MiR-199-3p verbessert die Muskelregeneration und lindert gealterte Muskeln und Muskeldystrophie

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Parabiose-Experimente legen nahe, dass molekulare Faktoren im Zusammenhang mit Verjüngung und Alterung im Blut zirkulieren. Hier zeigen wir, dass miR-199-3p, das als zellfreie miRNA im Blut zirkuliert, im Blut älterer Mäuse im Vergleich zu jungen Mäusen signifikant verringert ist; und miR-199-3p hat die Fähigkeit dazu zur Verbesserung der myogenen Differenzierung und Muskelregeneration. Die Verabreichung von miR-199-Nachahmern, die miR-199-3p liefern, an gealterte Mäuse führte zu Muskelfaserhypertrophie und verzögertem Verlust der Muskelkraft. Die systemische Verabreichung von miR-199-Mimetika an mdx-Mäuse, ein bekanntes Tiermodell der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), verbesserte die Muskelkraft von Mäusen deutlich. Zusammengenommen kann zellfreies miR-199-3p im Blut eine Anti-Aging-Wirkung wie eine hypertrophe Wirkung auf gealterte Muskelfasern haben und könnte Potenzial als neuartiges RNA-Therapeutikum für DMD sowie altersbedingte Krankheiten haben. Die Ergebnisse liefern uns neue Einblicke in im Blut zirkulierende miRNAs als altersbedingte Moleküle.

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Lebenswichtige Funktionen wie Muskelkraft, Funktion des Nervensystems, Atmungsfunktion, Infektionsabwehr und Widerstandskraft gegen Krankheiten nehmen mit zunehmendem Alter ab. Krankheiten und Funktionsstörungen, die mit einem solchen Funktionsabfall einhergehen, nehmen zu und werden zu großen Problemen in alternden Gesellschaften. Mit zunehmendem Alter treten im Körper verschiedene Veränderungen auf, z. B. Änderungen des Stoffwechsels und der Genregulation. Die Untersuchung solcher Veränderungen kann helfen, das Altern zu verstehen und Strategien zur Bewältigung der Probleme zu entwickeln, mit denen alternde Gesellschaften konfrontiert sind. Biomoleküle (einschließlich Gene) im Zusammenhang mit dem Altern wurden identifiziert und können in der Alternsforschung nützlich sein; zB sind -galactosidase- und plolnk4a-Expression mit zellulärer Seneszenz assoziiert4-6, und ein Mausmodell, dem das Klotho-Gen fehlt, ist als Alterungsmodell mit einer Reihe von Phänotypen bekannt, die dem vorzeitigen Altern des Menschen ähneln.

Parabiose ist die Vereinigung zwischen zwei Individuen, die ein gemeinsames Gefäßsystem teilen, und kann experimentell durch einen chirurgischen Eingriff erzeugt werden8. Experimente mit Parabiose, bei denen junge und alte Nagetiere zusammengebracht wurden, um ein gemeinsames Gefäßsystem zu teilen, zeigten, dass der Alterungsprozess bei jungen Tieren beschleunigt wurde, während ältere Tiere verjüngt wurden9-12. Die Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass bestimmte Faktoren im Zusammenhang mit Verjüngung und Alterung vorhanden sind und mit dem Blut im Gefäßsystem zirkulieren; solche zirkulierenden Faktoren sind jedoch noch nicht vollständig verstanden13.

Cistanche kann Anti-Aging

MicroRNAs (miRNAs) sind 21-23-nukleotidlange kleine nicht-kodierende RNAs, die aus längeren Transkripten (primären miRNAs) durch Verdauung, mit einem Mikroprozessorkomplex im Zellkern und Dicer im Zytoplasma, verarbeitet und eingebaut werden der RNA-induzierte Silencing-Komplex (RISC)14,15. MiRNA in RISC fungiert als Mediator beim Gen-Silencing, wobei die Translation von Boten-RNAs (mRNAs) mit teilweiser Komplementarität zur miRNA gehemmt wird oder mRNAs, die nahezu komplementäre Sequenzen zur miRNA tragen, sind verdautl4,15.Cistanche-Extrakt gegen StrahlungSomit spielen miRNAs eine wichtige Rolle bei der Genregulation, indem sie ihre Zielgenexpression unterdrücken. Tausende von miRNA-Genen wurden in Tieren und Pflanzen gefunden [siehe microRNA-Datenbank (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Das Expressionsprofil von miRNAs wurde untersucht und eine gewebe- und entwicklungsstadienspezifische Expression sowie eine krankheitsassoziierte Expression von miRNAs nachgewiesen16-21. Die Genregulation, an der miRNAs beteiligt sind, steht in engem Zusammenhang mit verschiedenen Vitalfunktionen und Lebensphänomenen, einschließlich Krankheiten14,16,21-24

