektion. Die vier M. hyopneumoniae PCR-positiven Schweine im Alter von sechs Monaten in Betrieb B wiesen im Vergleich zu den PCR-negativen Schweinen keine höheren M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörperspiegel auf. Mit Ausnahme eines Schweins hatten sie nach der In-vitro-Stimulation mit M. hyopneumoniae auch keinen höheren Anteil an Zytokin-produzierenden T-Zellen im Blut. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass die M. hyopneumoniae-Infektion wahrscheinlich kurz vor dem Zeitpunkt der Probenentnahme auftrat, was dem Immunsystem nicht genügend Zeit ließ, auf die Infektion zu reagieren [29–31]. Bei drei der vier M. hyopneumoniae-positiven Schweine war die Erregerbelastung in der TBS-Probe ebenfalls eher gering.

Abbildung 6 Durchschnittlicher Prozentsatz der Mycoplasma hyopneumoniae-spezifischen Zytokin-produzierenden T-Zell-Untergruppen nach maternalen Antikörperspiegeln. Wechselstrom

Die Serumantikörperspiegel bei zwei Tage alten Schweinen entsprachen den Spiegeln von M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern im Serum und Kolostrum von Sauen beim Abferkeln, was die Übertragung der M. hyopneumoniae-spezifischen maternalen Immunität über Kolostrum bestätigt [22, 23]. Nach der M. hyopneumoniae-Impfung im Alter von 16 Tagen wurde keine Serokonversion beobachtet. Im Gegenteil, die Menge an M. hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern nahm mit der Zeit ab, wobei alle Tiere im Alter von zwei Monaten seronegativ wurden. Es ist bekannt, dass der in dieser Studie verwendete kommerzielle M. hyopneumoniae-Impfstoff nach einmaliger Verabreichung eine begrenzte Serokonversion verursacht, was auch in früheren Studien beobachtet wurde [14, 32, 33]. In einer experimentellen Studie zur Impfung von Ferkeln während der Entwöhnung kam es bei 40 % der Tiere 3 Wochen nach der Impfung zu einer Serokonversion, während in einem Feldversuch nur 3 von 40 Schweinen 7 Wochen nach der Impfung eine Serokonversion auftraten [14, 32]. Das Vorhandensein (oder Fehlen) von M. hyopneumoniae-spezifischen Serumantikörpern nach der Impfung entspricht jedoch nicht einem Schutz (oder einem Fehlen desselben) vor einer Infektion [14, 25, 34]. Um den Wirt vor fakultativen intrazellulären und extrazellulären bakteriellen Krankheitserregern wie M. hyopneumoniae zu schützen, spielen CD4+CD8− T-Helferzellen, hauptsächlich T1- und T17-Zellen, eine wichtige Rolle. T1-Zellen produzieren IFN-, das Makrophagen aktiviert, um den Erreger abzutöten, während T17-Zellen IL-17A produzieren, um die Schleimhautbarriere zu stärken [35–38]. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein geringer Prozentsatz von M. hyopneumoniae-Zellen auch intrazellulär gefunden werden kann, und angesichts der entscheidenden Rolle zytotoxischer CD4-CD8+-T-Zellen beim Schutz des Wirts vor intrazellulären Krankheitserregern sind diese zytotoxischen T-Zellen könnte auch wichtig sein, um M. hyopneumoniae-Infektionen zu kontrollieren [31, 35, 39]. Um die Kinetik der verschiedenen T-Zell-Untergruppenfrequenzen und die Fähigkeit dieser T-Zellen zur Proliferation nach in vitro M. hyopneumoniae-Stimulation zu untersuchen, wurden PBMCs aus Ferkeln beider Betriebe isoliert. Das Muster der Häufigkeit von T-Zell-Untergruppen war in diesen beiden Betrieben ähnlich. Anderen Studien zufolge ist der Anteil der CD4+CD8−T-Zellen höher als der Anteil der CD4−CD8+T-Zellen in einem jüngeren Alter. Mit