Nano-Milchprotein-Schleim-Komplexe: Charakterisierung und Antikrebswirkung Teil 1

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Abstrakt: DasAntikrebsAktivität von Naturstoffen hat in letzter Zeit multidisziplinäre Forschung angezogen. In dieser Studie wurde die Komplexierung von Milchproteinen (MP) mit Isabgol-Hülsenschleim (IHM) und Ziziphus Spina Christi-Schleim (NabM) untersucht. In diesem Zusammenhang wurden die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Milchproteinschleimkomplexen (MPMC) einschließlich pH-Wert, Carr-Index, Wasserlöslichkeit und Wasseraufnahmeindizes gemessen und das Fließverhalten untersucht. Darüber hinaus das Aminosäureprofil, Proteinverdaulichkeit und phenolische undFlavonoideGehalt an MPMC untersucht und die Mikrostruktur der Komplexe mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht. DasAntioxidansund Antikrebs-Potenzen von MPMC gegen zwei Krebszelllinien, menschliche Leberkrebs-HEPG-2 und Brustkrebs-MCF-7, im Vergleich zu zwei normalen Zelllinien, nämlich Bj-1 und MCF{{ 3}}F, wurden unter Verwendung eines Neutralrot-Aufnahmeassays getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass MPMC eine Abfangaktivität gegen DPPH-, ABTS- und HS-Radikale hatte. Darüber hinaus hat MPMC das Potenzial, DNA-Schäden zu verhindern, die durch oxidativen Stress in der Typ-Fenton-Reaktion verursacht werden. Die Ergebnisse des Neutralrot-Assays zeigten eine signifikante Wachstumshemmung sowohl von HEPG-2 als auch von MCF-7, während keine signifikante zytotoxische Wirkung gegen Bj-1 und MCF-12F festgestellt wurde. RT-qPCR-Ergebnisse zeigten MPMC-stimulierte Apoptose, wie durch die Hochregulierung der Pro-Apoptose-Genmarker Caspase-3, p53, Bax gezeigt wurde. Unterdessen wurde das Anti-Apoptose-Bcl-2-Gen herunterreguliert. Bei normalen Zelllinien, die mit MPMC behandelt wurden, wurde jedoch kein signifikanter Unterschied beobachtet. Zusammenfassend kann MPMC als vielversprechende Antikrebssubstanz angesehen werden, die bei der Entwicklung neuartiger Krebstherapeutika mit vergleichbarer Aktivität und minimalen Nebenwirkungen im Vergleich zu herkömmlichen Krebs-Chemotherapien verwendet werden kann .

Schlüsselwörter: Milchproteine; Isabgol-Schalenschleim; Nabeq-Schleim; Milchproteinschleimkomplexe; Anti-Krebs-Aktivität

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1. Einleitung

Krebsist mit etwa 10 Millionen Todesfällen im Jahr 2020 weltweit die Haupttodesursache [1]. Eine frühe Diagnose und die Entwicklung neuartiger Therapeutika ist die einzige Hoffnung, den Krebs zu besiegen. Herkömmliche Krebsbehandlungen wie Chemotherapie und Bestrahlung sind relativ teuer und von erheblichen Nebenwirkungen begleitet.

Daher tendiert das wissenschaftliche und Forschungsinteresse dazu, natürliche Verbindungen (dh Proteine, Polysaccharide und Polyphenole) aus ihren Quellen zu nutzen, die ein antikarzinogenes Potenzial haben, da sie im Vergleich zu herkömmlichen Behandlungen als weniger toxische Nebenwirkungen angesehen werden.

Polysaccharideaus pflanzlichen Quellen haben in letzter Zeit aufgrund ihrer bioaktiven Eigenschaften zunehmend Beachtung gefunden [2,3]. Zahlreiche Studien haben sich aufgrund ihrer vorteilhaften pharmakologischen Wirkungen mit der Isolierung bioaktiver Polysaccharide und Polyphenole aus natürlichen Pflanzenquellen wie Obst, Gemüse, Getreide und Kräutern beschäftigt [4].