MiRNAs sind sowohl außerhalb als auch innerhalb der Zellen vorhanden25. Beispielsweise liegen miRNAs als zellfreie Nukleotide im Blut vor und zirkulieren im Gefäßsystem2627. Solche zellfreien miRNAs (cf-miRNAs) werden in kleine Vesikel, sogenannte extrazelluläre Vesikel, eingebaut oder mit Proteinen assoziiert, wodurch sie vor extrazellulären Nukleasen geschützt werden25,28. Das Vorhandensein einiger cf-miRNAs kann signifikant sein; Beispielsweise wurden signifikante Zusammenhänge zwischen cf-miRNAs und bestimmten Krankheiten festgestellt26,27,29-31. Cf-miRNAs können Veränderungen des körperlichen Zustands widerspiegeln; daher können solche miRNAs potenzielle Biomarker für die Überwachung von Lebenserhaltungssystemen sowie von Krankheiten sein.

Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um Zusammenhänge zwischen cf-miRNAs und Alterung zu untersuchen, und cf-miRNAs im Blut von jungen und alten Mäusen wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten Veränderungen in cf-miRNAs zwischen jungem und gealtertem Mausblut. Unter solchen miRNAs war miR-199-3p in gealtertem Blut im Vergleich zu jungem Blut deutlich verringert. Interessanterweise hat miR-19-3p die Fähigkeit, die Muskeldifferenzierung und -regeneration zu verbessern, und seine Verabreichung an gealterte Mäuse führte zur Expansion der Muskelfasern. Als miR-199-3p in mdx-Mäuse, ein Tiermodell der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), eingeführt wurde, wurde die Muskelkraft von Mäusen deutlich verbessert. Die vorliegende Studie liefert neue Einblicke in blutzirkulierende cf-miRNAs in Bezug auf Alterung, latente Fähigkeiten und medizinische Anwendungen.

Ergebnisse

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23- Monate alte) C57BL/6J-Mäuse, die mithilfe von DNA-Microarray altersbedingte Unterschiede identifizierten. Das Profil von cf-miRNAs zeigte deutliche Unterschiede zwischen jungen und alten Mäusen, dh es wurden cf-miRNAs nachgewiesen, die auf junges und altes Mausblut ausgerichtet sind (Tabelle 1). Von solchen miRNAs waren myogene miRNAs (z. B. miR-1 und miR-133)1833 in der miRNA-Gruppe vorhanden, die in jungem Blut reichlich vorhanden ist; mit anderen Worten, myogene miRNAs waren deutlich weniger in gealtertem Blut (Tabelle 1).cistanche herbaDer Unterschied in den miRNAs zwischen jungem und gealtertem Blut wurde durch quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR; Abb. la) bestätigt und unter Verwendung von RNA-Quellen, die aus kleinen Vesikeln, sogenannten Exosomen, extrahiert und aus dem Plasma isoliert wurden, weiter reproduziert ( Ergänzende Abb.1).

Andererseits zeigten Zellkulturexperimente, dass junges Mausserum die Fähigkeit hatte, myogene Differenzierung zu induzieren, und die Fähigkeit war stärker als die von gealterten Mäusen (Abb. 1b). Der insulinähnliche Wachstumsfaktor I (IGF-I), der ein wichtiger Faktor ist, der in der Lage ist, myogene Differenzierung im Blut zu induzieren34,35, wurde untersucht; es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen jungem und gealtertem Blut beobachtet (Fig. 1c). Daher können andere Faktoren als IGF-I in jungem Blut an der myogenen Differenzierung beteiligt sein.

miR-199-3p ist in der Lage, myogene Differenzierung stark zu induzieren. Wir untersuchten die Auswirkungen von miRNAs, die in jungem Blut reichlich vorhanden sind, auf die myogene Differenzierung. Synthetische miRNA-Mimetika wurden in C2C12-Zellen, eine Maus-Myoblasten-Zelllinie, eingeführt und die Expression von myogenen Differenzierungsmarkern, den Genen Myogenin (Myog) und Myosin Heavy Chain 1 (Myh1), untersucht. Die Ergebnisse waren unerwartet und weckten unser Interesse: miR-199-3p, das aufgrund der wenigen Informationen zur myogenen Differenzierung als negative miRNA vorhergesagt wurde, induzierte deutlich die Expression von Myog und Myh1 (Abb. 2a, b). Außerdem war die Induktion von miR-199-3p stärker als die von konventionellen myogenen miRNAs: Die Expression der schweren Kette von Myosin in Gegenwart von miR-199-3p war besonders bemerkenswert (Abb. 2b, c).