zunehmendem Alter nimmt der Anteil der CD4+CD8-T-Zellen ab, während der Anteil der CD4-CD8+-T-Zellen zunimmt, was mit der Zeit zu einem abnehmenden CD4/CD8-Verhältnis führt [40–42]. Ferkel werden fast ohne CD4+CD8+-T-Zellen geboren. Diese Zellen nehmen mit zunehmendem Alter zu, wenn Schweine Kontakt mit Mikroorganismen haben, da einige dieser Zellen eine erregerspezifische Gedächtnisfunktion haben [5, 22, 42–44]. Allerdings blieb in Betrieb A die Häufigkeit von CD4+CD8+-T-Zellen ab einem Alter von zwei Monaten auf dem gleichen Niveau. In Betrieb B kam es wie erwartet zu einem allmählichen Anstieg bis zum Alter von vier Monaten, obwohl der Prozentsatz der CD4+CD8+-T-Zellen danach wieder abnahm. Der Vergleich von T-Zell-Subpopulationen mit anderen Studien bleibt schwierig, da die PBMCs in dieser Studie nicht direkt nach der Blutentnahme gemessen wurden, sondern zunächst 20 Stunden lang inkubiert wurden, bevor der Prozentsatz der T-Zell-Subpopulationen gemessen wurde. Die Mycoplasma hyopneumoniae-spezifische Proliferation von CD3+-T-Zellen blieb bis zum Ende der Mastperiode bestehen, was das Vorhandensein von M. hyo pneumoniae-spezifischen T-Zellen im Blut von Schweinen bestätigt, die im Alter von 16 Tagen geimpft wurden. Das Vorhandensein von M. hyopneumoniae-spezifischen proliferierenden T-Zellen könnte mit dem Schutz vor enzootischer Pneumonie korrelieren, da frühere Untersuchungen gezeigt haben, dass die Fähigkeit von PBMCs zur Proliferation nach In-vitro-Stimulation mit dem Mitogen ConA mit der Resistenz gegen Krankheiten bei Schweinen korreliert [45]. ]. Die CD4-CD8-T-Zellen waren die Hauptuntergruppe der T-Zellen, die sich in beiden Betrieben vermehrte, gefolgt von CD4+CD8-T-Zellen, wobei die Prozentsätze im Laufe der Zeit schwankten. Bei Schweinen tragen die meisten CD4-CD8-T-Zellen im Gegensatz zu Antigen-spezifischen T-Zellen invariante δ-T-Zellrezeptoren [31, 42]. Bei der Infektion von Schweinen mit anderen Krankheitserregern wie PRRSV waren δ-T-Zellen auch die wichtigsten proliferativen Responder nach einer PRRSV-Virämie [46]. Diese T-Zellen spielen auch eine Rolle bei der Produktion neutralisierender Antikörper nach der Impfung von Schweinen gegen die klassische Schweinepest [47]. Darüber hinaus wurde in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von Schweinen, die mit Actinobacillus pleuropneumoniae infiziert waren, ein Anstieg der CD8−δ T-Zellen beobachtet [48]. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Rolle von δ-T-Zellen bei der Kontrolle und dem Schutz vor M. hyopneumoniae-Infektionen zu untersuchen. In Recall-Assays wurden verschiedene T-Zell-Untergruppen auf ihre Produktion von TNF-, IFN- und IL-17A untersucht. Im Alter von zwei Monaten war der Prozentsatz der TNF- --, IFN- -- und TNF-/IFN- -produzierenden CD4+CD8+-T-Zellen signifikant verringert im Vergleich zu den Prozentsätzen im Alter von einem Monat. Danach schwankten die Prozentsätze, sie gingen entweder weiter zurück oder blieben im Laufe der Zeit stabil. Das gleiche Muster wurde für IL-17A-produzierende CD4+CD8+-T-Zellen beobachtet, wenn auch nicht statistisch signifikant. Bei gegen PRRSV geimpften Jungsauen wurde die IFN-Produktion durch PBMCs ebenfalls bis 42 Tage nach der Erstimpfung beobachtet, nahm danach aber bis 147 Tage nach der Impfung ab [49]. Eine erhöhte Anzahl IFN-sekretierender Lymphozyten nach einer M. hyo pneumoniae-Impfung wurde bereits früher nachgewiesen [9, 10].

