Metabolitenprofilierung und Anti-Aging-Aktivität von Reis-Koji, fermentiert mit Aspergillus Oryzae und Aspergillus Cristatus: Eine vergleichende Studie Ⅱ
May 09, 2023
3. Diskussion
Verschiedene Teile von Reis, wie Schale, Kleie, Embryo und Endosperm, haben von der Oberfläche bis zum Inneren unterschiedliche chemische Zusammensetzungen (26). Insbesondere Reiskleie enthält verschiedenePhenolsäurenUndFlavonoide, von denen bekannt ist, dass sie auftretenantioxidative Aktivität.Darüber hinaus besteht die Reiszellwand aus einer Arabinoxylan-Struktur, die Xylose, Arabinose, Ferulasäure und Ferulasäure enthält (27). Die Zellwand von Reis ist im Allgemeinen schwer zu durchdringen, und Reis-Koji bietet den Vorteil einer einfachen Penetration Reiszellwand durch verschiedene Enzyme wie Protease und Glucosidase aus Inokulummikroben (24). Daher zeigt Reis-Koiihöhere Werte der Tyrosinase-HemmaktivitätUndantioxidative Aktivitätenals seine Rohstoffe, da es wertvolle angereicherte Verbindungen enthält (28.
Wir folgten dem Metabolomik-Ansatz für Reis-Koji, der mit zwei verschiedenen Fadenpilzen fermentiert wurde, was signifikante Unterschiede in der Enzymaktivität, der Produktion von Metaboliten und der Bioaktivität aufklärte. Die Aktivitäten verschiedener Enzyme wie α-Amylase, β-Glucosidase und β-Glucosidase, die von den inokulierten A. cristatus und A. oryzae produziert werden, nahmen mit der Fermentationszeit zu (Abbildung 3). Da diese Enzyme die Arabinoxylan-Struktur abbauen, wurden in beiden Proben verschiedene Phenolsäuren von der Reiszellwand abgetrennt, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese Phenolsäuren sind potenzielle Antioxidantien, die oxidativen Stress lindern 291. Daher nahmen die antioxidativen Aktivitäten und der TPC-Test zu Verlängerung der Fermentationszeit, da der Phenolsäuregehalt erhöht wurde (Abbildungen 2 und 4). Insbesondere hat RAC einen höheren Gehalt an Flavonoiden als RAO, da es einen höheren Gehalt an -Glucosidase aufweist, die währenddessen die -glykosidische Bindung aus der Reiszellwand hydrolysiert das Wachstum von A. cristatus in Reis-Koji. Zusätzlich zur Ablösung von der Reiszellwand hydrolysiert Glucosidase die Flavonoidglucosidform zu einer Aglyconform, die eine höhere antioxidative Aktivität besitzt 30]. Die erhöhte Flavonoidglucosidform und Aglyconform erhöhen die antioxidativen Aktivitäten wie ABTS, DPPH FRAP und TFC, was sich auf die antioxidative Aktivität von RAC auswirken kann, wie in der Korrelationsnetzwerkkarte gezeigt (Abbildung 4). Dieses Phänomen wurde auch in einer früheren Studie beobachtet, die eine Biotransformation von Glucosid-Isoflavonen zu Aglykonen und zunehmende Muster der antioxidativen Aktivität entsprechend der Mentationszeit in fermentierten Sojabohnen zeigte. cristatus [311.
RAO verfügt über eine höhere a-Glucosidase-Aktivität, die a-glykosidische Bindungen spaltet und automatisch einen höheren Glukosegehalt erzeugt. Abgesehen von der Tatsache, dass Glukose die Hauptkohlenstoffquelle für Pilze ist, sank der Glukosespiegel in RAC nach der Fermentation, da sie für die Synthese von Sekundärmetaboliten wie Auroglaucin-Derivaten verwendet wurde, bei denen es sich um charakteristische Pigmentverbindungen handelt, die von A. cristatus und nicht von A. cristatus produziert werden . oryzne. Frühere Studien haben berichtet, dass Auroglaucin-Derivate eine Aktivität bei DPPH haben und als potenzielle antioxidative Verbindungen angesehen werden [32]. Darüber hinaus könnte die kollabierte Reiszellwand es Enzymen ermöglichen, in die innersten Teile des Reises einzudringen [24]. Daher konnten immer mehr Metaboliten ungehindert und ohne Unterbrechung aus der Reisaußenwand extrahiert werden.