Um die Beziehung zwischen miR-199-3p und myogener Differenzierung zu klären, untersuchten wir zelluläre und extrazelluläre (exosomale) miR-199-3p während der myogenen Differenzierung sowie die Wirkungen von miR-199-3p-Inhibitoren auf die Differenzierung. Die Expression von endogenem (zellulärem) miR-199-3p wurde nach Beginn der Differenzierung hochreguliert. Das exosomale miR-19-3p wurde einmal erhöht und danach verringert (ergänzende Abb. 2a). Die Inhibitorbehandlung unterdrückte die Expression der myogenen Differenzierungsmarker Myog, Myh1 und Kreatinkinase (Ckm) (Ergänzende Abb. 2b).Wachstum des Cistanche-PenisSomit legen die Ergebnisse nahe, dass miR-199-3p an der myogenen Differenzierung beteiligt ist.

Entwerfen von Mimics für miR-199. Wir haben miR-199-Mimetika so entworfen, dass die Mimetika miR-199-3p effizient als funktionellen Mediator (Leitstrang) beim Gen-Silencing produzieren können. Die entworfenen miRNA-Mimetika wurden gescreent und miR199#4 wurde als kompetente miR-199-Mimetik ausgewählt (ergänzende Abb. 3). Anschließend wurde miR199#4 sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Experimenten verwendet.

Zielgene von miR-199-3p bei der myogenen Differenzierung. Um Zielgene für miR-199-3p unter myogener Differenzierung zu identifizieren, suchten wir nach Kandidatengenen aus der TargetScan-Datenbank und konzentrierten uns auf die Gene Lin28b und Suz12, die beide in C2C12-Myoblasten exprimiert werden. Lin28b und Suz12 besitzen mutmaßliche miR-199-3p-Bindungssequenzen in ihrer 3'-untranslatierten Region (UTR; Fig. 3a). Wir haben gezeigt, dass die mutmaßlichen Sequenzen authentische Bindungsstellen für miR-19-3p sind, indem wir die Luciferase-Reportergene verwendeten, die die Bindungssequenzen und entsprechende fehlgepaarte Sequenzen tragen (Abb. 3a, b). Die Luciferase-Gene, die die mutmaßlichen Bindungssequenzen tragen, wurden durch miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) und pSuz12-(973)] signifikant unterdrückt, während die fehlgepaarte Sequenzen, die Basensubstitutionsmutationen in der Samen-[pLin28b-(81)mut,-Region besitzen, heben ihren Unterdrückungseffekt auf [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, und wenn miR-199-Mimetika in C2Cl2-Zellen eingeführt wurden, wurde die Expression von Lin28b und Suz12 konsequent unterdrückt (Abb. 3c). Um zu beurteilen, ob die Unterdrückung von Lin28b und/ oder Suz12 direkt zur myogenen Differenzierung beiträgt, wurde die spezifische Hemmung von Lin28b und Suz12 durch Gen-Silencing unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi; Abb. 3d, e) durchgeführt. Wie erwartet wurde die Expression von myogenen Differenzierungsmarkern wie Ckm, Myh1 und Myog unter Lin28b- und Suz12-Gen-Silencing hochreguliert (Abb. 3f, g).

Da Lin28b ein RNA-bindendes Protein ist, das an der Verarbeitung von miRNAs3637 beteiligt ist, untersuchten wir die Auswirkungen von miR-19-Mimetika über Lin28b auf die myogene miRNA-Verarbeitung. Der Spiegel von miR-1, einer wichtigen myogenen miRNA, wurde untersucht, da die Verarbeitung ihres Vorläufers durch Lin28b37 reguliert wird. Ausgereiftes miR-1 wurde durch die Mimic-Behandlung mit miR-199 signifikant erhöht (Abb. 3h), was darauf hindeutet, dass miR-199-3p die funktionelle Expression von miR-1 durch Unterdrückung regulieren kann seines Ziels Lin28b. Zusammengenommen legen die Ergebnisse nahe, dass miR-199-3p an der myogenen Differenzierung durch Unterdrückung seiner Zielgene Lin28b und Suz12 beteiligt ist.