Wüstenlebende CistancheTubulosa

In jüngster Zeit häufen sich Hinweise darauf, dass polyfunktionale T-Zellen, die mehr als ein Zytokin produzieren, eine entscheidende Rolle beim Schutz und der Beseitigung von Krankheitserregern spielen. Beispielsweise sind bei Schweinen, die mit Chlamydienarten infiziert sind, polyfunktionale CD4+CD8− T-Zellen mit Schutz verbunden [50]. Die Impfung von Ferkeln gegen M. hyo pneumoniae erhöhte auch den Anteil polyfunktioneller CD4+CD8− und CD4−CD8+ T-Zellen [12]. In einer anderen Studie führte die Impfung von Schweinen gegen PCV2 24 Tage nach der Impfung zu höheren Spiegeln von TNF- +/IFN- + CD4+CD8+-T-Zellen, die wieder abnahmen gegen Ende der Studie, 56 Tage nach der Impfung [51]. In unserer Studie haben wir auch beobachtet, dass die Anwesenheit von Zytokin-produzierenden CD4+CD8+-T-Zellen mit der Zeit abnahm. Diese Studie konzentrierte sich auf zirkulierende Blutlymphozyten, aber die Impfung induziert auch lokale M. hyopneumoniae-spezifische zellvermittelte Immunantworten in der Lunge und den bronchialen Lymphknoten [8]. Daher sollte sich die zukünftige Forschung zur M. hyo pneumoniae-spezifischen impfstoffinduzierten Immunität auch auf lokale zellvermittelte Immunantworten konzentrieren. Darüber hinaus wurde in dieser Studie zur Immunisierung der Ferkel nur ein kommerzieller M. hyopneumoniae-Impfstoff verwendet. Die Immunantworten können zwischen den Impfstoffen unterschiedlich sein, da sie von der Formulierung eines Impfstoffs (Adjuvans und Antigen) und dem Verabreichungsweg beeinflusst werden [16, 52, 53]. Beispielsweise ist bekannt, dass Carbopol, das Adjuvans im kommerziellen M. hyopneumoniae-Impfstoff, die Immunantwort in Richtung einer T1-Antwort lenkt [54]. Auf jedem Betrieb waren fünf Ferkel seronegativ gegen M. hyopneumoniae, und im Serum von 20 Ferkeln war M. hyopneu mobile-spezifisches MDA vorhanden. Unabhängig von ihrem MDA-Status waren alle Schweine im Alter von zwei Monaten M. hyopneumoniae-seronegativ, und zu späteren Zeitpunkten wurde keine Serokonversion beobachtet. Unsere Ergebnisse stimmen mit einer früheren Studie überein, in der sieben Tage alte Ferkel mit und ohne MDA gegen M. hyopneumoniae geimpft wurden [25]. In beiden Gruppen wurde keine Serokonversion nach der Impfung beobachtet und alle Schweine waren 42 Tage nach der Impfung seronegativ. Andererseits fanden andere heraus, dass die Impfung gegen M. hyopneumoniae in Gegenwart von MDA zu höheren Antikörperspiegeln im Vergleich zu nicht geimpften Ferkeln führte, aber je höher der MDA-Titer war, desto geringer war die Reaktion [24, 26]. Obwohl nach einer M. hyopneumoniae-Impfung nicht immer eine Antikörperantwort beobachtet wird, werden M. hyopneumoniae-spezifische zellvermittelte Immunantworten induziert [26]. Es wurde kein Unterschied in der Proliferation von PBMCs beobachtet, die aus mit M. hyopneumoniae geimpften Schweinen isoliert wurden, unabhängig von der MDA-Konzentration [26]. In unserer Studie wurden in jedem Betrieb keine Unterschiede bei den Zytokin-produzierenden T-Zellen zwischen M. hyopneumoniae-geimpften Schweinen mit und ohne MDA im Alter von einem Monat beobachtet. Lediglich in Betrieb B wiesen Ferkel mit MDA im Alter von einem Monat tendenziell höhere Prozentsätze an TNF- + CD4+CD8+-T-Zellen auf als Ferkel ohne MDA. Die Relevanz dieser Ergebnisse sollte in einer Studie weiter untersucht werden, die eine größere und gleiche Anzahl von Ferkeln mit und ohne M. hyopneumoniae-spezifischem MDA umfasst. Es sollten auch zehn statistische Analysen durchgeführt werden, da dies in dieser Studie aufgrund der geringen und ungleichen Anzahl von Tieren in der Gruppe ohne und mit MDA nicht durchgeführt wurde. Zusammenfassend zeigte die vorliegende Studie, dass trotz fehlender Serokonversion nach M. hyopneumoniae-Impfung von Ferkeln M. hyopneumoniae-spezifische zellvermittelte Immunantworten nachgewiesen wurden. Polyfunktionale Zytokin-produzierende CD4+CD8+-T-Zellen waren bis zum Alter von drei Monaten vorhanden und proliferierende T-Zellen wurden bis zum Ende der Mastperiode beobachtet, was auf das Vorhandensein einer pathogenspezifischen zellvermittelten Immunität hinweist bei mit M. hyopneumoniae geimpften Schweinen. Die Ergebnisse bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Bewertung des Einflusses einer natürlichen M. hyopneumoniae-Infektion auf die impfstoffinduzierte Immunität unter Feldbedingungen.

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