Längsschnittliche Immunprofilierung deckt dominante Epitope auf, die eine langfristige humorale Immunität bei COVID-19-rekonvaleszenten Personen vermitteln

Hintergrund: Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein hochpathogenes und ansteckendes Coronavirus, das eine weltweite Pandemie mit bisher 5,2 Millionen Todesopfern verursacht hat. Fragen zu serologischen Merkmalen der Langzeitimmunität, insbesondere zu dominanten Epitopen, die dauerhafte Antikörperreaktionen nach einer SARS-CoV-2-Infektion vermitteln, müssen noch geklärt werden.

Zielsetzung: Unser Ziel war es, die Kinetik und Langlebigkeit der Immunantworten bei Patienten mit der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) sowie die Epitope zu untersuchen, die für eine anhaltende, langfristige humorale Immunität gegen SARS-CoV-2 verantwortlich sind.

Methoden: Wir haben die SARS-CoV-2-Immundynamik bis zu 180 bis 220 Tage nach Ausbruch der Krankheit bei 31 Personen untersucht, bei denen überwiegend moderate Symptome von COVID-19 auftraten, und anschließend ein proteomweites Profil der dafür verantwortlichen dominanten Epitope durchgeführt anhaltende humorale Immunantworten.

Ergebnisse: Die Längsschnittanalyse ergab anhaltende SARS-CoV-2-Spike-Protein-spezifische Antikörper und neutralisierende Antikörper bei COVID-19-Patienten sowie eine Aktivierung der Zytokinproduktion in frühen Stadien nach einer SARS-CoV-2-Infektion. Es wurde gezeigt, dass sich hochreaktive Epitope, die in der Lage sind, langfristige Antikörperreaktionen zu vermitteln, an den Spike- und ORF1ab-Proteinen befinden. Schlüsselepitope des SARS-CoV-2-Spike-Proteins wurden auf die N-terminale Domäne der S1-Untereinheit und der S2-Untereinheit abgebildet, mit unterschiedlichem Grad an Sequenzhomologie zwischen endemischen menschlichen Coronaviren und hoher Sequenzidentität zwischen den frühen SARS-CoV- CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) und aktuell zirkulierende Varianten.

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Abschluss: Eine SARS-CoV-2-Infektion induziert bei von COVID-19 genesenen Personen eine anhaltende humorale Immunität, indem sie auf dominante Epitope am Spike und ORF1ab-Proteine ​​abzielt, die langfristige Immunantworten vermitteln. Unsere Erkenntnisse bieten einen Weg zur Unterstützung des rationalen Impfstoffdesigns und der diagnostischen Entwicklung. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Schlüsselwörter:

SARS-CoV-2, COVID-19, langfristige Immunantwort, humorale Immunität, proteomweites Peptid-Microarray, dominantes Epitop

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), der Erreger der anhaltenden Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19)-Pandemie, gehört zur Gattung Betacoronavirus, zu der zwei weitere bekannte hochpathogene Menschen gehören Coronaviren: die Coronaviren des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS) und des Middle East Respiratory Syndrome (MERS).1 Seit Beginn des ersten registrierten Falles Ende Dezember 2019 sind mehr als 263 Millionen Menschen mit SARS-CoV-2 infiziert worden bestätigte Fälle und 5,2 Millionen Todesfälle weltweit (Stand November 2021), die 220 Länder und Regionen auf 5 Kontinenten betreffen.2 Nach einer Infektion sind die klinischen Symptome sehr unterschiedlich und umfassen asymptomatische Infektionen, leichte oder mittelschwere Symptome oder sogar lebensbedrohliche schwere Lungenentzündung.3 Trotz der Aufgrund der Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfansätzen kämpfen viele Länder immer noch darum, neue Infektionswellen einzudämmen, wobei Virusvarianten auftauchen, die offenbar eine erhöhte Übertragbarkeit und Resistenz gegen antivirale Immunantworten aufweisen. Eine wirksame humorale Immunantwort, die durch neutralisierende Antikörper vermittelt wird, sollte über eine starke und unverzichtbare adaptive Immunität verfügen, um Infektionen zu blockieren und virale Krankheitserreger zu eliminieren. Nach einer SARS-CoV-2-Infektion wurde 7 bis 14 Tage nach Ausbruch der Krankheit eine hohe Rate (über 90 %) einer starken Serokonversion bei infizierten Personen beobachtet.4-6 Die Produktion von Antigen-spezifischem IgA, IgG, und IgM, das das Spike-Protein (S) und das Nukleokapsid-Protein (N) von SARS-CoV-2 erkennt, war während der akuten Phase der Krankheit und im frühen Stadium der Genesung nachweisbar.4,5,7 Das Ausmaß neutralisierender Antikörper schien zu sein mit dem Alter, der symptomatischen Infektion und der Schwere der Erkrankung verbunden sein. Ältere Patienten und Personen mit schweren COVID-19-Symptomen neigen dazu, höhere Werte an neutralisierenden Antikörpern zu entwickeln.4,8-10 Mehrere Studien zur Langlebigkeit von Antikörperreaktionen haben gezeigt, dass dies trotz eines Verlusts der Serum-/Plasmareaktivität gegenüber dem Virus der Fall ist Antigenen und sinkenden neutralisierenden Antikörpertitern im Laufe der Zeit in einigen symptomatischen COVID-19-Fällen wurde bei COVID-19-rekonvaleszenten Personen ein anhaltendes Maß an allgemeiner, langfristiger humoraler Immunität für bis zu 8 bis 12 Monate nach der Infektion beobachtet .10-13 Darüber hinaus blieb die Anzahl der SARS-CoV-2-Antigen-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen mindestens 6 bis 12 Monate lang stabil,12,13 zusammen mit der fortlaufenden Selektion und Akkumulation exprimierender B-Zell-Klone neutralisierende Antikörper12,14, was auf die Aufrechterhaltung einer anhaltenden humoralen Immunität nach einer SARSCoV-2-Infektion hinweist.

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Neutralisierende Antikörper spielen eine grundlegende Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen Virusinfektionen. Es wurde eine Reihe hochwirksamer monoklonaler Antikörper gegen SARS-CoV-2 identifiziert, die hauptsächlich auf Epitope abzielen, die sich in der Rezeptorbindungsdomäne des S-Proteins befinden, das sich auf der Virionoberfläche zu Trimeren zusammenfügt und den Viruseintritt erleichtert und Fusion durch Aktivierung des Angiotensin-Converting-Enzym-2-Rezeptors.18 Andere Regionen des S-Proteins, einschließlich der N-terminalen Domäne (NTD) der S1-Untereinheit und der S2-Untereinheit, enthalten ebenfalls immunogene Epitope, die neutralisierende Antikörper induzieren können.16 ,19,20 Neben der Neutralisierung können Antikörper von SARS-CoV-2 in vivo Schutz über Fc-vermittelte Effektorfunktionen bieten, wie etwa antikörperabhängige Phagozytose, die durch natürliche Killerzellen ausgelöst wird, und antikörperabhängige Zytotoxizität durch Monozyten oder Makrophagen. 21,22 Zusätzlich zur Bekämpfung von Virusinfektionen können durch natürliche Infektionen oder Impfungen erzeugte Antikörper die Viruspathogenese erleichtern, entweder durch erhöhte Entzündungsaktivierung oder erhöhte Virusinfektiosität durch Bildung von Antigen-/Antikörper-Immunkomplexen oder durch Fc-abhängige Funktionen.23-25 obwohl die verstärkte Virusinfektion im Zusammenhang mit SARS-CoV-2 in vivo nicht beobachtet wurde. Diese unterschiedlichen Rollen der Antikörperreaktionen erfordern eine systematische Charakterisierung der SARSCoV-2-Epitope sowie der Eigenschaften langlebiger Antikörper, die auf neutralisierende oder nicht neutralisierende Epitope abzielen. Trotz jüngster Fortschritte bei der Kinetik und Dauer von Antikörperreaktionen nach einer SARS-CoV-2-Infektion ist die Längsschnittanalyse in Bezug auf prominente Epitope, die langfristige humorale Immunantworten aufrechterhalten, immer noch begrenzt. Frühere Studien haben Epitope der Antikörperantwort bei COVID-19-infizierten Personen profiliert, hauptsächlich mithilfe von ELISA-basierten Tests,26,27 Phagen- oder Bakterien-Display-basierten Ansätzen28-31 und Microarray-basierten Technologien.30,{{ 38}} Mehrere immundominante Epitope des SARS-CoV-2 S-Proteins wurden identifiziert; Die am häufigsten nachgewiesenen Regionen wurden in der Nähe oder über das Fusionspeptid (FP) der S2-Untereinheit, die zweiten Heptad-Wiederholungen innerhalb der S2-Untereinheit und auf der C-terminalen Domäne der S1-Untereinheit kartiert.26,28-30, 32,33 Darüber hinaus ergab das serologische Screening auch Epitope, die sich an anderen Proteinen im gesamten SARS-CoV-2-Proteom befinden, darunter N-Protein, Membranprotein (M) sowie ORF1ab, ORF3a und ORF7a.28-30, 34,35 Obwohl frühere Studien wichtige Einblicke in antigene Epitope lieferten, konzentrierten sich diese Studien weitgehend auf die Epitop-Profilierung von COVID-19-Patienten in der frühen Rekonvaleszenzphase. Die genauen Epitope, die dauerhafte SARS-CoV-2-spezifische Antikörperreaktionen vermitteln, sowie die Dynamik der Epitoperkennung müssen noch geklärt werden. Um ein tieferes Verständnis der Kinetik und Langlebigkeit humoraler Immunantworten bei COVID-19-Patienten zu erhalten, insbesondere der Epitope, die für eine anhaltende Langzeitimmunität gegen SARS-CoV-2 verantwortlich sind, führten wir hier eine umfassende Längsschnittanalyse durch der Immunprofilierung bei 31 COVID-19-Patienten bis zu 180 bis 220 Tage nach Symptombeginn. Basierend auf der Auswertung antigenbindender und neutralisierender Antikörper sowie der Serumzytokinspiegel identifizierten wir außerdem eine Reihe von Epitopen, die sich an den ORF1ab-, S- und N-Proteinen von SARSCoV-2 befinden und mithilfe eines Peptids anhaltende humorale Immunantworten vermitteln Mikroarray, der das vollständige Proteom von SARS-CoV umfasst-2. Unsere Ergebnisse geben Aufschluss über die Merkmale einer langfristigen Immunität zur Überwindung einer Virusinfektion und werden dazu beitragen, ein rationales Impfstoffdesign und die Entwicklung verbesserter serologischer Diagnosetools zu unterstützen.