Verbesserung der Muskelregeneration durch miR199#4 bei Mäusen mit Muskelverletzung.Cistanche-Salsa-VorteileWir untersuchten die Wirkungen eines miR-199-Mimetikums (miR199#4) in vivo unter Verwendung von Muskelverletzungsmodellen (Abb. 4a, b). Acht Wochen alten C57BL/6J-Mäusen wurde BaClz in den Tibialis anterior (TA) injiziert, um eine Muskelverletzung zu induzieren, und miR19#4 wurde 24 Stunden später an den beschädigten Stellen verabreicht. Zwei Tage nach der Verabreichung von miR199#4 wurde die Expression von myogenen Markergenen untersucht. Die Myog-Expression war signifikant erhöht und die myogene Differenzierung 1 (Myod1) und der myogene Faktor 5 (Myf5) wurden ebenfalls durch die Verabreichung von miR199#4 hochreguliert (Abb. 4c). Die Daten stimmen mit den oben beschriebenen In-vitro-Ergebnissen überein (Fig. 2).

Die immunhistochemische Analyse der sich regenerierenden Muskeln wurde 9 Tage nach der Verabreichung von miR199#4 durchgeführt. Untersucht wurden die durch zentrale Kerne gekennzeichneten Querschnittsflächen regenerierender Muskelfasern (Myofasern) (Abb. 4b). Die mittlere Querschnittsfläche der regenerierenden Myofasern, die mit miR199#4 behandelt wurden, war größer als die der Kontrollmyofasern, die mit einem Non-Silencing-Kontroll-RNA-Duplex behandelt wurden (nsCont; Abb. 4d), wobei sich der Unterschied einer statistischen Signifikanz näherte. Zusätzlich zur mittleren Querschnittsfläche zeigte das nach Größe unterteilte Histogramm der Querschnittsfläche eine Zunahme vergrößerter Muskelfasern in Gegenwart von miR199#4 (Abb. 4e).

Hypertrophe Wirkung von miR199#4 auf gealterte Muskelfasern. Wir untersuchten die Auswirkungen von miR199#4 auf alte Mäuse (~24 Monate alt). Ältere Mäuse zeigten im Vergleich zu jungen Mäusen eine signifikante Abnahme des Muskel-miR-199-3p (Abb. 5a), wie bei cf-miR-19-3p im Blutkreislauf. Wir verabreichten miR199#4 den TA-Muskeln alter Mäuse, und 2 Tage später wurden die TA-Muskeln durch immunhistochemische Analyse untersucht (Abb. 5b). Die mittlere Querschnittsfläche der mit miR199#4 behandelten Muskelfasern war signifikant größer als die der mit nsCont behandelten Kontrollmuskeln (Abb. 5c). In Übereinstimmung damit zeigte die größengeteilte Histogrammanalyse einen deutlichen Anstieg vergrößerter Muskelfasern in Gegenwart von miR199#4 (Abb. 5d).

Da das im Blut zirkulierende cf-miR-199-3p bei gealterten Mäusen reduziert ist, führten wir miR199#4 über die Schwanzvene in das zirkulierende Blut gealterter Mäuse ein. Nach der intravenösen Verabreichung von miR19#4 wurde die Querschnittsfläche der Muskelfasern wie oben beschrieben untersucht und analysiert. Die Ergebnisse, wie in Abb. 5e gezeigt, stimmen mit den Ergebnissen der lokalen Verabreichung von miR199#4 an gealterte Muskeln überein (Abb. 5c, d).

Es sollte beachtet werden, dass es einen Unterschied in vergrößerten Muskelfasern zwischen dem Muskelverletzungsmodell und gealterten Mäusen gibt. Zentralkerne sind in sich regenerierenden Muskelfasern zu sehen (Abb. 4b), aber solche Myofasern wurden bei gealterten Mäusen, die mit miR199#4 behandelt wurden, kaum nachgewiesen (Abb. 5b). Dies deutet darauf hin, dass bereits vorhandene Muskelfasern bei älteren Mäusen nach der miR199#4-Behandlung vergrößert werden können. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein anderer Mechanismus als die Muskelregeneration an der Myofaservergrößerung bei gealterten Mäusen beteiligt sein könnte, und schlugen die Beteiligung des Muskelatrophiewegs vor.cistanche tubulosa dosierung redditDie Atrogin1- und MuRFI-Gene sind eng mit der Muskelatrophie verwandt38, und ihre Expressionsniveaus sind in gealterten Muskeln im Vergleich zu jungen Muskeln signifikant erhöht (Abb. 6a). Wir untersuchten die Konzentration von Atrogin1 und MuRFI in den Muskeln alter Mäuse nach systemischer Verabreichung von miR199#4. Atrogin1 und MuRFI wurden in verschiedenen Muskeln durch die Verabreichung von miR19#4 deutlich reduziert (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass die Unterdrückung des Muskelatrophiewegs durch miR199#4 bei gealterten Mäusen zu einer Myofaserexpansion führen kann.