Plantago ovata (Psyllium oder Isabgol) und Ziziphus Spina-Christi (Nabeg oder Sidr) sind bekannte Quellen bioaktiver Polysaccharide. Als vielversprechende bioaktive Materialien wurden IHM und NabM ausgewählt. Frühere Studien zeigten, dass IHM- und NabM-Komplexe mit Milchproteinen die Leberfunktion verbessern und das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen verringern[5]. Isabgol-Schale hat sich als wirksam bei der Behandlung von Durchfall, Verstopfung, Colitis ulcerosa, Reizdarmsyndrom, Hypercholesterinämie und Diabetes erwiesen. Darüber hinaus wurde die krebshemmende Wirkung von Isabgol-Schalen gegen Darmkrebs auf seinen Fasergehalt zurückgeführt, der seine Wirkung verringert, indem er die Transitzeit verkürzt. Dies führt zu einer Reduzierung des Gallenstoffwechsels durch die Darmmikroflora, Verdünnung der Gallensäuren durch Aufblähung des Stuhls, Veränderung des mikrobiellen Gallensäurestoffwechsels aufgrund von Faserfermentation, Senkung des pH-Werts und Produktion von kurzkettigen Fettsäuren oder durch direkte Bindung an die Gallensäuren und damit deren Metabolisierung verhindern [6]. Die biologisch aktiven Hauptbestandteile von Ziziphus Spina-Christi sind Vitamin C, Phenole, Flavonoide und Triterpensäuren. Seine Bioaktivitäten umfassen Antikrebs-, antibakterielle, antidiabetische, antiproliferative und antioxidative Aktivitäten [7. Isabgolschalen- und Nabeq-Früchte werden zur Herstellung von Isabgolschalen-Schleim (IHM) bzw. Nabeq-Schleim (NabM) verwendet [5].

Andererseits haben proteinbasierte Krebstherapien aufgrund von Schlüsselmerkmalen wie geringer Zytotoxizität, starker Spezifität und einfacher Modifizierung zunehmendes Interesse erlangt [8]. Neben der Bereitstellung des Nährstoffbedarfs an essentiellen Aminosäuren gehören Milchproteine ​​zu den biologischen Makromolekülen, die viele funktionelle Eigenschaften haben, wie z. B. antioxidative, immunmodulatorische, antidiabetische, antimikrobielle und krebshemmende Eigenschaften [9,10]. Zum Beispiel ist die Antikrebsaktivität von Peptiden aus Molkereiprodukten (d. h. -Casomorphine, isoliert aus -Casein und 1-Caseinfragmenten 90-95 und 90-96[Arg90-Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]), die in Rindermilch identifiziert wurden, stützen die Annahme, dass Milchproteine ​​nicht nur einen Nährwert haben, sondern auch das Potenzial zur Krebsprävention und -behandlung haben [11,12]

Die Komplexierung zwischen Milchproteinen und Polysacchariden, wie z. B. Milchprotein-Chitosan-Komplex, wurde zuvor als Versuch hergestellt, die funktionellen Eigenschaften ihrer natürlichen Komponenten zu verbessern [13]. Aufgrund der Verfügbarkeit und einfachen Herstellung haben solche Komplexe das Potenzial, bei der Entwicklung kostengünstigerer Krebstherapien verwendet zu werden. Solche Therapeutika werden weniger teuer sein und eine vergleichbare Aktivität wie die derzeit verwendeten Chemotherapeutika zeigen.

Nicht-kovalente Bindung durch hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen sind die Hauptfaktoren bei der Assoziation von Milchproteinen mitPolysaccharide[14]. Darüber hinaus zeigen Proteine ​​im pH-Bereich von 2 bis 11 eine überraschende Widerstandsfähigkeit gegenüber Wechselwirkungen mit anderen Komponenten. Bei einem bestimmten pH-Wert steigt die Oberflächenreaktivität von Proteinen durch die Entfaltung der Proteinstruktur [15].