In der Korrelationsnetzwerkkarte zwischen Bioaktivitäten und Metaboliten von RAO und RAC (Abbildung 4) bestand die gemeinsame Tendenz darin, dass Flavonoide, organische Säuren, Zuckerderivate und Fettsäuren als potenzielle Mitwirkende an Bioaktivitäten vorgeschlagen wurden. Flavonoide und Phenolsäuren sind bekannte Antioxidantien und haben hinsichtlich verschiedener Funktionen viele Vorteile. Aufgrund ihrer Fähigkeit, oxidativen Stress zu lindern, werden sie zur Verbesserung der Lebensmittelqualität und zur Linderung der Hautalterung eingesetzt [33]. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie berichtet, dass Fettsäuren und Antioxidantien eine synergistische Wirkung bei der Vorbeugung und Behandlung der Hautalterung haben könnten [34].
Andererseits tragen Auroglaucin und Lysophospholipid-Derivate zusätzlich zu Metaboliten bei RAC bei [35]. Die Auroglaucin-Derivate haben, wie oben erwähnt, antioxidative Wirkungen und daher gehen wir davon aus, dass sie das Potenzial haben, Kettenreaktionen freier Radikale zu stoppen und so Hautstress zu lindern. Yahagi et al. zeigten, dass Lysophospholipide die Hautfeuchtigkeit aufrechterhalten können, indem sie die Expression von Faktoren verbessern, die mit der Hautbarriere und den Feuchtigkeitsfunktionen der Haut verbunden sind [36]. Feuchtigkeit ist ein entscheidender Faktor für eine gesunde Haut, da Trockenheit zu Hautschäden führt, die durch Rauheit, schuppige Haut und feine Falten gekennzeichnet sind [37,38]. Wir gehen davon aus, dass Auroglaucin und Lysophospholipide in der letzten Fermentationsphase bei RAC eine bessere Anti-Aging-Wirkung auf die Haut haben als bei RAO. Zhao et al. zeigten, dass Fuzhuan-Ziegeltee, der den dominanten Pilz A. cristatus enthält, die Lichtalterung durch Unterdrückung von ROS und Auslösung von Nrf2-Signalkaskaden hemmen kann [21]. Daher gehen wir davon aus, dass RAC ein höheres Anti-Aging-Potenzial als RAO bietet, indem es über indirekte Wege wirkt, z. B. indem es bessere Hautbedingungen für reichlich Feuchtigkeit schafft undLinderung des Stresses durch freie Radikale.
Insgesamt glauben wir, dass die erhöhten Fettsäuren, Phenolsäuren, Flavonoide, Lysophospholipide und Hydrochinone die antioxidativen Aktivitäten erhöhen und die RNA-Expression von Elastin und Kollagen verbessern sowie letztendlich die RNA-Expression von MMP-1 unterdrücken können Fermentation. Diese Verbindungen zeigten je nach Inokulumpilz unterschiedliche Muster der Veränderung der Metaboliten und beeinflussten verschiedene Bioaktivitäten. Diese Studie erläuterte den Unterschied im Gesamtstoffwechsel zwischen verschiedenen Arten derselben Aspergillus-Gattung mithilfe eines Metabolomics-Ansatzes. Darüber hinaus beeinflussten unterschiedliche Enzymaktivitäten die Produktion verschiedener Metaboliten und induzierten unterschiedliche Bioaktivitäten in RAO und RAC
4. Materialien und Methoden
4.1. Chemikalien und Reagenzien
4.2. Probenvorbereitung und Extraktion
Die Koji-Schimmelpilze A. oryzae KCCM 11372 (Korean Culture Center of Microorganism, KCCM; Republik Korea) und A. cristatus (Aspergillus cristatus Cosmax-GF vom Cosmax BTI R&I Center; Seongnam, Korea) wurden zur Fermentation von Reis verwendet und separat beimpft . Jeder Mikroorganismus wurde auf Malzextrakt-Agar (Malzextrakt, 20 g; Glucose, 20 g; Pepton, 1 g; Agar, 20 g/L) bei 28 °C gehalten. Der Bioprozess der Fermentationsschritte für die Koji-Produktion wurde von Lee et al. übernommen. [11]. Die mit A. oryzae und A. cristatus fermentierten Reis-Koji-Proben wurden alle 2 Tage (von Tag 0 bis Tag 8) geerntet und bis zur weiteren Analyse bei Tiefkühlbedingungen (–80 °C) gelagert. Alle Proben wurden mit zwei biologischen Replikaten hergestellt.
Die Methode zur Extraktion von Reis-Koji-Proben wurde von Lee et al. übernommen. mit geringfügigen Modifikationen [11]. Kurz gesagt, die pulverisierten gefriergetrockneten Reis-Koji-Proben (5 g) wurden durch Zugabe von 8 0 Prozent wässrigem Ethanol (40 ml) und Rühren auf einem Orbitalschüttler (200 U/min für 24 Stunden) bei Raumtemperatur extrahiert. Nach Zentrifugation der Proben bei 10,000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C wurden die Überstände mit einem 0,22 µm Millex GP-Filter (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) filtriert. Die gefilterten Probenextrakte wurden mit einem Schnellvakuumkonzentrator (Hanil, Seoul, Korea) getrocknet und das Trockengewicht gemessen, um die Extraktionsausbeute zu bewerten.
4.3. GC-TOF-MS-Analyse
Die Derivatisierungsschritte der extrahierten Reis-Koji-Proben entsprachen den von Lee et al. [11]. Die GC-TOF-MS-Analyse wurde auf einem Agilent 7890A GC-System (Santa Clara, CA, USA) mit einem Pegasus HT TOF-MS (Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA) durchgeführt. Das Trägergas (Helium) wurde mit einem RTx-5MS (30 m Länge × 0,25 mm Innendurchmesser, J&W Scientific, Folsom, CA, USA) mit einer konstanten Flussrate von 1,5 ml/min verwendet. Die Temperaturen des Injektors und der Ionenquelle wurden bei 250 bzw. 230 °C gehalten. Die Ofentemperatur wurde 2 Minuten lang bei 75 °C gehalten und dann mit 15 °C/Minute auf 300 °C erhöht, was 3 Minuten lang aufrechterhalten wurde. Anschließend wurde 1 µL der Probe mit einem Massenscanbereich von m/z 50–800 injiziert. Alle Probenanalysen wurden mit drei analytischen Replikaten durchgeführt.
4.4. UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS-Analyse
Die extrahierten Reis-Koji-Proben wurden mithilfe der Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Linearfalle-Quadrupol-Orbitrap-Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS) unter Verwendung der von Kwon et al. beschriebenen Protokolle auf Sekundärmetaboliten analysiert. [39]. Jede Probe wurde mit einer Phenomenex KINETEX® C18-Säule (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm Partikelgröße; Torrance, CA, USA) getrennt. Die Massenspektren und der Photodiodenarray-Bereich sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus wurden auf m/z 100–1000 bzw. 200–600 nm abgestimmt.
4.5. Datenverarbeitung und statistische Analyse
Die rohen GC-TOF-MS- und UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS-Daten wurden mit der Software Leco ChromaTOF bzw. Thermo Xcalibur in das NetCDF-Format (*.cdf) umgewandelt. Die jeweiligen Netto-CDF-Dateien (*.cdf) wurden einer softwaregestützten Datenverarbeitung durch MetAlign (abgerufen am 13. Juli 2021) unter Verwendung der von Lee et al. beschriebenen Protokolle unterzogen. [11,24]. Die massenspektrometrischen Daten, die die geeignete Peakmasse (m/z), Retentionszeiten (min) und Peakflächeninformationen als Variablen darstellen, wurden mit der Software SIMCA-P plus 12 ausgewertet.0 (Umetrics, Umea, Schweden) für multivariate statistische Analysen. Vor der Hauptkomponentenanalyse (PCA), der partiellen Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) und der orthogonalen partiellen Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) wurden die Datensätze logarithmisch transformiert und die Einheitsvarianz skaliert, um den Reis-Koji zu vergleichen mit verschiedenen Pilzen fermentiert. PASW Statistics 18 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) wurde verwendet, um durch einseitige Varianzanalyse auf signifikante Unterschiede (p-Wert < 0.05) zu testen und die Korrelationskoeffizientenwerte zu berechnen für eine Korrelationskarte. Die Korrelationsnetzwerkkarte zwischen Metaboliten, die einen Pearson-Korrelationskoeffizientenwert von mehr als 0,5 haben, und Bioaktivitäten wurde mit der Cytoscape-Software erstellt (https://www.cytoscape.org/ (abgerufen am 13. Juli 2021)). Die Identifizierung vorläufiger Metaboliten erfolgte durch Abgleich der Molekulargewichte und der molekularen Zusammensetzung, der Retentionszeit und der Massenfragmente
Muster und Absorption von ultravioletten (UV) Daten aus der Literatur und unserer hauseigenen Bibliothek
4.6. Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
Enzymatische Aktivitätstests für -Amylase, -Glucosidase und -Glucosidase wurden gemäß früheren Studien durchgeführt [25,40,41]. Eine 10-g-Menge jeder Reis-Koji-Probe wurde in 90 ml Wasser durch einstündiges Schütteln auf einem Orbitalschüttler bei 120 Uhr und 25 °C extrahiert. Nach dem Filtern der Proben wurden die Überstände zur Bewertung der Enzymaktivitäten verwendet.
4.7. Bestimmung der antioxidativen Aktivitäten und des Gesamtgehalts an Phenolen und Flavonoiden
Um die antioxidative Aktivität der Reis-Koji-Proben zu bestimmen, wurden dreifach Tests auf ABTS, DPPH, eisenreduzierende Antioxidationskraft (FRAP), Gesamtphenolgehalt (TPC) und Gesamtflavonoidgehalt (TFC) durchgeführt
Die ABTS- und FRAP-Tests wurden mit der von Lee et al. beschriebenen Methode durchgeführt. [24]. Kurz gesagt: Die ABTS-Stammlösung wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine Endabsorption von 0,7 ± 0,02 bei 750 nm (180 µL) zu erreichen zu jedem Probenextrakt (20 µL) in einer 96-Wellplatte hinzugefügt. Die Reaktion konnte 6 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur stattfinden. Die Absorption wurde bei 750 nm mit einem Spektrophotometer gemessen. Für den FRAP-Assay wird eine Mischung aus 300 mM Acetatpuffer (pH 3,6), 20 mM Eisen(III)-chlorid und 10 mM 2,4,6-Tripyridyl-S-triazin (TPTZ)-Lösung in 40 mM HCl verwendet (10:1:1, v/v/v) wurden hergestellt. Die Probe (10 µL) wurde mit 300 µL FRAP-Reagenz gemischt und 6 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen. Der DPPH-Assay wurde nach der von Won et al. adaptierten Methode durchgeführt. [42], wobei 180 µL der DPPH-Stammlösung (0,2 mM in Ethanol) mit 20 µL Reis-Koji mit zwei verschiedenen Pilzextrakten in 96-Well-Platten gemischt und 20 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen wurden im Dunkeln. Die Absorption freier Radikale durch DPPH wurde bei 515 nm gemessen. Die Ergebnisse von ABTS, FRAP und DPPH werden als Trolox-äquivalente Antioxidanskapazität (TEAC)-Konzentration (mM) pro Milligramm Koji dargestellt. Die Standardkonzentrationskurven reichten von 0,0078 mM bis 1 mM TEAC.
Für die TFC- und TPC-Assays wurde eine von Lee et al. verwendete Methode verwendet. [25] wurde befolgt. Für den TFC-Assay wurden 20 µL jeder Reis-Koji-Probe mit 20 µL 1 N NaOH und 180 µL 90 Prozent Diethylenglykol gemischt eine 96-Well-Platte. Nach 60-minütiger Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 405 nm gemessen. TFC wird als Naringin-Äquivalent (NE)-Konzentration (mM) pro Milligramm Koji angegeben. Die Standardkonzentrationskurve war zwischen 0,0027 und 0,3445 mM NE linear. Für die Analyse des TPC-Assays wurden 20 µL jeder Probe mit 100 µL 0,2 N Folin-Ciocalteu-Reagenz in 96-Well-Platten bei Raumtemperatur 6 Minuten lang inkubiert. Dann wurden 80 µL einer 7,5-prozentigen Natriumcarbonatlösung (Na2CO3) zu der Mischung gegeben und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Abschließend wurde die Absorption bei 750 nm bewertet. Die Ergebnisse werden als Gallussäureäquivalent (GE)-Konzentrationen (mM) pro Milligramm Koji in einem Standardkonzentrationsbereich von 0,0230–2,9391 mM GE angegeben.