MiR199#4 verzögert den Muskelkraftverlust bei alten Mäusen. Die Wirkung von miR199#4 auf die Muskelfunktion bei gealterten Mäusen ist von Interesse. Der Greifkrafttest wurde an gealterten Mäusen vor und nach der systemischen Verabreichung von miR199#4 durchgeführt. Das Experiment wurde doppelblind durchgeführt; die RNA-Injektion und der 100-Prozent-Grip-Test wurden von verschiedenen Experimentatoren durchgeführt, ohne Informationen auszutauschen. C57BL/6-Mäuse (80- Woche alt), männlich, wurden einem Greiftest unterzogen, dann wurde ihnen 1 Woche später miR199#4 und nsCont intravenös injiziert und erneut ein Greiftest durchgeführt. Die Veränderung der Muskelkraft nach der Injektion von miR199#4 war MiR199#4 verbessert die Muskelkraft von mdx-Mäusen. Da miR199#4 einen positiven Einfluss auf die Muskeln hat, führten wir ein Experiment durch, um die Wirkung der miR199#4-Verabreichung bei mdx-Mäusen, einem bekannten DMD-Tiermodell, zu bewerten32. Acht Wochen alten mdx-Mäusen wurde zweimal (1-Wochen-Intervall) intravenös miR199#4 (1,6 mg/kg) injiziert, und der Greiftest wurde 1 Woche nach der letzten Verabreichung durchgeführt. Das Experiment wurde doppelblind durchgeführt, wie in Fig. 7 gezeigt. Die Ergebnisse (Abb. 8a) zeigen eine signifikante Verbesserung der Muskelkraft bei mit miR199#4 behandelten mdx-Mäusen im Vergleich zu mit nsCont behandelten mdx-Mäusen. Darüber hinaus wurden im Blut von mdx-Mäusen, die mit miR199#4 behandelt wurden (Abb. 8b, c), signifikante Abnahmen der Kreatinkinase (CK)-Aktivität und des zellfreien miR-1 beobachtet, was mögliche Anzeichen der Krankheit sind Verbesserung.

Als Arzneimittelabgabereagenz ist Atelokollagen viskos und schwierig zu handhaben, und die mit Atelokollagen behandelten Mäuse schienen aufgrund des Vehikels unter negativen Wirkungen zu leiden. Daher suchten wir nach Alternativen zu Atelokollagen, um unser Drug Delivery System (DDS) zu verbessern, und fanden kationische DC-CHOL/DOPE-Liposomen als neues DDS-Reagenz, das Atelokollagen ebenbürtig oder überlegen ist (ergänzende Abb. 4). Die Arzneimittelverteilung von miR199#4 mit den kationischen Liposomen zeigte, dass das verabreichte miR19#4 an den Muskel abgegeben und konstant in großen Mengen in der Leber aufgenommen wurde (ergänzende Abb. 5). Extrazelluläres miR199#4, das an den Muskel abgegeben wird, kann als Mediator beim Gen-Silencing fungieren und zur Genregulation beitragen, die an der Verbesserung der Muskelkraft beteiligt ist.

Wir haben versucht, Biomoleküle zu identifizieren, die mit der Verbesserung nach der Verabreichung von miR199#4 zusammenhängen. Verschiedene mit DMD verwandte Polypeptide wurden durch Western-Blotting untersucht, jedoch wurden in dieser Studie keine eindeutigen Signale im Zusammenhang mit der Verbesserung festgestellt (ergänzende Fig. 6). Wir werden diesen Punkt im folgenden Abschnitt weiter diskutieren.

Diskussion

Biomoleküle verändern sich mit zunehmendem Alter qualitativ und quantitativ--3. Das Erfassen und Studieren solcher Veränderungen ist für das Verständnis des Alterns von entscheidender Bedeutung und kann Strategien für den Umgang mit Problemen in alternden Gesellschaften aufzeigen. Parabiosestudien, in denen junge und alte Tiere zusammengebracht werden, um ein gemeinsames Gefäßsystem zu teilen, haben wichtige Einblicke in Alterung und Verjüngung geliefert9-l2. Die Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass es verjüngende und alternde Faktoren im zirkulierenden Blut von jungen bzw. alten Menschen gibt. Frühere Studien berichteten von verschiedenen Molekülen als Kandidaten für Verjüngung und Alterung, aber die Ergebnisse sind umstritten13.