METHODEN

Studienteilnehmer und Probenentnahme

Um die Kinetik von SARS-CoV-2-gerichteten Immunantworten in Längsrichtung zu bewerten, wurden 101 Serumproben von 31 SARS-CoV-2-infizierten Personen entnommen, die in das Nantong Third Hospital der Nantong University (Nantong) eingeliefert wurden , China) zwischen Januar und März 2020. Bei allen Patienten wurde durch quantitative Reverse-Transkription-PCR-Tests eine bestätigte SARS-CoV-2-Infektion diagnostiziert; Der Schweregrad der Erkrankung wurde gemäß Version 7 des von der Nationalen Gesundheitskommission der Volksrepublik China herausgegebenen Diagnose- und Behandlungsprotokolls für neuartige Coronavirus-Pneumonie als leichtes bis mittelschweres (nicht schweres) oder schweres COVID-19 definiert.36 Patienten wurden beobachtet 4 bis 8 Monate nach der Genesung von einer akuten Infektion in Längsrichtung aufsteigen. Bei 20 Patienten von 31 Studienteilnehmern wurden im Längsschnitt 4 bis 219 Tage nach Symptombeginn Blutproben entnommen (im Mittel 4,5 Proben pro Person, im Bereich von 2 bis 8), während für jeden einzelnen Zeitpunkt eine Probenahme durchgeführt wurde weitere 11 Personen, die sich in einer späten Rekonvaleszenzphase der Krankheit befanden (Tage 122 bis 214 nach Krankheitsbeginn). Dementsprechend wurden auch Seren (n 5 20) von gesunden Spendern gleichen Alters und Geschlechts als Kontrollgruppe einbezogen. Kein Studienteilnehmer hatte eine dokumentierte Vorinfektion mit SARS oder MERS.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Nantong Third Hospital der Universität Nantong genehmigt (Genehmigung EL2020006). Von jedem Studienteilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Serum wurde in Serumgelröhrchen mittels Zentrifugation vom peripheren Blut getrennt, in Aliquots aufgeteilt und vor der Verwendung bei 280 °C gelagert.

Zelllinien

HEK293T- und Huh7-Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Gibco), 100 U/ml Penicillin (Gibco) und 100 mg/ml. ml Streptomycin (Gibco) bei 378 °C mit 5 % CO2.

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Nachweis von IgG-Antikörpern mittels ELISA

Die Konzentrationen antigenbindender IgG-Antikörper in menschlichen Serumproben wurden durch ELISA bestimmt. ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, NY) wurden mit SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (Sino Biological, Peking, China, Katalog-Nr. 40588-V08B) vorbeschichtet , 50 ng pro Well) oder Spike-Protein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng pro Well), SARS-CoV-Spike-Protein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng pro Well). Well) oder MERS-CoV-Spike-Protein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng pro Well) über Nacht bei 48 °C. Nach Blockierung mit 5 % fettfreier Milch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,05 % Tween 20 (PBS-T) enthält, für 2 Stunden bei 378 °C werden seriell verdünnte hitzeinaktivierte Serumproben mit einer Anfangsverdünnung von 1 3-fach verdünnt :200 wurden 2 Stunden lang bei 378 °C in vorbeschichtete Platten gegeben. Die Vertiefungen wurden zwischen jedem Schritt dreimal mit PBS-T gewaschen. Die Reaktionen wurden durch einstündige Inkubation mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Human-IgG-Antikörper (Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich, 1:100, 000-Verdünnung) bei 378 °C und anschließende Zugabe von Tetramethylbenzidin-Substrat (Life Technologies, Carlsbad) sichtbar gemacht , Kalifornien). Die sich entwickelnden Reaktionen wurden mit 2 mol H2SO4 gestoppt und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen, wobei die Korrekturwellenlänge auf 630 nm eingestellt war (OD450 2 OD630). Zur Berechnung des Endpunkttiters bindender Antikörper wurden die Daten linearisiert, indem der log10 der Serumverdünnungen gegen die korrigierten Werte der optischen Dichte (OD) (OD450 2 OD630) innerhalb des linearen Teils der Kurve (y 5 kx 1 b) aufgetragen wurde , r2 > 0,99) und die Serumverdünnung, bei der der angepasste OD-Wert (OD450 2 OD630) 5 0 berechnet wurde, um einen Endpunkttiter zu ergeben. Antigenspezifische IgG-Antikörper in peptidimmunisierten Mäusen wurden durch peptidbasierten ELISA bewertet. Kurz gesagt, 96-Well-ELISA-Platten (Thermo Fisher Scientific) wurden über Nacht bei 48 °C mit 1 mg pro Well von 4 gemischten Peptiden (Peptide 318, 356, 510 und 530) in Carbonatpuffer (pH 9,6) beschichtet. Nach dem Blockieren mit PBS-T, das 5 % fettfreie Milch enthielt, wurden die Vertiefungen mit Serumproben, verdünnt im Verhältnis 1:40, 1 Stunde lang bei 378 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper (Abcam) inkubiert. Reaktionen wurden mit Tetramethylbenzidin-Substrat (Life Technologies) sichtbar gemacht und die Absorption bei 450 nm wurde nach Stoppen der Reaktionen mit 2 mol H2SO4 gemessen.

Pseudovirus-Produktion und Titration

Das Codon-optimierte Gen, das für das Spike-Protein SARS-CoV-2 (NC_045512) oder SARS-CoV (AY291315.1) mit C-terminaler 19-aa-Deletion oder MERS-CoV (JX{{10.1) kodiert }}) Das mit C-terminal 16 aa verkürzte Spike-Protein wurde jeweils in den pcDNA3.1(1)-Vektor kloniert. HEK 293T-Zellen, die in einer 100-mm-Gewebekulturschale kultiviert wurden, wurden mit 1 mg eines Plasmids, das das Spike-Protein kodiert, und 15 mg eines env-defizienten, Luciferase-exprimierenden Rückgrats (pNL4-3.luc.RE) unter Verwendung von Polyethylenimin (Polysciences) cotransfiziert , Warrington, PA). Pseudovirushaltige Zellkulturüberstände wurden 48 Stunden nach der Transfektion gesammelt, filtriert und in Aliquots bei 280 °C gelagert. Zur Bestimmung der Virustiter (50 % Gewebekultur-Infektionsdosis) wurden Reihenverdünnungen von Pseudoviren zu 1 3 104 Huh7-Zellen gegeben, die in 96--Wellplatten vorgeimpft waren. Nach 12 Stunden Infektion wurde das virushaltige Medium durch ein frisches Wachstumsmedium ersetzt und die Zellen wurden weitere 48 Stunden lang kultiviert. Die Luciferase-Aktivität der Zelllyse wurde mit dem Steady-Glo-Luciferase-Assay-System (Promega, Madison, Wisc) unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (BioTek Instruments, Winooski, Vt) gemessen, und es wurden Vertiefungen berücksichtigt, die relative Lumineszenzeinheiten erzeugen, die höher als das Zehnfache des durchschnittlichen Hintergrundwerts sind positiv.