In diesem Zusammenhang hat sich unsere Gruppe kürzlich auf die funktionelle Rolle von Milchproteinkomplexen für die menschliche Gesundheit konzentriert. Milchproteinkomplexe mit IHM oder NabM haben jedoch antihyperlipidämische und leberschützende Eigenschaften gezeigt [9]. Daher wurde auf der Grundlage früherer Studien postuliert, dass Milchprotein-Polysaccharid-Komplexe eine interessante Antikrebsaktivität haben könnten. Außerdem hatte keine Veröffentlichung eine Studie über die Antikrebsaktivität von Milchproteinkomplexen mit IHM und NabM durchgeführt. Daher waren die Hauptziele dieser Studie die Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der neu hergestellten Milchproteinschleimkomplexe, einschließlich des Aminosäureprofils und der funktionellen Eigenschaften dieser Komplexe. Darüber hinaus wurde die Antikrebsaktivität von Milchproteinkomplexen mit IHM- und NabM-Schleim gegen zwei menschliche Krebszellen (MCF7 und HEPG2) im Vergleich zu nicht-krebsartigen Zelllinien (Bi-1 und MCF-12F) untersucht ). Außerdem beleuchten wir die Wirkungsweise der produzierten Milchprotein-Schleimkomplexe.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Spektroskopie

Die Infrarotspektren von IHM, MP und MP/IHM sind in Abbildung 1Adargestellt. Das Spektrum von IHM zeigte die charakteristische Bande von Arabinoxylanen bei 100-1200 cm-1 und die Banden für die Amid-I- und Amid-II-Gruppen bei 1550 bzw. 1650 cm-1. Das MP-Spektrum zeigt Banden bei 1700-1600 und 1200-900 cm-I, die Amid I (hauptsächlich C=O-Streckung von Proteinen) bzw. Milchkohlenhydraten entsprechen [16]. Die vorgenannten Peaks von IHM und MP waren im Spektrum des IHM/MP-Komplexes reserviert. In ähnlicher Weise wurden die charakteristischen Banden von Galacturonsäure in NabM im Spektrum des NabM/MP-Komplexes beibehalten (Abbildung 1B). Dies würde das Fehlen einer chemischen Wechselwirkung zwischen Polysaccharidschleim und MP anzeigen und somit den vorgeschlagenen Mechanismus der elektrostatischen Anziehung zwischen MP und Polysacchariden (IHM und NabM) bestätigen. Solche Beobachtungen stimmen mit denen von Vukic et al überein, die über die Komplexbildung zwischen Molkenmilchproteinen und Pektin durch elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen berichteten, die zu einer guten Konsistenz des Komplexes führten [17].

2.2. Physikochemische und funktionelle Eigenschaften von MP und MPMC

Die Werte von Schüttdichte (BD), Stampfdichte (TD), Carr's Index und pH-Messungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. BD und TD von MP waren höher als IHM, und IHM hatte die niedrigste Schütt- und Stampfdichte der getesteten Proben . In ähnlicher Weise hatte der MP/IHM-Komplex signifikant (S<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI und WAI sind wichtige Funktionsmerkmale in der Lebensmitteltechnologie. Tabelle 1 zeigt, dass WSI und WAI von MP nach Komplexierung mit IHM und NabM signifikant anstiegen. Dies lag höchstwahrscheinlich daran, dass Isabgol-basierte Materialien sehr gut wasserlöslich sind und nach Zugabe ausreichender Wassermengen verdickend wirken [19]. Außerdem haben Qaisrani et al. berichteten, dass Arabinoxylane der Isabgol-Schale eine Wasserhaltekapazität haben, die bis zum Zehnfachen ihres Trockengewichts beträgt [20]. Darüber hinaus hat MP/IHM einen höheren WSI und WAI als MP/NabM, da IHM einen höheren WSI und WAI als NabM hat. Darüber hinaus führte die Erhöhung des WSI-Prozentsatzes für MPMC im Vergleich zu MP zu einer Erhöhung der Dispergierbarkeit der Zielwirkstoffe bei ihrer Verwendung in therapeutischen Fragestellungen [21]. Dies wurde in den Antikrebsergebnissen deutlich, die zeigten, dass diese Komplexe eine zytotoxische Wirkung als MP haben.