Unsere In-vitro-Zellkulturexperimente mit jungen und alten Seren ähneln Parabiose-Experimenten (Abb. lb), und wir fanden miR-199-3p, das sich mit dem Alter verändert, im zirkulierenden Blut; Es wurde festgestellt, dass die miRNA in gealtertem Blut signifikant abnimmt (Tabelle 1 und Abb. la). Außerdem nimmt die Expression von Muskel(zellular)miR-199-3p in gealterten Muskeln im Vergleich zu jungen Muskeln deutlich ab (Abb. 5a); daher kann cf-miR-199-3p im Blut mit Muskel-miR-199-3p korrelieren. Die Abnahme der miR-199-3p-Expression mit zunehmendem Alter wird auch in mesenchymalen Stammzellen beobachtet, die aus dem Knochenmark von Rhesusaffen stammen39. Daher kann die Expression von zellulärem miR-19-3p unter altersbedingter Kontrolle stehen. Im Gegensatz zu miR-19-3p bleibt die Expression zellulärer myogener miRNAs, wie miR-1 und miR-133, in jungen und gealterten Muskeln unverändert (Abb. 5a), aber das Niveau ihrer extrazellulären miRNAs im Blut ist bei gealterten Mäusen deutlich reduziert (Abb. la). Der Unterschied zwischen miR-199-3p und myogenen miRNAs (miR-1 und -133) kann den Unterschied in der cf-miRNA-Verarbeitung und/oder in der altersbedingten Kontrolle von cf-miRNAs zwischen ihnen widerspiegeln . Um diesen Unterschied aufzuklären, müssen in Zukunft weitere Studien durchgeführt werden.

Frühere Studien deuteten darauf hin, dass miR-199-3p über die Unterdrückung seiner Zielgene an verschiedenen Zellfunktionen und lebenswichtigen Phänomenen beteiligt ist; Beispielsweise kann die miRNA die Proliferation und Migration von Endothelspitzenzellen fördern bzw. den Beginn der Pubertät modulieren, und zwar durch Herunterregulierung des Zielgens Semaphorin-3A40 und durch Unterdrückung von Zielgenen (Cdc42, Map3k2, Map3k4 und Taok1) am p38MAPK-Signalweg beteiligt41. Die vorliegende Studie hat herausgefunden, dass miR-19-3p an der myogenen Differenzierung durch Unterdrückung seiner Zielgene Lin28b und Suz12 beteiligt ist (Abb. 3). Lin28b ist ein RNA-bindendes Protein und hemmt die Reifung von miRNAs, einschließlich miR-1, einer muskelspezifischen miRNA, die die Myogenese fördert37. Die Unterdrückung von Lin28b durch miR-19-3p verursacht eine Zunahme des ausgereiften miR-1 (Abb. 3), was das Fortschreiten der myogenen Differenzierung ermöglichen kann.

Suzl2 ist eine Kernuntereinheit des Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), der an der Unterdrückung von Chromatin42 beteiligt ist. Die Genregulation von PRC2 ist an der Aufrechterhaltung der Stammzellen, der embryonalen Entwicklung, der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt, einschließlich der myogenen Differenzierung42. PRC2 ist an stillen muskelspezifischen Loci wie Myog und Muskelkreatinkinase (MCK) in undifferenzierten Myoblasten vorhanden, aber dissoziiert von solchen Loci in differenzierten Myotuben43. Gen-Silencing gegen Suz12 durch RNAi bewirkt die Verstärkung der myogenen Genexpression (Abb. 3). Die Unterdrückung des Enhancers des Proteins Zeste Homolog 2 (Ezh2), einer weiteren Kernuntereinheit von PRC2, verursacht ebenfalls eine myogene Differenzierung44. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Hemmung der PRC2-Bildung aufgrund der Unterdrückung seiner Kernuntereinheiten die Schaffung eines genomischen Zustands für die Muskeldifferenzierung auslösen kann. Daher kann die Unterdrückung von Suz12 durch miR-199-3p eine myogene Differenzierung induzieren. Zusammengenommen kann miR-19-3p eine wichtige Rolle bei der myogenen Differenzierung spielen, indem es zwei unabhängige Signalwege hemmt, an denen Lin28b und Suzl2 beteiligt sind, die jeweils an der Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands von Myoblasten beteiligt sind.