PseudoviRus-Neutralisierungstest

Hitzeinaktivierte Serumproben von COVID-19-Patienten oder gesunden Spendern wurden 2-fach seriell verdünnt und mit 200 Pseudoviren bei 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis für 1 Stunde bei 378 °C inkubiert. Die Mischungen wurden dann angewendet, um Huh7-Zellen zu infizieren, die zuvor in 96--Well-Platten in zweifacher Ausfertigung ausgesät worden waren. Die Vertiefungen wurden 12 Stunden nach der Infektion mit frischem Wachstumsmedium aufgefüllt und die Luciferase-Aktivität der Zellen wurde 48 Stunden später bestimmt. Die 50 %-Neutralisationstiter (NT50) gegen SARS-CoV-2 und SARS-CoV-Pseudoviren wurden durch nichtlineare Regression mit der Software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornien) berechnet; und der NT50 des MERS-CoV-Pseudovirus wurde als die höchste Serumverdünnung definiert, die zu einer 50-prozentigen Reduzierung der relativen Lumineszenzeinheiten im Vergleich zur Viruskontrolle ohne Auftragen von Serumproben führte.

Protein-Microarray-basierter Zytokinnachweis

Die quantitative Messung mehrerer Zytokine (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g und TNF-a) in Serumproben wurde unter Verwendung eines Multiplex-ELISA-Arrays (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, mit Zytokin-spezifischen Antikörpern vorbeschichtete Glasobjektträger wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Probenverdünnungsmittel blockiert, gefolgt von der Zugabe von 60 ml 2-fach verdünnten Serumproben oder Zytokin-Standardverdünnungen. Nach der Inkubation über Nacht bei 48 °C wurden die Objektträger fünfmal gewaschen und mit 80 ml biotinyliertem Detektionsantikörper-Cocktail und anschließend Cy3-äquivalentem farbstoffkonjugiertem Streptavidin 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit dem Microarray-Scanner InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Illinois) bei 532 nm erfasst und die Daten wurden mit der Q-Analyzer-Software (RayBiotech) analysiert.

Peptidsynthese und Konjugation mit Rinderserumalbumin

Insgesamt 515 Peptide (15 Aminosäuren lang, 11 Aminosäuren überlappend), die das SARS-CoV-2-Proteom abdecken, wurden von GL Biochem (Shanghai, China) auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von SARS-CoV synthetisiert -2 Stamm Wuhan-Hu-1. Die Peptide wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung des Vernetzers Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers konjugiert. Kurz gesagt, Sulfo-SMCC wurde mit einem {{11}fachen molaren Überschuss zu BSA hinzugefügt, gefolgt von einer Dialyse zu PBS. Anschließend wurde das Cystein enthaltende Peptid im Verhältnis 1:1 (Gew./Gew.) zugegeben, 2 Stunden lang inkubiert und weiter mit PBS dialysiert, um freie Peptide zu eliminieren.

Herstellung von Peptid-Microarrays

Zur Vorbereitung des Peptid-Mikroarrays werden Peptide von SARS-CoV-2 sowie die Negativkontrolle (BSA) und Positivkontrollen (Anti-Human-IgG- und Anti-Human-IgM-Antikörper; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) verwendet. wurden dreifach auf PATH-Substratobjektträgern (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) unter Verwendung eines Super Marathon-Druckers (Arrayjet, Edinburgh, Schottland, Vereinigtes Königreich) immobilisiert. Anschließend wurden die Peptid-Mikroarrays zur weiteren Verwendung bei 280 °C aufbewahrt.

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Microarray-basiertes Epitop-Mapping

Die Microarray-basierte Serumanalyse wurde wie Li et al.37 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Um individuelle Kammern für die identischen Subarrays zu schaffen, wurde auf jedem Peptid-Microarray-Objektträger eine 14-Kammer-Gummidichtung angebracht. Die Objektträger-Arrays wurden vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt und dann 3 Stunden lang mit 3 % BSA in PBS-T blockiert. Die Serumproben von COVID-19-Patienten oder gepoolte Seren von 20 gesunden Spendern (Kontrollgruppe) wurden für die meisten Proben im Verhältnis 1:200 in PBS-T verdünnt und dann mit jedem Subarray 2 Stunden lang bei inkubiert 48C. Die Arrays wurden mit PBS-T gewaschen und mit Cy3--konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG und Alexa Fluor 647-konjugiertem Esel-Anti-Human-IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania) bei einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert jeweils 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Nach der Inkubation wurden die Arrays mit PBS-T gewaschen und dann durch Zentrifugation bei Raumtemperatur vollständig getrocknet. Anschließend wurden die Arrays mit einem LuxScan 10K-A Microarray-Scanner (CapitalBio, Peking, China) gescannt und die FL-Fluoreszenzintensitätsdaten wurden mit der GenePix Pro 6.0-Software (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien) erfasst und analysiert.

ABBILDUNG 1. Längsdynamik der Antikörperreaktionen bei COVID-19-Patienten. Ein Schema des Studiendesigns. Insgesamt wurden 31 SARS-CoV-2-infizierte Personen und 20 gesunde Spender in die Studie aufgenommen. Bei 20 Patienten von 31 SARS-CoV-2-infizierten Personen wurde die Serumprobenentnahme in Längsrichtung zu mehreren Zeitpunkten durchgeführt, während bei den anderen 11 Patienten die Probenahme zu einem einzigen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Die Anzahl der Teilnehmer und die in den verschiedenen Tests verwendeten Serumproben werden aufgeführt. B und C: Insgesamt 101 Serumproben von 31 COVID-19-Patienten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mittels ELISA auf SARS-CoV-2 N-Protein (B) und S-Protein (C)-bindende IgG-Antikörper getestet nach Symptombeginn (Tage 1-30, n 5 37; Tage 31-61, n 5 18; Tage 100-150, n 5 21; Tage {{21 }}, n 5 25). Als Kontrollgruppe wurden Serumproben von 20 gesunden Spendern einbezogen. D, NT50 gegen SARS-CoV-2-Pseudoviren im Zeitverlauf wurde durch nichtlineare Regression berechnet. E: Die Verteilung der neutralisierenden Aktivität im Serum bei COVID-19-Patienten zu angegebenen Zeitpunkten nach Krankheitsbeginn wird dargestellt. Proben mit einem NT50-Titer unter 20 wurden als nicht neutralisierend definiert

Peptid-Microarray-Datenanalyse

Die IgG- und IgM-Daten wurden jeweils analysiert. Die Signalintensität jedes Spots wurde als Vordergrund minus Hintergrund definiert und die drei Spots für jedes Peptid gemittelt. Der Grenzwert für die positive Peptidantwort von COVID-19-Proben wurde auf das Doppelte der Signalintensität der gesunden Spenderkontrolle festgelegt. Peptide mit positiven Raten über 80 % unter den Proben, die zu allen drei Probenahmezeitpunkten (Tage 10-60, 100-150 und 180-220 nach Ausbruch der Krankheit) getestet wurden, wurden als dominante und persistente Peptide und Peptide mit definiert Eine positive Antworthäufigkeit von über 60 % zu allen 3-Zeitpunkten wurde als subdominant und anhaltend angesehen. Die durchschnittliche Signalintensität jedes Peptids in drei Probenzeitpunktgruppen wurde berechnet; Es wurden auch Peptide ausgewählt, die eine hohe Signalintensität zeigten (über dem Mittelwert von 1 Standardabweichung der Signalintensitäten aller getesteten Proben). Die Datenverarbeitung und -analyse wurde mit der Software R v3.6.3 (https://www.r-project.org/) durchgeführt und signifikante Signalintensitätsänderungen zwischen verschiedenen Stichprobenzeitpunktgruppen wurden basierend auf Limma ausgewertet. Unterschiede mit P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Immunisierung von Mäusen

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden von Beijing Vitalstar Biotechnology (Peking, China) gekauft. Alle Mäuse wurden in speziellen pathogenfreien Einrichtungen gehalten und die Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Tianjin Medical University (Tianjin, China) genehmigt. Zur Immunisierung wurden Gruppen von Mäusen (n 5 5) intramuskulär 25 mg pro Dosis jedes Peptids (Peptide 318, 356, 510 bzw. 530) gemischt mit 50 mg Alaun (InvivoGen, San Diego, Kalifornien) injiziert. und 10 mg CpG-Adjuvantien und zweimal mit 50 mg Peptiden pro Dosis in Gegenwart von Adjuvantien in Abständen von 2- Wochen verstärkt. Als Negativkontrolle diente die alleinige Impfung mit Adjuvantien. Seren wurden von immunisierten Mäusen am Tag 10 oder Tag 14 nach der zweiten und dritten Immunisierung gesammelt.

Statistische und strukturelle Analysen

Alle Diagramme wurden mit GraphPad Prism erstellt. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen in den Abbildungen 1, 2 und 4 wurden mittels 1-way ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleich durchgeführt. Die in Abb. 1, Abb. E9 und Abb. E10 im Online-Repository unter www.jacionline.org dargestellten Korrelationen wurden durch Pearson-Korrelationsanalyse ermittelt. Unterschiede mit P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Strukturen des SARS-CoV-2-Spike-Proteins (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX und PDB-ID: 6ZGI) und die Dimerisierungsdomäne von SARS-CoV{{ 13}} Nukleokapsidprotein (PDB-ID: 6YUN) wurden verwendet, um die Strukturdetails identifizierter Epitope zu analysieren, die sich auf dem Spike-Protein und der Dimerisierungsdomäne des Nukleokapsidproteins befinden. Sequenzausrichtung und Homologieanalyse zwischen verschiedenen menschlichen Coronaviren wurden mit dem Clustal W-Algorithmus in der Software MEGA v10.1.6 durchgeführt.

ERGEBNISSE

Eine SARS-CoV-2-Infektion induziert eine anhaltende antigenspezifische Bindung und neutralisierende Antikörper

Um die Antikörperreaktionen nach einer SARS-CoV-2-Infektion im Längsschnitt zu bewerten, wurden 101 Serumproben von 31 Personen mit PCR-bestätigter SARS-CoV-2-Infektion entnommen (Abb. 1, A). Zu den Studienteilnehmern gehörten 26 Patienten mit mittelschwerem COVID-19, 1 mit asymptomatischem Verlauf, 2 mit leichter Erkrankung und 2 mit schweren Symptomen (siehe Tabelle E1 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Die an dieser Studie teilnehmenden Patienten waren zwischen 17 und 66 Jahre alt (Durchschnittsalter 45 Jahre), wobei die Verteilung männlicher (51,6 %) und weiblicher (48,4 %) Probanden ungefähr gleich war. Zu den häufigsten Symptomen bei den Studienteilnehmern gehörten Fieber (83,9 %), Husten (67,7 %), Myalgie (22,6 %) und Schüttelfrost (22,6 %), mit einer durchschnittlichen Krankheitsdauer von 15 Tagen. Insgesamt 90 Serumproben von 20 COVID-19-Patienten wurden während des Krankenhausaufenthalts und der Entlassung nach der Genesung zu mehreren Zeitpunkten bis zu 219 Tage nach Symptombeginn gesammelt (Abb. 1, A und siehe Tabelle E2 im Online-Repository). Die Probenahme der anderen 11 Teilnehmer erfolgte zu einem einzigen Zeitpunkt während der späten Rekonvaleszenz (Tage 122 bis 214 nach Symptombeginn). Zusätzlich wurden Proben von 20 gesunden Spendern mit übereinstimmender Alters- und Geschlechtsverteilung als Kontrollgruppe einbezogen (Tabelle E1). Antigenspezifische IgG-Antikörper in Serumproben wurden durch ELISA quantifiziert, die mit SARS-CoV-2 N-Protein oder S-Protein vorbeschichtet waren. Im Vergleich zu gesunden Spendern wurden bei COVID-19-Patienten innerhalb von 30 Tagen nach Auftreten der Symptome sowohl Anti-N- als auch Anti-S-IgG-Antikörper mit einem geometrischen mittleren Endpunkttiter von 4,10 (log10 Anti-N-IgG) entwickelt 4,20 (log10-Anti-S-IgG) (Abb. 1, B und C; und siehe Tabelle E3 im Online-Repository unter www.jacionline.org; Abb. E1, A und B; und Abb. E2), in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen zur Serokonversion tritt 1 bis 2 Wochen nach der SARS-CoV-2-Infektion auf.5,38 Danach sanken die Antigen-bindenden Antikörpertiter im Laufe der Zeit in unterschiedlichem Maße. Bei COVID-19-Patienten wurden schnell und dramatisch sinkende Anti-N-IgG-Antikörperspiegel beobachtet, während im Vergleich zu gesunden Spendern bis zu 180 bis 220 Tage nach Krankheitsbeginn höhere Werte an Anti-S-IgG-Antikörpern aufrechterhalten wurden (Abb. 1, B , und C). Die Korrelationsanalyse ergab eine signifikante Korrelation zwischen log10-Anti-N-IgG-Titern und Anti-S-IgG-Titern (r 5 0.50 und P < .001; Abb. 1, F). Zusätzlich zur Quantifizierung bindender Antikörper wurde die Dynamik funktioneller neutralisierender Antikörper bei Personen mit COVID-19 mithilfe von pseudotypisiertem SARS-CoV-2 weiter bestimmt. Über 95 % der Patientenserumproben (35/37), die zwischen 4 und 30 Tagen nach Symptombeginn entnommen wurden, zeigten starke neutralisierende Aktivitäten gegen SARS-CoV-2, und ein großer Teil der Proben zeigte moderate (NT50 80-320 ) bis starke (NT50 > 320) neutralisierende Aktivität (Abb. 1, D und E). Bemerkenswert ist, dass 2 Proben ohne oder mit niedrigen neutralisierenden Titern (NT50 bei einer minimalen Serumverdünnung von 1:20) zu einem frühen Zeitpunkt nach der Virusinfektion (am 4. und 11. Tag nach Symptombeginn) entnommen wurden, bevor starke neutralisierende Antikörper hervorgerufen wurden (Abb 1, D und Abb. E1, C). Obwohl die Konzentration neutralisierender SARS-CoV-Antikörper bei COVID-Patienten im Laufe der Zeit abnahm, waren die meisten Patientenserumproben (24/25), die 180 bis 220 Tage nach Symptombeginn entnommen wurden, nachhaltig positiv für die Neutralisierung gegen SARS-CoV. CoV-2, mit einer 2,8-fachen Abnahme der geometrischen mittleren NT50-Titer (Abb. 1, D und E; Tabelle E3; Abb. E3). Wie erwartet wurde im Vergleich zu Anti-N-IgG-Antikörpern eine stärkere Korrelation zwischen SARS-CoV-2 S-bindenden IgG-Titern und neutralisierenden Antikörpertitern festgestellt (r 5 0.61 und P < .001; Abb. 1 , G und H), im Einklang mit den Erkenntnissen, dass das SARS-CoV-2 S-Protein das Hauptziel neutralisierender Antikörper ist. Das S-Protein von SARS-CoV-2 hat eine hohe Sequenzähnlichkeit mit hochvirulentem SARS-CoV (76 % Sequenzidentität) und zeigt eine geringe Sequenzhomologie zu MERS-CoV (34 % Sequenzidentität). Es wurde über serologische Kreuzreaktivität zwischen Coronaviren berichtet;8,10,28,29 allerdings sind die Daten zur Längsschnittbewertung der Kreuzreaktivität von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 gegenüber anderen Coronaviren nach wie vor begrenzt. Wir haben kreuzbindende und kreuzneutralisierende Antikörper in Längsseren von SARS-CoV-2–infizierten Personen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80 % der Patientenserumproben innerhalb eines Monats nach Symptombeginn an S-Proteine ​​von SARS-CoV und/oder MERS-CoV banden, wobei 27 % der Proben eine doppelte Kreuzreaktivität aufwiesen (Abb. 1, I). Bei den in einem frühen Zeitraum (1-30 Tage nach Ausbruch der Krankheit) getesteten Proben war die Reaktivität gegenüber SARS-CoV-S-Protein größer (73 %) als bei MERS-CoV (35 %) (Abb. 1, I). Die doppelt kreuzbindenden und SARS-CoV-kreuzbindenden Antikörper zeigten im Laufe der Zeit einen allmählichen Rückgang, wobei nur 8 % doppelt kreuzbindende und 20 % SARS-CoV einfach kreuzbindende Proben 180 bis 220 Tage nach Ausbruch der Krankheit stammten (Abb. 1). , I; im Online-Repository unter www.jacionline.org, siehe Abb. E4, A; Abb. E5, A; und Abb. E6 im Online-Repository dieses Artikels unter www.jacionline.org). Interessanterweise blieb die Positivität der MERS-CoV S-Protein-reaktiven Antikörper über die Zeit relativ konstant (Abb. 1, I). Abgesehen von der hohen Kreuzbindungskapazität führten nur wenige Patientenserumproben zu kreuzneutralisierten SARS-CoV- und/oder MERS-CoV-Pseudoviren (Abb. 1, I; Abb. E4, B; Abb. E5, B; und siehe Abb. E7 in der). Online-Repository). Ungefähr 27 % der Proben, die 1 bis 30 Tage nach Symptombeginn entnommen wurden, zeigten kreuzneutralisierende Aktivität, und diese Zahl sank auf 20 % nach 180 bis 220 Tagen, wobei dramatischere Veränderungen in der kreuzneutralisierenden Aktivität von SARS-CoV auftraten (Abb. 1, I ). Ein höherer Anteil der Proben kreuzneutralisierte SARS-CoV als MERS-CoV innerhalb von 30 Tagen nach Ausbruch der Krankheit. Es ist erwähnenswert, dass trotz ähnlicher Anteile von Proben, die eine Kreuzneutralisierung von SARS-CoV und MERS-CoV zeigten, die NT50-Werte für MERS-CoV bei Serumproben, die positiv für eine Kreuzneutralisierung waren, viel niedriger waren als die von SARSCoV (Abb. E4, B; Abb. E5, B; Abb. E7).

Cistanche-Pflanze stärkt das Immunsystem

Eine SARS-CoV-2-Infektion führt zur Aktivierung der Zytokinproduktion

Um die immunologischen Veränderungen nach einer SARS-CoV-2-Infektion umfassend zu charakterisieren, haben wir außerdem Veränderungen in der Dynamik der Zytokinspiegel in Seren von COVID-19-Patienten untersucht. Für den Nachweis der Zytokinproduktion mittels proteinbasiertem Mikroarray wurden 55 Längsserumproben verwendet, die innerhalb der ersten zwei Monate nach Auftreten der Symptome entnommen wurden. Im ersten Krankheitsmonat wurden erhöhte Serumspiegel mehrerer Zytokine beobachtet, darunter IL-1a (proinflammatorisch), IL-6 (proininflammatorisch) und IL-10 (antiinflammatorisch). ), die bei schweren COVID-19-Fällen mit dem Zytokinfreisetzungssyndrom in Verbindung gebracht wurden,39,40 sowie IFN-g (TH1-Typ) und IL-4 (TH2-Typ) (Abb. 2, A, und Abb. E8 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Insbesondere stiegen die Serumspiegel von IL-6, IL-10 und IFN-g innerhalb von 15 Tagen nach Einsetzen der Symptome bei Patienten an und sanken in späteren Phasen, während die Freisetzung von IL-1 Es wurde gezeigt, dass a und IL-4 16 bis 30 Tage nach Ausbruch der Krankheit deutlich erhöht waren und danach schnell auf den Normalwert abfielen (Abb. 2, A). Die Korrelationsanalyse zeigte einen schwachen oder keinen linearen Zusammenhang zwischen antigenspezifischen Antikörperreaktionen und der Zytokinproduktion nach einer SARS-CoV-2-Infektion, obwohl eine statistische Signifikanz zwischen den IL-10- und SARS-CoV{{ 34}} N-Protein-bindender Antikörper (r 5 0.321 und P < .05), zwischen IL-1b-Produktion und S-Protein-bindendem Antikörper (r 5 20.335 und P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

Die proteomweite Epitopkartierung identifiziert dominante Epitope, die anhaltende humorale Immunantworten bei COVID-19-Patienten vermitteln

Um die Unterscheidungsmerkmale der humoralen Immunität gegen SARS-CoV-2 im Zeitverlauf besser zu charakterisieren, haben wir eine proteomweite Epitopkartierung mithilfe peptidbasierter Mikroarrays durchgeführt. Eine Peptidbibliothek, die das SARS-CoV-2-Proteom abdeckt, wurde generiert und auf Objektträgern immobilisiert, in denen jedes Peptid eine Länge von 15 Aminosäuren mit einer Überlappung von 11 Aminosäuren aufwies. Insgesamt 51 longitudinale Serumproben von 19 Patienten mit entweder asymptomatischer (n 5 1) oder leichter (n 5 2) bis mittelschwerer (n 5 15) oder schwerer (n 5 1) Erkrankung. ) SARS-CoV-2-Infektionen wurden getestet (Tabelle I). Um relativ ausgewogene Probenahmezahlen, -intervalle und -zeitpunkte zu erreichen, wurden Proben nacheinander zu zwei oder drei Zeitpunkten von jedem COVID-18-Teilnehmer im Zeitraum von 16 bis 219 Tagen nach Symptombeginn entnommen. Die Mehrzahl der Patienten (18/19) bildeten nach einer Virusinfektion neutralisierende Antikörper, mit Ausnahme der einzelnen Person mit asymptomatischer Infektion (Tabelle I). Entsprechend den unterschiedlichen Probenahmezeitpunkten wurden die Proben in drei Gruppen eingeteilt: Tage 10-60 (n 5 18), Tage 100-150 (n 5 18) und Tage {{28 }} (n 5 15). Eine Längsschnittbewertung der Virusepitopprofile bei COVID-19-Patienten wurde sowohl für Serum-IgG- als auch für IgM-Antikörper durchgeführt, wobei gepoolte Seren von 20 gesunden Spendern als Negativkontrolle dienten. Unter Verwendung des SARS-CoV-2-Proteom-Mikroarrays wurde die Kinetik der Peptid-bindenden Antikörperantworten bestimmt und auf (1) Bindungssignalintensität und (2) Prozentsatz positiv-reaktiver Proben (Positivrate) für jedes Peptid analysiert . Basierend auf dem Grenzwert für eine positive Peptidbindungsreaktion, der auf das Doppelte der Signalintensität der Negativkontrolle festgelegt wurde, identifizierten wir insgesamt 460 positive Peptide für IgG und 479 positive Peptide für IgM, die mit mindestens einem Patienten reaktiv waren Serumprobe. Positive Peptidzahlen und die Verteilung der Reaktionen über verschiedene offene Leserahmen (ORFs) von SARS-CoV-2 waren in verschiedenen Probengruppen relativ stabil, mit einem Trend zu einem leichten Rückgang der positiven Peptidzahlen im Laufe der Zeit (Abb. 3, A). Die größte Reaktivität wurde beim Replikase-Polyprotein ORF1ab festgestellt, dem größten ORF, der mehr als zwei Drittel des gesamten Genoms umfasst (Abb. 3, A). Interessanterweise beobachteten wir früh nach der SARS-CoV-2-Infektion (Tage 10-60 nach Krankheitsbeginn) einen mäßigen bis starken Grad der Korrelation zwischen positiven Peptidbindungsreaktionen und Serumzytokinspiegeln; siehe Abb. E10 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Es wurde gezeigt, dass die Anzahl der positiv bindenden Peptide für IgM mit den Serumspiegeln von IL-6 und IL-10 zusammenhängt; Ebenso zeigten die durchschnittliche Signalintensität der gesamten reaktiven Peptide und die der ORF1ab-bindenden Peptide für IgM positive Assoziationen mit der IL-6- und IFN-g-Produktion in Serumproben. Diese Daten legen nahe, dass Veränderungen der Zytokinspiegel nach einer SARS-CoV-2-Infektion die Größe und Breite der Epitope beeinflussen können, die von antigenspezifischen humoralen Reaktionen erkannt werden. Basierend auf der Identifizierung positiver Epitope haben wir außerdem die häufigsten Epitope ausgewählt, die in mehr als 80 % der COVID-19-Proben in jeder der drei Probengruppen durchweg reaktiv blieben (als dominante und persistente Epitope bezeichnet). Die Ergebnisse zeigten, dass diese hoch dominanten Epitope, die in der Lage sind, langfristige humorale Immunantworten zu vermitteln, am ORF1ab-Polyprotein und S-Protein von SARS-CoV-2 lokalisiert waren, wobei mehr Epitope von IgM-Antikörpern erkannt wurden (n 5 33) als IgG-Antikörper (n 5 10) (Abb. 3, B und Tabelle II; siehe Abb. E11 und Abb. E12 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Das ORF1ab-Polyprotein besaß die maximale Anzahl dominanter Epitope, die Langzeitreaktionen vermittelten, und Epitope waren breit auf den Regionen der Nichtstrukturproteine ​​(nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14 verteilt. und nbsp 16 (Tabelle II). Insbesondere identifizierten wir ein immundominantes Epitop, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), das von IgG- und IgM-Antikörpern von 100 % der COVID-19-Patienten erkannt werden konnte, unabhängig vom Zeitpunkt der Serumentnahme (Abb 3, B und Tabelle II; siehe Abb. E13 und Abb. E14 im Online-Repository). Dieses hochreaktive Peptid befindet sich in der Helikase-Region (nsp 13) des ORF1ab-Polyproteins, die für das Abwickeln doppelsträngiger RNA-Matrizen während der SARS-CoV-2-Replikation unerlässlich ist.41 Unter den ausgewählten Peptiden von ORF1ab sind zwei immundominante Peptide mit den höchsten durchschnittlichen Signalintensitäten, die von IgG-Antikörpern erkannt werden, Nummer 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) und Nummer 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), befinden sich beide auf NSP 13. Für IgM-Antworten Peptid 685 (ORF1ab, aa 249-263) auf nsp 2 und Peptid 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) auf nsp 13 zeigten die robustesten Bindungsintensitäten (Abb. 3, B). Unter Berücksichtigung der Variation der Basissignale (gepoolte Seren von gesunden Spendern) für verschiedene Peptide (Abb. 3, B) haben wir außerdem die fachen Änderungen der Signalintensitäten für jedes Schlüsselpeptid im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Peptid 2073 (IgG-Bindung) und Peptid 1985 (IgM-Bindung), die sich in der NSP-13-Region befinden, die höchsten Peptidbindungsintensitäten (Fachveränderung) unter den Patientenseren aufrechterhielten, die bis zu 180 bis 220 Tage lang gesammelt wurden (Abb. E13 und Abb. E14).

FIG 2. Kinetik der Zytokinproduktion bei COVID-19-Patienten. A: Die Zytokinproduktionsniveaus in 55 Serumproben von 16 COVID-19-Patienten während der akuten Phase und einem frühen Stadium der Rekonvaleszenz wurden durch einen auf Protein-Microarrays basierenden ELISA nachgewiesen (Tage 1-15, n 5 11; Tage 16-30, n 5 26; Tage 31-61, n 5 18; gesunde Spender, n 5 20). Jeder Punkt stellt eine einzelne Serumprobe dar; Die gestrichelten Linien geben die Nachweisgrenze an. Die statistische Signifikanz wurde durch 1-Weg-ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichen bestimmt. *P < .05, **P < .01 und ****P < .0001. B, fache Änderung jedes Zytokinproduktionsniveaus bei COVID-19-Patienten, gezeigt in (A), im Vergleich zu den Mittelwerten von 20 Proben von gesunden Spendern. Jede Spalte gibt eine bestimmte Serumprobe an, die zu angegebenen Zeitpunkten nach dem Einsetzen der Symptome entnommen wurde; Jede Zeile stellt ein einzelnes getestetes Zytokin dar.

TABELLE I. Merkmale von COVID{0}}-Patienten und Probenkohorten bei der Epitopkartierung

ABB. 3. IgM- und IgG-Erkennung dominanter Epitope, die zu langfristigen Antikörperreaktionen bei SARS-CoV-2-infizierten Personen beitragen. Längsschnittanalyse der Serumerkennung von Epitopen bei 19 Personen mit COVID-19 unter Verwendung eines Peptid-Mikroarrays, das das Proteom von SARS-CoV-2 abdeckt. Der Grenzwert für die positive Reaktion der Peptidbindung in Patientenproben (n 5 51) ​​wurde auf das Doppelte der Signalintensität der gepoolten Seren von 20 gesunden Spendern festgelegt. A, Peptidzahlen und Verteilung positiv bindender Peptide, die in einer oder mehreren Proben nachweisbar waren, die nach 10-60 Tagen (n 5 18), 100-150 Tagen (n 5 18) gesammelt wurden. und 180- 220 Tage (n 5 15) nach Krankheitsbeginn. Die Zahlen geben die Gesamtzahl der identifizierten IgG- und IgM-Epitope aus jedem ORF an. B: Signalintensitäten dominanter und persistierender IgG- und IgM-Epitope (x-Achse), die in mehr als 80 % der Proben innerhalb aller drei Probenahmezeitpunkte nachhaltig reaktiv waren. Jeder Punkt gibt die gepoolten Seren von gesunden Spendern (oben) oder eine bestimmte Patientenserumprobe an, die zu den angegebenen Zeitpunkten nach Auftreten der Symptome entnommen wurde. E, Hüllprotein.

TABLE II. Epitopes with >80 % positive Rate an allen 3 Probenahmezeitpunkten

Dominante und persistente Epitope des SARS-CoV-2 S-Proteins befinden sich an den NTD- und S2-Untereinheiten

Insgesamt wurden 4 dominante und persistente Epitope des SARSCoV-2 S-Proteins identifiziert: Peptid 318 (S, aa 45-59) und Peptid 356 (S, aa 197-211), die lokalisiert sind innerhalb der NTD-Region; Peptid 510 (S, aa 813-827), das die S2'-Spaltungsstelle und Teile des FP der S2-Untereinheit abdeckt, und Peptid 530 (S, aa 893-907), das sich in der Verbindungsregion befindet zwischen FP und der ersten Heptad-Repeat-Region der S2-Untereinheit (Abb. 3, B und Tabelle II). Unter diesen Schlüsselpeptiden des S-Proteins, die wir ausgewählt haben, besaß Peptid 318, das sich an der NTD des S-Proteins befindet, die robusteste Bindungsintensität (fache Änderung im Vergleich zur Kontrolle; Abb. E13 und Abb. E14). Strukturanalysen ergaben, dass diese Epitope vollständig auf der Oberfläche des monomeren S-Proteins exponiert sind; Allerdings sind einige Reste von Epitopen für die Peptide 318, 356 und 530 unter der Oberfläche des trimeren S-Proteins verborgen (Abb. 4, A und B), was darauf hindeutet, dass sowohl S-Monomer- als auch Trimerstrukturen unter bestimmten Umständen vom Immunsystem des Wirts effizient erkannt werden Umstände. Genauer gesagt liegen zwei Schleifensegmente des Peptids 318 (aa 45-46 und aa 56-59) auf dem trimeren S-Protein frei, wobei der zentrale b-Strang darin verborgen ist; und die meisten Reste des Peptids 356 sind auf der Oberfläche zugänglich, einschließlich eines Kern-b-Strangs (aa 203-209) und eines Schleifensegments (aa 210-211). Peptid 510 enthält eine S2'-Spaltungsstelle und eine zentrale FP-Helix, die beide vollständig auf der Oberfläche des S-Proteins präsentiert werden; Reste des Peptids 530 sind größtenteils kryptisch, wobei nur ein kleiner Teil der Schleife (aa 893-895) auf dem trimeren S-Protein exponiert ist (Abb. 4, C). Die Sequenzhomologieanalyse zwischen 7 häufigen menschlichen Coronaviren ergab, dass zwei Epitope an der S2-Untereinheit (Peptide 510 und 530) eine hohe Sequenzidentität mit anderen Coronaviren aufweisen, was auf eine serologische Kreuzreaktivität zwischen menschlichen Coronaviren hindeutet, die auf diese Epitope abzielt (Abb. 4, D). Die Sequenz von Peptid 318 wies eine hohe Ähnlichkeit mit SARSCoV auf, während bei Coronaviren ein geringer Grad an Sequenzhomologie für Peptid 356 gezeigt wurde, was auf SARS-CoV-2–spezifische Antikörperantworten schließen lässt, die auf diese Region abzielen (Abb. 4, D). Unter Berücksichtigung neu auftretender und zirkulierender SARS-CoV-2-Varianten weltweit führten wir außerdem einen Sequenzabgleich in Bezug auf Schlüsselepitope des S-Proteins zwischen dem frühen SARS-CoV-2-Stamm (Wuhan-Hu{{52}) durch. }) und 5 besorgniserregende Varianten (Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron) sowie 2 interessante Varianten (Lambda und Mu), gemäß der Klassifizierung der Virusvarianten der Weltgesundheitsorganisation (aktualisiert am 30. November 2021). ). Die Ergebnisse zeigten, dass die Sequenzen dieser dominanten und persistenten Epitope bei den analysierten Varianten nahezu identisch sind, mit Ausnahme einer einzelnen N211I-Mutation, die in der neuen Omicron-Variante identifiziert wurde (Abb. 4, E). Diese Daten deuten darauf hin, dass von frühen SARS-CoV-2-Stämmen erzeugte Antikörper möglicherweise konsistent aktuelle zirkulierende Varianten erkennen und dass diese dominanten Epitope in der Lage sein könnten, anhaltende langfristige Antikörperreaktionen bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 zu vermitteln. Varianten. Um die immunologischen Eigenschaften der identifizierten Epitope auf dem S-Protein weiter zu bestimmen und den potenziellen Wert dieser S-Protein-Epitope als Peptid-Impfstoffkandidaten weiter zu untersuchen, führten wir eine Mausimmunisierungsstudie mit ausgewählten Peptiden durch. BALB/c-Mäuse wurden dreimal mit jedem Peptid in Gegenwart von Alaun und CpG-Adjuvantien geimpft (Abb. 4, F). Unter den vier ausgewählten Peptiden löste die Impfung mit Peptid 356 nach der zweiten und dritten Dosis Antigen-spezifische Antikörper aus (Abb. 4, G). Die Ergebnisse des Serumneutralisationstests zeigten, dass die Immunisierung mit linearen Peptiden keine signifikanten Mengen an neutralisierenden Antikörpern gegen SARS-CoV-2 erzeugte (Abb. 4, H), was darauf hindeutet, dass diese linearen Peptide bei der Auslösung robuster neutralisierender Antikörperreaktionen schlecht abschneiden.

Dem N-Protein von SARS-CoV-2 fehlen die meisten reaktiven Epitope, die dauerhafte Antikörperreaktionen nach einer Virusinfektion vermitteln

Eine Reihe von Studien hat die starke Antigenität des SARS-CoV-2-N-Proteins aufgeklärt.4,11,12 Allerdings konnten wir anhand der aktuellen Auswahlkriterien keine dominanten und persistenten Epitope identifizieren, die sich am N-Protein befinden (über 80 % positive Rate an allen 3 Probenahmezeitpunkten). Zur Längsschnittauswertung der Epitopprofile des N-Proteins bei Personen mit COVID-19 führten wir eine zweite Runde des Epitop-Screenings durch, das auf Daten aus dem Peptid-Microarray zur Auswahl subdominanter Epitope basierte, die durchweg eine positive Reaktivität aufwiesen in mehr als 60 % der COVID-19-Proben für jeden der 3 Probenahmezeitpunkte (als subdominante und persistente Epitope bezeichnet). Insgesamt wurden 4 subdominante und persistente Epitope des SARS-CoV-2 N-Proteins identifiziert, darunter das Peptid 2455 (N, aa 213-227), das bei COVID{{16) eine Reaktivität sowohl gegenüber IgG- als auch IgM-Antikörpern zeigte }} Patienten mit relativ höherer Signalintensität (Abb. 5, A und B und siehe Tabelle E4 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Die beiden überlappenden Peptide, Peptid 2455 (N, aa 213-227) und Peptid 2456 (N, aa 217-231), befinden sich in der Ser/Arg-reichen Linkerregion zwischen der N-terminalen RNA-Bindungsdomäne und C-terminale Dimerisierungsdomäne des N-Proteins. Peptid 2482 (N, aa 321-335) und Peptid 2491 (N, aa 357-371) liegen ganz oder teilweise innerhalb der Dimerisierungsdomäne des N-Proteins (Tabelle E4). Aufgrund des Fehlens von 3-D-Strukturen bezüglich der intakten Konformation des N-Proteins führten wir nur Strukturanalysen von 2 identifizierten Epitopen auf der dimeren Struktur der C-terminalen Dimerisierungsdomäne durch. Reste des Peptids 2482 bilden zwei b-Stränge, die antiparallel an den Dimerisierungsgrenzflächen angeordnet sind, während aa 357-364 des Peptids 2491 helixbasierte Strukturen bilden, die sich an gegenüberliegenden Enden des Dimers befinden (Abb. 5, C). . Der Sequenzabgleich zwischen dem frühen SARS-CoV-2 (Stamm Wuhan-Hu-1) und sieben aufkommenden Varianten ergab außerdem, dass die Sequenzen dieser subdominanten und persistenten Epitope im N-Protein unter den aktuell zirkulierenden Varianten nahezu identisch sind, mit a einzelne G215C-Substitution von Peptid 2455, die in der Delta-Variante auftritt, und eine einzelne G214C-Mutation von Peptid 2455, die in der Lambda-Variante identifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass Antikörper, die auf diese Peptide abzielen, möglicherweise Antigene neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten erkennen (Abb. 5, D ).

Abb. 4. Dominante Epitope des SARS-CoV-2-Spike-Proteins im Hinblick auf die Vermittlung dauerhafter humoraler Immunantworten. A und B: Positionen der dominanten und persistenten Epitope auf 3-D-Strukturen des monomeren (A) und trimeren (B) S-Proteins (PDB-ID: 6VXX). Epitope werden in Grün (Peptid 356, AA 197-211), Rot (Peptid 318, AA 45-59), Blau (Peptid 510, AA 813-827) und Lila (Peptid 530, AA) hervorgehoben 893-907). Die drei S-Monomere in geschlossener Konformation sind jeweils in Grau, Rosa und Cyan dargestellt. C: Detaillierte Strukturanalyse dominanter Epitope im SARS-CoV-2 S-Protein im geschlossenen Zustand des S-Trimers (PDB-ID: 6VXX). D, Sequenzabgleich identifizierter Epitope unter häufigen menschlichen Coronaviren. Epitopreste, die zwischen SARS-CoV-2 und anderen menschlichen Coronaviren konserviert sind, sind grau schattiert. E: Epitopkonservierungsanalyse des frühen SARS-CoV-2 (Stamm Wuhan-Hu-1) und 7 neu auftretende Varianten. Schwarze Punkte stellen identische Reste zwischen dem Stamm Wuhan-Hu-1 und dem angegebenen dar.

ABB. 5. Subdominante Epitope am SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein sind in der Lage, anhaltende Antikörperreaktionen zu vermitteln. A-, IgG- und IgM-Erkennungshäufigkeiten subdominanter Peptide (dauerhaft reaktiv in mehr als 60 % der Proben) in Patientenserumproben, die zu mehreren Zeitpunkten nach Ausbruch der Krankheit entnommen wurden. B: Signalintensitätskinetik identifizierter subdominanter Epitope im Zeitverlauf. Jeder Punkt stellt eine eindeutige Patientenserumprobe dar, die von COVID-19-Patienten zu angegebenen Zeitpunkten nach Symptombeginn entnommen wurde. Gepunktete horizontale Linien zeigen die Cutoff-Werte der positiven Reaktion für jedes Peptid an. C, Detaillierte Strukturanalyse von Epitopen auf der C-terminalen Dimerisierungsdomäne des N-Proteins (PDB-ID: 6YUN). Epitope sind blau (Peptid 2482, aa 321-335) ​​und braun (Peptid 2491, aa 357-364) markiert. Die beiden Monomerstrukturen sind in Grau bzw. Cyan dargestellt. D, Sequenz-Alignment-Analyse der identifizierten N-Protein-Epitope zwischen dem frühen SARS-CoV-2 (Stamm Wuhan-Hu-1) und 7 neuen Varianten. Schwarze Punkte kennzeichnen identische Sequenzen zwischen dem Wuhan-Hu-1-Stamm und der angegebenen Variante. Änderungen in der Aminosäuresequenz werden rot hervorgehoben.

ABB. 6. Liner-Epitope mit hoher Bindungsintensität und abnehmenden reaktiven Frequenzen im Laufe der Zeit, erkannt von SARS-CoV-2-infizierten Personen. A und B: Längsschnittanalyse und Verteilung der identifizierten Peptide, die eine hohe Bindungssignalintensität aufweisen (über dem Mittelwert von 1 SD der Signalintensitäten aller getesteten Proben), aber mit der Zeit abnehmende positive Rate. Die Erkennungshäufigkeit (A) und Signalintensität (B) von Epitopen wurden mit 3 Probenahmezeitpunkten nach Symptombeginn aufgezeichnet. Jeder Punkt in (B) steht für eine individuelle Patientenserumprobe, die zu angegebenen Zeitpunkten nach Symptombeginn entnommen wurde; Gepunktete horizontale Linien zeigen Cutoff-Werte der Positivität für jedes Peptid an. Die statistische Signifikanzanalyse wurde basierend auf der Software Limma of R v3.6.3 durchgeführt. *P < .05 und **P < .01. C, Standort- und Sequenzvergleiche von zwei benachbarten Epitopen, Peptid 510 (dominant und persistent) und Peptid 511 (hohe Signalintensität und mit der Zeit abnehmende Positivität), auf der SARS-CoV-2 S-Proteinstruktur (PDB-ID: 6ZGI) . Die überlappenden Regionen zwischen den beiden Epitopen werden grün hervorgehoben; Einzigartige Sequenzen sind rot und blau gekennzeichnet.

Die serologische Längsschnittanalyse identifiziert Epitope mit hoher Signalintensität, aber mit der Zeit abnehmender Reaktivität

Zusätzlich zu den ausgewählten hochreaktiven Epitopen, die für die oben erwähnten anhaltenden humoralen Immunantworten verantwortlich sind, haben wir außerdem eine Gruppe von 9 positiven Peptiden identifiziert und charakterisiert, die robuste Bindungsintensitäten (über dem Mittelwert von 1 SD der Signalintensitäten aller getesteten Proben) zeigten ein Trend zu abnehmender Reaktivität (positive Ratenänderungen über 20 %) bei Serumproben von COVID-19-Patienten im Laufe der Zeit, entsprechend einem allgemeinen Trend zum Nachlassen humoraler Immunantworten. Diese Epitope sind innerhalb der drei dominanten Antigene positioniert: ORF1ab-, S- und N-Proteine ​​(Abb. 6, A; und siehe Tabelle E5 im Online-Repository unter www.jacionline.org). Darüber hinaus wurde eine signifikante Verringerung der Signalintensität von 4 Peptiden aus den Proteinen ORF1ab (Peptide 784-IgG, 1617-IgM und 1986-IgM) und N (Peptid 2457-IgG) beobachtet zwischen Proben aus einem frühen Zeitraum der Probenahmezeitpunkte (Tage 10-60 nach Ausbruch der Krankheit) und der späteren Phase der Probenahmezeitpunkte (Tage 100-150 oder Tage 180-220 nach Symptombeginn) (Abb. 6 , B). Bemerkenswert ist, dass zwei Peptide des S-Proteins Peptid 510 (dominant und persistent; Abb. 3, B) und Peptid 511 (hohe Signalintensität und mit der Zeit abnehmende positive Rate; Abb. 6, A) trotz weitgehender Überlappung unterschiedliche Muster aufwiesen Reaktivität zwischen Patientenserumproben im Laufe der Zeit. Sequenz- und Ortsanalysen zeigten, dass Peptid 510 eine S2'-Spaltungsstelle und zusätzliche Aminosäuren von 813-SKRS-816 enthält, während Peptid 511 vollständig innerhalb des FP mit verlängertem 828-LADA{{29) liegt }} Reste, die vollständig auf der Oberfläche des trimeren S-Proteins freiliegen (Abb. 6, C). Diese Ergebnisse enthüllten neue Merkmale von Epitopen, die letztendlich zu einer länger anhaltenden und stärkeren humoralen Immunität gegen SARS-CoV beitragen könnten-2.

DISKUSSION

Eine systematische Charakterisierung langfristiger Immunantworten auf eine SARS-CoV-2-Infektion ist entscheidend für die Entwicklung verbesserter Diagnostika, wirksamer therapeutischer Interventionen und Impfstoffe. In der aktuellen Studie führten wir eine umfassende Längsschnittanalyse von COVID-19-Patienten über einen Zeitraum von 180 bis 220 Tagen durch und zeigten anhaltende humorale Immunantworten und eine aktivierte Zytokinproduktion nach einer Virusinfektion.

Bezeichnenderweise haben wir durch die Nutzung des peptidbasierten Mikroarrays, das das Proteom von SARS-CoV-2 umspannt, die Kinetik der Epitoperkennung weiter aufgedeckt und eine Reihe dominanter Epitope identifiziert, die in der Lage sind, eine langfristige humorale Immunität zu vermitteln. Die Ergebnisse, die wir hier über die Langlebigkeit humoraler Immunantworten nach einer SARS-CoV-2-Infektion berichten, bestätigen einige zuvor veröffentlichte Daten5,10,12,13,42, erweitern sie jedoch durch die Durchführung einer umfassenden serologischen Profilierung und eines Epitop-Screenings unter Verwendung von Längsserumproben von Personen mit COVID-19 durch den proteomweiten Microarray-Ansatz. In dieser Studie haben wir vier dominante Epitope (Peptide 318, 356, 510 und 530) innerhalb des SARS-CoV-2 S-Proteins identifiziert, die bei mehr als 80 % der COVID-19-Patienten zu einer dauerhaften Reaktion fähig waren Proben bis zu 180 bis 220 Tage nach Symptombeginn getestet. Peptid 510 (S, aa 813-827), das die S2-Spaltungsstelle und das FP der S2-Untereinheit umfasst, wurde häufig in früheren Studien anderer Gruppen identifiziert.26,28,32-34 Funktionsanalysen deuteten auf Antikörper hin Das Targeting dieser Region kann eine begrenzte Neutralisierungswirkung gegen SARS-CoV aufweisen-226,33 obwohl es auf der Oberfläche des S-Proteins stark exponiert ist (Abb. 4, AC). Im Fall des Peptids 530 (S, aa 893-907), das zwischen dem FP und der ersten Heptad-Repeat-Region der S2-Untereinheit positioniert ist, sind Reste im Allgemeinen in der trimeren Struktur des S-Proteins vergraben, wodurch es entsteht über robuste neutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV-2 schwer zugänglich (Abb. 4, AC). Darüber hinaus wurden auch 2 S1-NTD-gerichtete Peptide ausgewählt, die langfristige Antikörperreaktionen von SARS-CoV-2 vermitteln könnten. Analysen hinsichtlich der Peptidsequenz und -position zeigten, dass Reste dieser beiden Peptide – Peptid 318 (S, aa 45-59) und Peptid 356 (S, aa 197-211) – in unmittelbarer Nähe zu den gemeldeten erkannten Epitopen liegen durch infektionsverstärkende Antikörper23,25, aber abgesehen von den Schlüsselstellen hochwirksamer neutralisierender Antikörper, die auf NTD der S1-Untereinheit abzielen,16,19,43 was auf die Möglichkeit einer Epitoperkennung durch nichtneutralisierende Antikörper gegen diese beiden identifizierten Peptide hindeutet. Zusätzlich zu den oben genannten Details zeigte die Immunisierung von Mäusen mit ausgewählten Peptiden außerdem die geringe Wirksamkeit dieser linearen Peptide ohne Rezeptorbindungsdomäne bei der Auslösung robuster neutralisierender Antikörperreaktionen (Abb. 4, G). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass dominante lineare Epitope, die langfristige humorale Immunantworten bei einer SARS-CoV-2-Infektion vermitteln, wahrscheinlich Antikörper ohne oder mit begrenzter neutralisierender Wirkung induzieren. Ein umfassenderes Verständnis der Epitoplandschaft von SARS-CoV-2-Antikörpern, insbesondere von S-Protein-gerichteten Epitopen, liefert neue Einblicke in die funktionelle Zerlegung von Antikörpern, was das innovative und rationale Impfstoffdesign weiter erleichtert. Neutralisierende Antikörper bieten Schutz bei der Eliminierung viraler Infektionen, wohingegen nicht neutralisierende Antikörper eine vorteilhafte, neutrale oder sogar schädliche Rolle bei der Virusbeseitigung spielen können. Nichtneutralisierende Antikörper bieten in vivo zusätzlichen Schutz durch eine Reihe von Fc-vermittelten Effektorfunktionen im Zusammenhang mit antikörperabhängiger Phagozytose und antikörperabhängiger Zytotoxizität. Im Gegensatz dazu deuten einige Studien auf die Möglichkeit einer pathogenen Rolle nicht neutralisierender Antikörper bei einer Coronavirus-Infektion hin. Frühere Studien mit mehreren Arten von Impfstoffkandidaten für SARS-CoV und MERS-CoV beobachteten eine verstärkte Immunpathologie bei geimpften Kleintieren und nichtmenschlichen Primaten nach der Virusexposition.24,44-50 In jüngerer Zeit berichteten Studien an zwei Gruppen über eine nicht neutralisierende Wirkung Antikörper, die auf NTD des SARS-CoV-2 S-Proteins abzielen, waren in der Lage, Virusinfektionen in vitro durch Fcg-Rezeptor-unabhängige Mechanismen zu verstärken,23,25 obwohl in Tiermodellen gezeigt wurde, dass passiv verabreichte infektionsverstärkende Antikörper vor SARS schützen -CoV-2-Infektion in vivo. Angesichts der umstrittenen Rolle von Antikörpern während einer Coronavirus-Infektion sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die mögliche Rolle von Antikörpern bei der Erkennung dieser dominanten und persistenten Epitope bei der Bekämpfung von Virusinfektionen in vivo zu validieren. Die nächste Stufe des rationalen Impfstoffdesigns für SARS-CoV-2 könnte durch die Erzeugung hochwirksamer neutralisierender Antikörper und schützender nicht neutralisierender Antikörper zusammen mit einer Verringerung der Präsentation infektionsverstärkender Epitope oder immundominanter Epitope, die keine haben, konzipiert werden wohltuende Wirkungen. Obwohl sich eine Reihe früherer Studien nur auf das S-Protein von SARS-CoV-2 konzentrierten, um die Funktionen von Antikörpern in Bezug auf die Neutralisierung abzugrenzen, führten wir eine umfassende proteomweite Epitopkartierung durch und identifizierten eine Reihe von Epitopen innerhalb des ORF1ab-Polyproteins wurde im Laufe der Zeit durchweg von einem hohen Anteil an Patientenserumproben erkannt. Obwohl diese ORF1ab-gerichteten Peptide, die auf mehreren nichtstrukturellen Proteinen verteilt sind, möglicherweise keine funktionellen Antikörper hervorrufen, die auf das SARS-CoV-2-Virion abzielen, könnten sie als diagnostisches Instrument zur Unterscheidung einer natürlichen Infektion von einer Impfung eingesetzt werden. Angesichts der steigenden Zahl von Impfstoffempfängern weltweit stehen aktuelle serologische Tests, die auf dem S-Protein und dem N-Protein basieren, vor Herausforderungen als wirksamer Ansatz zur Unterstützung molekularer Tests zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion und auch für die Bestimmung des Immunstatus nach einer Virusinfektion. Durch die Nutzung der häufigsten und anhaltend reaktiven Peptide innerhalb des ORF1ab bei COVID-infizierten Personen wird die serologische Diagnose natürlicher Infektionen ohne Berücksichtigung des Impfstatus mit Rezeptorbindungsdomänen-basiertem S-Protein durchgeführt. Impfstoffansätze auf Basis von inaktivierten Viren und auf Basis von inaktivierten Viren. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die Reaktivität, Sensitivität und Spezifität der identifizierten ORF1ab-Peptide in größeren Kohorten zu bewerten, die sowohl SARSCoV-2-infizierte Personen als auch Impfstoffempfänger umfassen. Darüber hinaus ist eine weitere Bewertung der Nachweiseffizienz durch mehrere Peptidkombinationsstrategien erforderlich, um die geringere Empfindlichkeit von Peptiden im Vergleich zum Volllängenprotein und die mögliche Kreuzreaktivität zwischen häufig vorkommenden menschlichen Coronaviren zu überwinden. Die größten Einschränkungen unserer Studie bestehen darin, dass relativ wenige Proben aus einer kleinen Patientenkohorte entnommen wurden und die Mehrheit der Teilnehmer an nicht schweren COVID-Erkrankungen litt. Dies könnte einige unserer Schlussfolgerungen hinsichtlich der Häufigkeit positiver Reaktionen und des Ausmaßes der Immunantworten einschränken, die je nach Schwere der Erkrankung variieren können. Dennoch liefern die in dieser Studie präsentierten Daten wertvolle Einblicke in die Kinetik von Immunantworten im Zeitverlauf nach einer SARS-CoV-Infektion und in die Merkmale dominanter Epitope, die bei Personen mit COVID eine anhaltende humorale Immunität vermitteln können. Zusammengenommen bieten diese Ergebnisse ein tieferes Verständnis der Langlebigkeit der natürlichen Immunität, die durch eine Virusinfektion hervorgerufen wird, und haben weitreichende Auswirkungen auf innovative Impfstrategien und verbesserte Diagnoseansätze.

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