4.8. Zellkulturen
4.9. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
Zur Isolierung und Quantifizierung der Gesamt-RNA aus den Zellpellets wurde Trizol-Reagenz verwendet und die Analyse erfolgte mit einem Spektrophotometer. Die cDNA-Synthese wurde in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µL durchgeführt; Das Reaktionsgemisch bestand aus 2 µg Gesamt-RNA, Oligo (dT) und Reverse-Transkriptions-Vormischung unter den folgenden Reaktionsbedingungen: 45 °C für 45 Minuten, gefolgt von 95 °C für 5 Minuten. Zur Quantifizierung der Genexpression wurde RT-PCR verwendet und die Ergebnisse anschließend mit der Systemsoftware StepOne PlusTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert. RT-PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung von SYBR Green PCR Master Mix mit vorgemischtem ROX (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) und Primern (Bioneer, Daejeon, Korea) in einem ABI 7300-Gerät gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Start bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von Zyklusbedingungen von 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden für 40 Zyklen. -Aktin wurde als interne Kontrolle verwendet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Reis-Koji je nach verwendeter Aspergillus-Art unterschiedliche Metaboliten und Bioaktivitäten produziert. Die höheren Ebenen vonFlavonoideund Auroglaucin-Derivate in RAC führten zu höheren Wertenantioxidative Aktivitätals in RAO. Darüber hinaus sind die synergistischen Wirkungen von Fettsäuren undantioxidative Verbindungenin beiden Koji gefunden wurden, waren mit der RNA-Expression des verbundenAnti-Aging-Faktor der Haut. Auroglaucin-Derivate und Lysophospholipide, die in RAC gefunden wurden, waren ebenfalls Kandidaten, die damit in Zusammenhang stehen könntenRNA-Expression von Haut-Anti-Aging-Faktoren. Obwohl Reis-Koji mit Mitgliedern derselben Gattung (Aspergillus) fermentiert wird, gibt es daher erhebliche Unterschiede in den Enzymaktivitäten und Metaboliten der verschiedenen Arten, und diese wirken sich ausBioaktivitätenwie zum BeispielAntioxidansUndAnti-Aging-Aktivitäten. Daher liefert diese Studie umfassende Einblicke sowie die Logik für eine rationale Auswahl der Impfmikroben in Bezug auf
Metabolomik, um die Qualität der kommerziellen Produktion von Koji zu verbessern.
Zusatzmaterialien:Folgendes ist online verfügbar unter Abbildung S1: Das PLS-DA-Score-Diagramm (A, B) und das OPLS-DA-Score-Diagramm (C) für ReisKojifermentiert mitAspergillus cristatusoderA. oryzaewurden durch UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS (A,C) und GC-TOF-MS (B) erhalten., Tabelle S1: Liste signifikant unterschiedlicher Metaboliten aus ReisKojimit unterschiedlichenAspergillus spp. während der Fermentation, identifiziert durch UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS, Tabelle S2: Liste der signifikant unterschiedlichen Metaboliten aus ReisKojimit unterschiedlichenAspergillus spp. während der Fermentation, identifiziert durch GC-TOF-MS, Abbildung S2: Korrelationskarte der Bioaktivitäten (Hautzelleffekt und antioxidative Aktivität) und ReisKojifermentiert mitAspergillus cristatusoderA. oryzaeMetaboliten gemäß dem Pearson-Korrelationskoeffizienten. Jedes Quadrat gibt die Pearson-Korrelationskoeffizientenwerte (r) an.
Autorenbeiträge:Konzeptualisierung, CL und SL; Methodik, HL, SL, SK (Seoyeon Kyung) und JR; Validierung, HL, SL und SK (Seoyeon Kyung); formale Analyse, HL und SK (Seoyeon Kyung); Untersuchung, HL und SL; Ressourcen, JR, SK (Seunghyun Kang) und MP; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, HL; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, HL und SL; Visualisierung, HL; Supervision, SL und CL; Projektverwaltung, SK (Seunghyun Kang), MP und CL; Finanzierungseinwerbung, CL Alle Autoren haben die Veröffentlichung gelesen und sind damit einverstandenVersion des Manuskripts.
Finanzierung:Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) durch das Agricultural Microbiome R&D Program (The Strategic Initiative for Microbiomes in Agriculture and Food) unterstützt, das vom Ministerium für Landwirtschaft, Ernährung und ländlichen Raum finanziert wird Angelegenheiten (MAFRA) (Fördernummer 918011-04-3-HD020). Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry (IPET) durch das High Value-added Food Technology Development Program unterstützt, das vom Ministerium für Landwirtschaft, Ernährung und ländliche Angelegenheiten (MAFRA) finanziert wird. (Förderungsnummer 318027-04-3-HD030)
Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage beim erhältlichKorrespondierender Autor
Danksagungen:Diese Forschung wurde vom Konkuk University Researcher Fund in unterstützt2020.
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