Die Wirkung von miR-199-3p auf die myogene Differenzierung wurde auch in vivo gezeigt (Abb. 4). Muskelschäden lösen Zellproliferation und -differenzierung aufgrund von Muskelregeneration aus. Die Einführung von miR199#4, das miR-199-3p an geschädigte Stellen liefert, verbesserte die Muskelregeneration und erweiterte regenerierende Muskelfasern (Abb. 4). Die myogene Genexpression wurde unter miR199#4-Behandlung durchgehend hochreguliert (Abb. 4). Aus praktischer Sicht könnte miR199#4 für chirurgische Behandlungen wirksam und nützlich sein.

Als miR199#4 alten Mäusen verabreicht wurde, denen miR-199-3p im Blutkreislauf fehlte, zeigten die Mäuse deutlich ausgedehnte Muskelfasern (Abb. 5) und einen verzögerten Verlust der Muskelkraft mit zunehmendem Alter (Abb. 7). Die erweiterten Muskelfasern in gealterten Mäusen unterscheiden sich von regenerierenden Muskelfasern, die in Gegenwart von miR199#4 vergrößert werden; Ersteres stammt von bereits bestehenden Myofasern und Letzteres von Neo-Myofasern (neugeborene Myofasern). Es gibt also verschiedene, voneinander unabhängige Mechanismen bei den Muskelfaservergrößerungen. Unsere Studie legt nahe, dass (i) im ersteren Fall die Hemmung der Muskelatrophie aufgrund der Unterdrückung von Atrogin1 und MuRFI durch die Behandlung mit miR199#4 zu einer Vergrößerung der gealterten Muskelfasern führt und (ii) im letzteren Fall die Unterdrückung der Zielgene Lin28b und Suz12, bewirkt eine Vergrößerung der regenerierenden Muskelfasern. Insgesamt können verschiedene (mehrere) durch miR-19-3p regulierte Gene in verschiedenen Situationen an der Muskelhypertrophie beteiligt sein. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass miR-199-3p zumindest eine Anti-Aging-Wirkung auf Muskeln haben könnte und dass miR199#4, das miR-199-3p liefert, Potenzial als neuartiges RNA-Medikament für altersbedingte Muskelerkrankungen haben könnte, wie Sarkopenie.

Basierend auf der hohen Wirksamkeit von miR199#4 auf die Muskeln verabreichten wir miR199#4 mdx-Mäusen, einem bekannten DMD-Modell, und erzielten bemerkenswerte Ergebnisse: Die systemische Verabreichung von miR199#4 verbesserte die Muskelkraft bei den Mäusen um ~20 Prozent ( Abb.8a). Um den Mechanismus der Erholung der Muskelkraft zu verstehen, haben wir versucht, Biomoleküle zu identifizieren, die durch miR-199-3p verbessert (oder beeinflusst) wurden. Mit Ausnahme der Verbesserungen von Blut-CK und cf-miR-1 (Abb. 8b, c) konnten wir jedoch keine solchen Verbesserungen auf molekularer Ebene feststellen. Diese Schwierigkeit bei der Erkennung kann auf die komplexe Zellpopulation zurückzuführen sein, die bei mdx-Mäusen aus einer Mischung aus regenerierenden und störenden Muskelzellen besteht. Selbst wenn miR199#4 zu einer Verbesserung führt, würde das hohe Hintergrundrauschen, das durch die komplexe Zellpopulation verursacht wird, den Beweis der Verbesserung verschleiern. Um dieses Problem zu lösen, müssen umfangreichere Studien mit einer homogenen Muskelzellpopulation aus mdx-Mäusen oder mit Fokus auf verschiedene Gewebe, einschließlich Muskel, durchgeführt werden.

Obwohl der molekulare Mechanismus der Erholung der Muskelkraft durch miR199#4 unbekannt bleibt, ist die Dosis von miR19#4 für eine verbesserte Muskelkraft bemerkenswert. Die zweimalige Verabreichung von ~1,6 mg/kg miR199#4 verbesserte die Muskelkraft bei mdx-Mäusen. Die effektive Dosis scheint niedriger zu sein als die von Antisense-Oligonukleotiden für Exon-Skipping gegen mutierte Dystrophin-Gene in vivo45-47. Der Grund, warum miR199#4 in der Lage ist, die Muskelkraft bei solch niedrigeren Dosen zu verbessern, liegt möglicherweise an seinem anderen Wirkmechanismus im Vergleich zu Antisense-Oligonukleotiden. Der Wirkmechanismus von miR19#4 ist das katalytische Gen-Silencing. Im Gegensatz dazu basiert der Mechanismus von Antisense-Oligonukleotiden auf physikalischer Hybridisierung. Daher können Unterschiede in den geeigneten Dosen zum Nachweis der Arzneimittelwirksamkeit auf die unterschiedlichen Wirkmechanismen zurückzuführen sein.