2.3. Bioaktive Komponenten

2.3.1. Phenolische Verbindungen von PHM und NabM

Lebensmittel enthalten sehr wichtige bioaktive Verbindungen (dh Phenole und Flavonoide), die als Antioxidantien und Antikrebspotenzen wirken. Die HPLC-Analyse bestätigte und quantifizierte das Vorhandensein vieler phenolischer Verbindungen in Nab und IHM, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen den hohen Gehalt an verschiedenen biologisch aktiven Verbindungen wie Gallussäure (177,96 mg/kg), Catechin (13,87 mg/kg) p-Hydroxybenzoesäure (24,02 mg/kg), Catechin (5,93 mg/kg) und Rutin (123,70 mg/kg) in PHM-Extrakt und Catechol (410,72 mg/kg) p-Hydroxybenzoesäure (426,71 mg/kg) Chlorogen (72,05 mg/kg) Rutin (1750,57 mg/kg) und Rosmarin (1771,72 mg/kg) in NabM (Abbildung 2A,B). Der Gehalt dieser Verbindungen ist für die gesundheitlichen Vorteile sehr wichtig. Über die krebshemmende Wirkung von Phenolverbindungen wurde bereits berichtet. Dieser Effekt wurde hauptsächlich der antioxidativen Wirkung dieser Verbindungen zugeschrieben.

2.3.2. Gesamte phenolische, Flavonoid- und antioxidative Aktivität von MP und MPMC

Mehrere Berichte haben darauf hingewiesen, dass Verbindungen, die antioxidative Eigenschaften aufweisen, meistens Antikrebsaktivität aufweisen[22]. Der Gehalt an Gesamtphenol (TP) und Gesamtflavonoid (TF) wurde in NabM, IHM, MP und ihren Komplexen bestimmt (Abbildung 3A, B). Die Ergebnisse zeigten, dass TP und TF bei NabM und MP/NabM im Vergleich zu IHM und MP/IHM höher waren. Allerdings waren die TP- und TF-Gehalte in MP im Vergleich zu MPC signifikant niedriger. Diese Ergebnisse stimmten mit den Daten von Singh et al.[23] überein. die herausfanden, dass TP und TF von NabM 1,6 mg GAE/100 g Trockengewicht bzw. 47 mg CE/100 g Trockengewicht betrugen. MP/NabM- und MP/IHM-Komplexe zeigten einen signifikanten Anstieg von 309 Prozent bzw. 59 Prozent bei TP und 476 Prozent bzw. 123 Prozent bei TF im Vergleich zu MP. Die Konjugation von MP mit IHM und NabM führte zu einem Verlust von 23 Prozent bzw. 36 Prozent von TPC, entsprechend IHM und NabM. TF wurde bei IHM um 44 Prozent und bei NabM um 46 Prozent reduziert, wenn es mit MP komplexiert wurde. Dies lag höchstwahrscheinlich an der niedrigen TP und TF von MP.

Die potenzielle Radikalfängeraktivität von MP/IHM und MP/NabM im Vergleich zu MP mit DPPH, ABTS und HS ist in Abbildung 3C-E dargestellt. Die aus der Aktivität der drei Antioxidantien erhaltenen Daten zeigten einen ähnlichen Trend, was darauf hinweist, dass NabM eine höhere Antioxidansaktivität als IHM aufwies, und dies steht im Zusammenhang mit den Ergebnissen von Phenolen und

Gehalt an Flavonoiden. Die antioxidative Kapazität von MP wurde nach Komplexierung mit NabM und IHM erhöht. Mit Ausnahme des ABTS-Assays erhöhte sich die antioxidative Aktivität von NabM durch Konjugation mit MP. Die antioxidative Aktivität zeigte, dass MPMC im Vergleich zu MP eine höhere antioxidative Aktivität aufwies. Unsere Hypothese weist auf eine mögliche Wechselwirkung zwischen MP und Polysacchariden hin, die dazu führt, dass die von Li et al. beschriebene potenzielle antioxidative Aktivität erreicht wird. [24]. Es wurde bereits berichtet, dass es eine positive Korrelation zwischen der Auffangkapazität und dem Gehalt an Phenolen/Flavonoiden gibt 5]. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass neue bioaktive Peptide produziert werden, die mit schwefelhaltigen Aminosäuren angereichert sind, was die hohe antioxidative Aktivität von MPMC im Vergleich zu den unkomplexierten Komponenten erklärt. Darüber hinaus werden die kleinen Peptide in Molkefraktionen freigesetzt, was die hohen antioxidativen Eigenschaften beeinflusst [4]. Schließlich beeinflussen Phenol- und Flavonoidgehalte verschiedene Krebszellen. Zusätzlich wurden diese Aktivitäten und Mechanismen während in-vitro-Zellkulturassays beobachtet. Antioxidative und Antikrebsaktivitäten von Phenolen werden Doppelbindungen und Hydroxylsubstitutionen an den aromatischen Ringen zugeschrieben [25].

2.4. Aminosäureprofil von MP und MPMC

Aminosäureprofile von MP, NabM, MP/IHM und MP/NabMar sind in Fig. 4 dargestellt. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Aminosäureprofilen von MP und seinen Komplexen mit IHM und NabM. Dies deutete darauf hin, dass die nicht-kovalente Wechselwirkung von MP mit Polysaccharidschleim die Zusammensetzung von Milchproteinen nicht veränderte. Die Ergebnisse zeigen den hohen Gehalt an Glutaminsäure in MP und MPMC (Abbildung 4) [26].

2.5. Rheologische Eigenschaften von MP und MPMCs

2.5.1. Scheinbare Viskosität

Abbildung S1 zeigt die Viskosität von Proteinproben bei verschiedenen Drehzahlwerten. IHM und NabM hatten eine hohe Viskosität bei langsamer Rotation, aber die Viskosität nahm signifikant ab, wenn die Rotationsgeschwindigkeit zunahm. Diese Ergebnisse stimmten mit Chen und Che überein, die feststellten, dass die scheinbare Viskosität von wasserlöslichem Schleim des Grünen Algen (Monostroma iridium) durch Erhöhen der Scherrate abnahm [27].

Die Ergebnisse in Abbildung S1 zeigen auch, dass die Komplexierung von MP mit IHM und NabM zu einem signifikanten Anstieg (p kleiner oder gleich 0,05) der scheinbaren Viskosität von MP führte. Dies könnte auf die einzigartigen Eigenschaften von IHM (Hydrocolloid Material) zurückgeführt werden, das eine viskositätserhöhende Wirkung hat [28].

2.5.2.Fließverhalten

Das Fließverhalten (Scherspannungs-/Schergeschwindigkeitskurven) von Milchproteinen und ihren Komplexen ist in Abbildung S2 dargestellt. Mit zunehmender Scherrate nahm die Scherspannung zu. Durch Umwandeln der Scherspannungs- und Schergeschwindigkeitsdaten in die Potenzgleichung werden die Werte des Fließkonsistenzindex (K) und des Fließverhaltensindex (n) in Tabelle S1 gezeigt. IHM und MP/IHM hatten den höchsten Fließkonsistenzindex. Dies könnte auf die hohe Viskosität des wasserlöslichen Schleims von IHM aufgrund seiner hohen Kapazität zum Halten von Wasser und zum Gelieren in einem wässrigen Medium zurückzuführen sein. Die Ergebnisse zeigten auch, dass IHIM, NabM und MP/IHM ein strukturviskoses Verhalten (nicht-newtonsche Flüssigkeiten) mit einem niedrigen n-Wert im Bereich von 0,25 bis 0,64 aufwiesen. Diese Ergebnisse kamen in Übereinstimmung mit Thanatcha und Pranee, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Ziziphus mauritiana untersuchten[29]. Andererseits war der n-Wert von MP etwa 1 (0,99), was auf Newtonsche Strömung hinweist. In ähnlicher Weise war der n-Wert für den MP/NabM-Komplex 0,95, wie in Tabelle S1 gezeigt.

2.6. Differentialscanningkalorimetrie von MP und MPMC

Differentialscanningkalorimetrie wurde verwendet, um die thermische Stabilität von MP und seinen Komplexen mit IHIM und NabM zu untersuchen. Die Thermogramme von MP und MPMC sind in Abbildung S3 dargestellt, und die DSC-Parameter sind in Tabelle 2 angegeben. Es wurde beobachtet, dass es keinen klaren endothermen Peak auf dem MP-Thermogramm gab, aber es gab einen deutlichen endothermen Peak für MP/IHM und a breiter endothermer Peak für MP/NabM. Dies liegt wahrscheinlich an der allmählichen Eliminierung von freiem Wasser, dem Schmelzpunkt von NabM, langsamer Gelierung und Proteindenaturierung [30].

Es wurde auch festgestellt, dass MPMC hitzestabiler war als unkomplexiertes Protein, wie durch die niedrige Denaturierungstemperatur von MP (101,44 Grad) im Vergleich zu MP/IHM und MP/NabM (148,24 bzw. 121,4 Grad) beobachtet wurde, wie in Tabelle 2 gezeigt. Darüber hinaus wurde die Zersetzungstemperatur von MP mit 302,3 Grad aufgezeichnet, wohingegen bei einer Temperaturerhöhung bis zu 350°C keine Zersetzung von MPMC beobachtet wurde. Diese Ergebnisse stimmten mit mehreren Studien überein, die herausfanden, dass die thermische Stabilität von Milchproteinen durch die Wechselwirkung mit phenolischen Verbindungen, die eine Proteinaggregation verhinderten, zunahm [2,31].

Die Wärme, die während einer Reaktion in das oder aus dem System gelangt, ist die Enthalpie (AH). Die höhere Enthalpie von MP/IHM und MP/NabM im Vergleich zu der des unkomplexierten MP könnte auf die mögliche chemische Reaktion zwischen Milchproteinen (Molke und Kasein) und zwischen Milchproteinen und Polysacchariden bei hoher Temperatur (Maillard-Reaktion) zurückzuführen sein. 31.

2.7. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von MP und MPMC

Abbildung 5 zeigt die Mikrostruktur von IHM, NabM, MP und MPMC. Es wurde festgestellt, dass die Partikelgröße von MPMC im Nanobereich (114-250 nm) lag und kleiner war als die Partikelgröße von MP (191-300 nm). Darüber hinaus zeigte das TEM von MPMC (Abbildung 5D, E) das verzweigte Muster der gebildeten Komplexe. Dies könnte der elektrostatischen Anziehung zwischen Milchproteinen und Polysacchariden zugeschrieben werden Goh, et al. [32]. Darüber hinaus könnte die größere verzweigte Struktur von MP/IHM im Vergleich zu MP/NabM für seine höhere Viskosität verantwortlich sein, wie in Abbildung S1 gezeigt.

2.8. Biologische Studien zu MP und MPMC

2.8.1. Antikrebsaktivität von MP und MPMC

Die zytotoxische Wirkung verschiedener Konzentrationen (1, 5, 10 und 20 ug/ml) von MP und MPMC auf HepG-2- und MCF-7-Zellen im Vergleich zu MCF-12F und Bij{ {7}} normale Zellen sind in den Fig. 6 und 7 dargestellt. MPMC zeigte eine Antikrebswirkung auf HepG-2- und MCF-7-Zellen, Fig. 6A bzw. B. Die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigte eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit als Reaktion auf höhere Konzentrationen. Andererseits wurde keine signifikante zytotoxische Wirkung von MP und MPMC auf normale Bj-1- und MCF-12F-Zellen beobachtet (Abbildung 6C, D). Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass MP/NabM eine höhere Antikrebsaktivität gegen HepG-2- und MCF-7-Krebszelllinien hatte, mit IC50-Werten von 5,13 bzw. 10,07 ug/ml. Darüber hinaus zeigte MP/IHM im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen eine moderate zytotoxische Wirkung gegen Krebszelllinien. Insgesamt deuten unsere zytotoxischen Daten darauf hin, dass die Komplexierung von MP mit IHM und NabM die Antikrebsaktivität im Vergleich zu unkomplexierten Milchproteinen signifikant verstärkt, wie in Tabelle 3 gezeigt. Es war auch offensichtlich, dass Hep-G-2-Zellen empfindlicher auf MP und MPMC reagierten im Vergleich zu MCF-7-Zellen, was sich in den niedrigeren Werten von IC50 manifestiert.

Über die Antikrebswirkung von aus Milchproteinen gewonnenen Antitumorpeptiden wurde bereits berichtet. In diesem Zusammenhang beobachteten Jeong und Hong [33], dass Trypsinhydrolysate von -Lactalbumin eine zytotoxische Wirkung auf humane Knochenkrebs-SJSA-1-, humane Darmkrebs-HCT 116- und humane Magenkrebs-Zelllinien NCI-N87 hatten. Es wurde festgestellt, dass o-Lactalbumin mit Zelloberflächenmodulatoren interagiert und die Zellwachstumsrate, das intrazelluläre Kalzium und die Kalziumtransportrate verändert [34]. Es ist erwähnenswert, dass Rinder-Lactoferrin dosisabhängig Apoptose in MCF7-Zellen induzierte [35]. Darüber hinaus zeigten die Kasein- und Molkenproteinfraktionen von Milch in einem Tiermodell Antitumorwirkungen sowie in vitro antiproliferative Aktivität [36]. Darüber hinaus haben Elsaghby et al.[37] berichteten, dass Casein-Nanopartikel verwendet werden können, um das hydrophobe Krebsmedikament Flutamid einzukapseln, um die Wirkstofffreisetzung zu kontrollieren, seine Antitumoraktivität zu verbessern und seine Hepatotoxizität zu verringern.

Die Antikrebswirkung von IHIM und NabM wurde bereits früher berichtet [6,38]. Die zytotoxische Wirkung von MP und MPMC könnte auf das Vorhandensein von Aminosäuren wie Glutamin, Arginin und Cystein zurückgeführt werden, von denen berichtet wird, dass sie eine Antikrebsaktivität gegen Darmkrebs aufweisen [39]. Diese Ergebnisse stimmen mit dem hohen Glutaminsäuregehalt von MPMC überein (Abbildung 5).

2.8.2. Bestimmung des p53-, Bax-, Caspase-3- und Bd-2-Proteinspiegels

Um den Zytotoxizitätsmechanismus von MPMC zu untersuchen, wurde die Konzentration der Apoptose-Markerproteine ​​p53, Bax, Caspase-3 und Bcl-2 in HepG-2, MCF-7 bestimmt. , Bj-1- und MCF-12-F-Zelllinien, die mit ICs0 von MPMC behandelt wurden (Abbildung 8). Die Höhe der Pro- und Anti-Apoptose-Marker ist mit der Induktion der Apoptose in Krebszelllinien assoziiert [40,41]. Die Ergebnisse zeigten, dass MP/NabM und MP/IHM die Apoptose in HepG-2- und MCF-7-, aber nicht in MCF-12F- und Bj-1-Zelllinien verstärkten. Der Gehalt an Caspase-3, p53, Bax war im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen signifikant erhöht (Abbildung 8), während das Bcl-2-Protein bei allen Behandlungen reduziert war. Interessanterweise zeigte MP auch eine signifikante Veränderung der Apoptose-Proteinmarker. Dies stimmte mit den Ergebnissen der Antikrebsstudie überein und könnte, wie oben diskutiert (Abschnitt 2.8.1), als zytotoxische Wirkung einer Reihe von Milchprotein-abgeleiteten Peptiden bezeichnet werden.

2.8.3. Schutz vor DNA-Schäden durch MPMC gegen oxidative Spaltung des RNH1-Plasmids

Die RNH1-Plasmid-DNA weist bei der Agarose-Gelelektrophorese drei Formen auf, die von oben nach unten als offene zirkuläre, lineare und supercoiled zirkuläre DNA geordnet sind. Der oxidative Stress durch Fentons Reagenz induzierte DNA-Schäden. Anschließend wird das Niveau der DNA-Formen verändert. Offene kreisförmige und lineare Formen weisen jedoch auf DNA-Schäden hin, und supercoiled kreisförmige DNA weist auf ein höheres Schutzpotenzial hin. In diesem Assay haben wir getestet, ob MP und MPMC bei ihrem IC50-Wert vor dem Abbau der supercoiled kreisförmigen Form als Reaktion auf oxidativen Stress schützen können. Als Ergebnis zeigten sowohl MP/NabM als auch MP/IHM eine hohe Schutzkapazität ähnlich der DNA-Kontrolle (Spuren 3 und 4, Fig. 9A). Andererseits wurde kein signifikanter Unterschied in mit MP behandelter DNA im Vergleich zu DNA-Kontrolle und DNA, die nur mit Fenton-Reagenz behandelt wurde, beobachtet (Spur 5).

2.8.4. Schutz vor DNA-Schäden durch MPMC gegen oxidative Spaltung genomischer DNA

Unter Verwendung der PCR-Technik wurden die schützenden Eigenschaften von MPMC auf durch die Fenton-Reaktion induzierte genomische DNA-Schäden untersucht. Im Allgemeinen reduziert DNA-Schädigung die Kopienzahl bestimmter Gene und erzeugt daher eine geringere Bandenintensität in der Gelelektrophorese. Die Bandendichte des MTHFR-Gens von genomischer Blut-DNA, die mit Fenton-Reagenz mit und ohne IC5s0 von MP, MP/NabM und MP/IHM inkubiert wurde, wurde getestet. Es wurde festgestellt, dass MP/NabM und MP/IHM (Spuren 3 und 4, Fig. 9B) DNA-Schäden verhinderten und anschließend die MTHFR-Matrizen-Schnittstelle schützten. Daher wurde eine höhere Intensität der PCR-Produktbande im Elektrophoresegel im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen erzeugt (Fig. 9B). Diese Ergebnisse zeigten, dass die antioxidative Aktivität von MPMC die Produktion von freien Radikalen hemmte, die DNA-Schäden vermittelten.

2.8.5. Genexpression

In Übereinstimmung mit den Daten der Apoptose-Proteinmarker zeigten die Ergebnisse der RT-qPCR, dass die Inkubation von HepG-2-, MCF-7-Zellen mit MP, MP/NabM und MP/IHM eine signifikante Hochregulierung der Pro- apoptotische mRNA-Marker, nämlich Casp3, p53 und Bax, während das Expressionsniveau des anti-apoptotischen Markers Bcl-2 signifikant herunterreguliert war (Fig. 10A-D). Caspasen sind Aktorproteine, die eine wichtige Rolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung der Apoptose spielen. Die Hochregulierung des Caspase-3-Proteins weist jedoch auf die Ausführung des intrinsischen Hauptwegs der Apoptose hin (Abbildung 10A, B), der durch den Kollaps der Mitochondrienmembran mit Bax-induzierter Cytochrom-c-Freisetzung und Aktivierung von Caspase 9 gekennzeichnet ist, was zu der anschließender Einsatz von Caspase 3 [42]. Die Hochregulierung von Casp3, p53 und Bax zusammen mit der Reduktion der Bcl-2-Expression zeigte, dass MP, MP/NabM und MP/IHM Apoptose auslösten. In dieser Hinsicht stimulierte die Hochregulierung von p53 die Expression von Bax, was wiederum die Freisetzung von Cytochrom c induziert, gefolgt von der Aktivierung von Caspase -9 und -3. Allerdings ist bekannt, dass Bcl-2 als Anti-Apoptose die Cytochrom-c-Freisetzung hemmt [43], was zu einer signifikanten Verringerung der mRNA-Transkriptspiegel des anti-apoptotischen Markergens Bcl-2 führte MP/NabM- und MP/IHM-Behandlung, die eine ungehinderte Bax-induzierte Cytochrom-c-Freisetzung und nachfolgende Apoptose erleichtert. In dieser Studie vermittelte MP/NabM die Apoptose im Vergleich zu MP/IHM und MP stark, wie in ( 10 ) beobachtet. Die beobachteten Antikrebswirkungen von MP/NabMor MP/IHM gehen über die Modulation des ap53--abhängigen Apoptosewegs, da sowohl seine Protein- als auch mRNA-Transkriptspiegel signifikant hochreguliert wurden.

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