Der Mechanismus, durch den Organe, Gewebe oder Zellen miRNAs in das zirkulierende Blut abgeben, ist noch nicht vollständig verstanden, und auch die altersabhängige Regulation der Freisetzung solcher miRNAs ist unklar. Die vorliegende Studie zeigte, dass myogene cf-miR-NAs, einschließlich cf-miR-199-3p, mit dem Blut im Gefäßsystem zirkulieren und mit zunehmendem Alter abnehmen. Solche cf-miRNAs können in Exosomen vorhanden sein, dh sie sind exosomale miRNAs.

Myogene miRNAs sind an der myogenen Differenzierung, Muskelregeneration und Aufrechterhaltung der muskulären Homöostase beteiligt33. Frühere Studien berichteten, dass beobachtet wurde, dass myogene miRNAs wie miR-1 und miR-133 als Reaktion auf körperliche Betätigung im Blut zunehmen4849. Basierend auf diesen Berichten können aktive junge Mäuse mehr myogene miRNAs ins Blut freisetzen als ältere, sich langsam bewegende Mäuse, und solche extrazellulären miRNAs, einschließlich cf-miR-199-3p, können durch autokrine Wirkung zur Aufrechterhaltung der Muskelhomöostase bei jungen Mäusen beitragen . Der Spiegel an extrazellulärer (exosomaler) miRNA korreliert jedoch nicht immer mit dem zellulären miRNA-Spiegel, und es wurden Unterschiede in myogenen miRNAs und miR-199-3p zwischen jungen und alten Mäusen (Abb. la und 5a) und während beobachtet myogene Differenzierung (ergänzende Abb. 2a). So ist als weitere Möglichkeit denkbar, dass die alters- und differenzierungsbedingte Regulation der Exosomenbildung die cf-miRNA-Produktion beeinflusst; Insbesondere kann es Unterschiede in der Exosomenbildung zwischen jungen und alten Mäusen geben. Im Zusammenhang mit diesen Hypothesen sind weitere Studien erforderlich, um die altersbedingte Freisetzung von myogenen miRNAs in das Blut aufzuklären.

Abgesehen vom Freisetzungsmechanismus könnten die cf-miRNAs, wenn junge myogene cf-miRNAs, die cf-miR-199-3p enthalten, durch Parabiose aus einem jungen Gefäßsystem in das gealterte Blutkreislaufsystem fließen, eine Muskelaktivierung und -hemmung auslösen Atrophie auf der gealterten Seite; Dieses Konzept wird durch Beweise von gealterten Mäusen gestützt, denen in dieser Studie miR19#4 intravenös injiziert wurde (Abb. 5-7). Cf-miRNAs im Blut können mit der altersbedingten homöostatischen Funktion zusammenhängen und könnten eine veränderte Homöostase darstellen. Wenn solche cf-miRNAs ektopisch vorhanden sind, beispielsweise wenn cf-miRNAs in jungem Blut in das gealterte Blutkreislaufsystem übertragen werden, können einige cf-miRNAs verjüngende Wirkungen auf der gealterten Seite zeigen, dh sie können Anti-Aging-Wirkungen hervorrufen. Im Gegensatz dazu können cf-miRNAs in gealtertem Blut eine veränderte Homöostase mit zunehmendem Alter darstellen. Wenn solche cf-miRNAs in das junge Blutkreislaufsystem übertragen werden, könnten einige cf-miRNAs eine altersbedingte Verschlechterung auslösen und eine vorzeitige Alterung auf der jungen Seite verursachen. Cf-miRNAs, die in gealtertem Blut signifikant erhöht sind, stellen Kandidaten dar, die einer detaillierten mechanistischen Analyse bedürfen, um das Altern zu verstehen und zu verhindern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere aktuelle Studie neue Einblicke in cf-miRNAs als altersbedingte Moleküle geliefert und eine neue Forschungsrichtung aufgezeigt hat, um die Beziehung zwischen Alterung und zellfreien funktionellen RNAs, einschließlich cf-miRNAs, zu klären.

Dieser Artikel stammt aus COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio