Neuroprotektive Wirkung von Bu-Shen-Huo-Xue-Extrakt gegen hohe Glukose-induzierte Apoptose in PC12-Zellen

Für mehr Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Forschungsstudio für die Integration traditioneller und westlicher Medizin, Erstes Krankenhaus, Peking-Universität, Peking, China.

2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, China.

Höhepunkte

Eine durch hohe Glukose (HG) induzierte Neurotoxizität ist an der Pathologie von beteiligtDiabetikerEnzephalopathie (DE). In unserer Studie zeigt Bu-Shen-Huo-Xue-Extrakt (BSHX), eine polykräuterartige FormelneuroprotektivAktivität auf HG-induzierte PC12-Zellen und die möglichen Mechanismen können mit der Unterdrückung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie mitochondrienvermittelter Caspase- und JNK/p38-MAPK-Signalwege in Verbindung gebracht werden. Diese Studie liefert einen vielversprechenden Wirkstoff für die Behandlung von DE in klinischen Anwendungen.

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Abstrakt

Ziel: Untersuchung der neuroprotektiven Wirkung von Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX)-Extrakt, einer polykräuterartigen Formel, gegen durch hohe Glukose (HG) induzierte Neurotoxizität in PC12-Zellen. Methoden: Zellviabilitätsassay, Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay, Detektion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Hoechst 33258, Acridinorange (AO)/Ethidiumbromid (EB)-Doppelfärbung und Mitochondrial Membrane Potential (MMP)-Assay wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurden Bax, Bcl-2, Caspase-3, gespaltene Caspase-3, PARP, gespaltenes PARP, Cytochrom c und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) durch Western Blot nachgewiesen. Ergebnisse: BSHX-Extrakt erhöhte die Zelllebensfähigkeit und verringerte die LDH-Leckage in einer konzentrationsabhängigen Weise in HG-induzierten PC12-Zellen. Darüber hinaus verringerte der BSHX-Extrakt den Gehalt an intrazellulärem ROS, erhöhte das mitochondriale Membranpotential, regulierte die Expression von Bax und Bcl-2 und hemmte die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien. Darüber hinaus schwächte BSHX-Extrakt die Aktivierung von Caspase-3 und PARP ab und hemmte die Phosphorylierungen von c-Jun-N-terminaler Kinase (JNK) und p38-MAPKs. Schlussfolgerung: BSHX-Extrakt zeigte eine signifikante neuroprotektive Wirkung auf HG-induzierte Apoptose in PC12-Zellen. Dieser Effekt kann mit der Unterdrückung der ROS-Erzeugung sowie der mitochondrienvermittelten Caspase- und JNK/p38-MAPK-Signalwege in Verbindung gebracht werden.

Schlüsselwörter:diabetische Enzephalopathie, traditionelle chinesische Medizin, Bu-Shen-Huo-Xue-Extrakt,neuroprotektiv, hohe Glukose

Abkürzung: AO: Acridinorange; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Diabetische Enzephalopathie; DM: Diabetes mellitus; DMSO: Dimethylsulfoxid; EB: Ethidiumbromid; ERK: Extrazellulär regulierte Proteinkinasen; HG: Hohe Glukose; JNK: c-Jun N-terminale Kinase; LDH: Laktatdehydrogenase; MAPKs: Mitogen-aktivierte Proteinkinasen; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong Rezept; MTT: 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid; PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBST: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,1 Prozent Tween 20; ROS: Reaktive Sauerstoffspezies; T2DM: Diabetes mellitus Typ 2; TCM: Traditionelle Chinesische Medizin

Hintergrund

In den letzten Jahren hat die diabetische Enzephalopathie (DE), eine Komplikation des Diabetes mellitus (DM), die im Zentralnervensystem (ZNS) auftritt, weitreichende Aufmerksamkeit erhalten. DE kann mit mehreren Risikofaktoren wie Alter, Dauer und glykämischer Kontrolle von Diabetes in Verbindung gebracht werden [1, 2]. Die klinischen Manifestationen von DE sind morphologische und physiologische Veränderungen im Gehirn und daraus resultierende kognitive Dysfunktion. Hyperglykämie, oxidativer Stress und chronische Entzündungen können die wichtigsten pathogenen Ursachen von DE sein [3]. Obwohl eine zunehmende Anzahl von Experimenten gezeigt hat, dass eine lang anhaltende Hyperglykämie die Gehirnalterung beschleunigen kann, ist die genaue Pathogenese von DE unerforscht.

Apoptose ist ein programmierter Zelltod, der von Genen gesteuert wird, um die Stabilität der Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Zu den an der Apoptose beteiligten Proteinen gehören die Bcl-2-Familie, Caspasen, p53 usw. Die Bcl-2-Familie wird in zwei Kategorien unterteilt, eine, die den Zelltod fördert, wie Bax, und die andere widersteht der Apoptose. wie Bcl-2. Sie können die Apoptose über den Caspase-Signalweg regulieren, der eine Kaskaden-Amplifikationsreaktion des irreversiblen endlichen Hydrolysesubstrats der Caspase [4-6] ist. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass eine durch hohe Glukose (HG) induzierte Apoptose mit mitochondrialen Dysfunktionen, DNA-Schäden und einer übermäßigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verbunden ist [7]. Eine Studie an diabetischen Mäusen zeigte, dass Adenosin-5'-Monophosphat (AMP)-aktivierte Proteinkinase (AMPK), ein intrazellulärer Energie- und Stressrezeptor, die ROS-vermittelte Apoptose hemmen könnte. Darüber hinaus haben zunehmende Beweise gezeigt, dass die Hemmung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) für die Hemmung der neuronalen Apoptose von Vorteil sein könnte. Ein anderer Bericht zeigte, dass c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), extrazellulär regulierte Proteinkinasen (ERK), p38-MAPK-Signalwege potenziell die neuronale Apoptose regulieren können [8,9].

Basierend auf der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin,NiereEssenzmangel und Blutstauung gelten als grundlegende Pathogenese von DE. Daher die Strategie der ErnährungNierenund aktivierendes Blut wird üblicherweise in klinischen Anwendungen für DE verwendet. Frühere Studien konnten die modifizierte Wu-Zi-Yan-Zong-Rezeptur (MWP) bestätigen, eine Rezeptur, die auf Ernährung abzieltNieren, kann die kognitive Beeinträchtigung verbessern und Neuronen schützen, indem es die A-Toxizität reduziert [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) Rezeptur, bei der Blutegel basierend auf MWP hinzugefügt wird, ist speziell formuliertnährenNierenund Blut aktivieren. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die Verschreibung von BSHX das Gedächtnisverschlechterungssyndrom von DM-Patienten verbessern kann, was auf starke neuroprotektive Eigenschaften hindeutet [12]. Der genaue pharmakologische Mechanismus für BSHX bleibt jedoch unklar. In dieser Studie wollen wir die Schutzwirkung von BSHX-Extrakt auf HG-induzierte PC12-Zellen beobachten und mögliche molekulare Mechanismen untersuchen.

Methoden

Materialien und Reagenzien

Alle Kräuter wurden von Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Peking, China) bezogen und von Dr. PF Tu, Pharmakognostiker, gemäß dem Chinesischen Arzneibuch (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010) authentifiziert. 3- [4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) war von Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Ein Lactatdehydrogenase (LDH)-Testkit wurde vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute gekauft. (Nanjing, Jiangsu, China). Acridinorange (AO)/Ethidiumbromid (EB)-Doppelfärbekit und Hoechst 33258 wurden von Solar Co., Ltd. (Peking, China) bezogen. Ein Testkit für das mitochondriale Membranpotential mit JC-1, 2, 7--Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) wurde vom Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China) erworben. Primärantikörper für Caspase-3, gespaltene Caspase-3, PARP, gespaltenes PARP, Cytochrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK und -Tubulin wurden von Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA) erhalten.

Herstellung von BSHX-Extrakt

BSHX besteht aus sieben medizinischen Komponenten (Tabelle 1). Für die Zubereitung von BSHX-Extrakten werden Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) und Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) wurden im Verhältnis 8:8:4:1:2:1:8 gemischt und 30 min lang in ein Gesamtvolumen von 10 mal (v/w) destilliertem Wasser getaucht , dann 1 h gekocht und erneut 1 h in einem Gesamtvolumen von 5 mal (v/w) destilliertem Wasser gekocht. Die Überstände wurden vereinigt und durch Gefriertrocknung getrocknet. Der endgültige getrocknete Extrakt betrug 25 Prozent (w/w) des Gewichts der rohen Kräuter und ein Belegexemplar wurde im Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Peking University Health Science Center, Peking, China, hinterlegt.

Zellkultur

Ratten-Phäochromozytom-Zelllinien (PC12-Zellen) wurden von der Peking Union Medical College Cell Bank (Peking, China) erhalten und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Beijing, China), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (Biowest, Frankreich), gezüchtet ) und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (100×, Macgene, Beijing, China) in einem befeuchteten Inkubator mit 95 Prozent Luft und 5 Prozent CO2 bei 37 Grad.

Probenbehandlung

Im Vorversuch wurden PC12-Zellen mit BSHX-Extrakt (20, 50, 100 mg/l) allein für 48 h behandelt, um die Zytotoxizität zu bewerten. Für die Analyse der neuroprotektiven Wirkung von BSHX-Extrakt gegen durch hohe Glukose (HG) induzierte Neurotoxizität wurden PC12-Zellen 48 Stunden lang mit BSHX-Extrakt (20, 50, 100 mg/l) und HG (75 mM) behandelt, gefolgt von einem MTT-Assay für die Zelllebensfähigkeit. Alle anderen Assays wurden unter den gleichen Bedingungen mit einem BSHX-Extraktkonzentrationsbereich von 20 bis 100 mg/l durchgeführt.

Zelllebensfähigkeitstest

PC12-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 × 103 Zellen pro Well ausgesät. Nach 48-stündiger Inkubation mit BSHX-Extrakt (mit oder ohne HG) wurde der Überstand entfernt und MTT-Lösung (0,5 mg/ml) zugegeben. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 Grad wurde die MTT-Lösung entfernt und die Zellen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und 5 min geschüttelt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Zelllebensfähigkeit (Prozent)=[OD (Behandlung) – OD (leer)]/[OD (unbehandelte Kontrolle) – OD (leer)] × 100 Prozent .

LDH-Assay

PC12-Zellen wurden kultiviert und zur Behandlung mit HG- und BSHX-Extrakt stimuliert, wie zuvor beschrieben. Dann wurde das aus den Zellen freigesetzte LDH unter Verwendung eines kommerziellen LDH-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Die Absorption wurde bei 45 0 nm gemessen. LDH (U/L)=[OD (Behandlung) – OD (leer)] / [OD (Standard) – OD (leer)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258-Färbung und AO/EB-Färbung

Für die Färbung mit Hoechst 33258 wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten fixiert. Dann wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit Hoechst 33258-Arbeitslösung (1 ug/ml) im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bilder wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (IX73, Olympus, Japan) bei einer Anregungswellenlänge von 352 nm/Emissionswellenlänge von 461 nm aufgenommen. Entfernen Sie für die AO/EB-Färbung das Medium von den 96-Well-Platten und fügen Sie die AO/EB-Mischung (100 ug/ml AO und 100 ug/ml EB gemischt) für 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur hinzu. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops bei Anregungswellenlänge 490 nm/Emissionswellenlänge 530 nm für AO-Färbung und Anregungswellenlänge 520 nm/Emissionswellenlänge 590 nm für EB-Färbung sichtbar gemacht.

Intrazellulärer ROS-Nachweis

Für den intrazellulären ROS-Nachweis wurden PC12-Zellen in 6--Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 5 ausgesät und einer 24-stündigen Behandlung mit HG- und BSHX-Extrakt unterzogen. Nach 24-stündiger Inkubation wurden PC12-Zellen dreimal mit serumfreiem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium gewaschen und zu 10 μΜ 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCF-DA) gegeben, das zu fluoreszierendem 2',7'-Dichlorfluorescein oxidiert wurde (DCF) durch Hydroperoxide, bei 37 Grad für 30 min im Dunkeln. Dann wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und in PBS resuspendiert. Der intrazelluläre ROS-Spiegel wurde durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität durch Durchflusszytometrie (BD FACSCaliburTM, USA) nachgewiesen. Die Anregungs-/Emissionswellenlängen lagen bei 488/525 nm. Pro Probe wurden mindestens 10,000 Ereignisse gezählt. Die Werte wurden als mittlere Extinktion, normalisiert auf den Prozentsatz des Kontrollwertes, ausgedrückt.

Mitochondrialer Membranpotential-Assay

Die mitochondriale Depolarisation wurde unter Verwendung eines kommerziellen JC-1-Assay-Kits bewertet. Nach der Behandlung mit HG- und BSHX-Extrakt wurden die Zellen mit JC-1-Arbeitslösung (1 ×) bei 37 Grad für 15 min im Dunkeln inkubiert. Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit JC-1-Pufferlösung (1 ×). Die Zellen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops bei einer Anregungswellenlänge von 460 nm/Emissionswellenlänge von 530 nm für JC-1-Monomer (nachgewiesen in Zellen mit depolarisierten Mitochondrien) und einer Anregungswellenlänge von 520 nm/Emissionswellenlänge von 590 nm für JC{{13) sichtbar gemacht }} Polymer (vorhanden in polarisierten Mitochondrien). Von den Zellen mit grüner (monomerer) Fluoreszenz wurde angenommen, dass sie depolarisierte Mitochondrien aufwiesen; die Zellen mit roter (polymerer) Fluoreszenz wurden als Zellen mit normalen Mitochondrien betrachtet.

Western-Blot-Analyse

PC12-Zellen wurden gesammelt und in kaltem RIPA-Puffer mit einem 1 × Cocktail-Protease-Inhibitor lysiert. Der Überstand wurde durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 12,000 U/min für 10 min bei 4 Grad gesammelt. Proteinkonzentrationen wurden durch den Bradford-Assay bestimmt. Mit Cytosol und Mitochondrien angereicherte Fraktionen wurden mit dem Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, USA) für die Cytochrom-c-Analyse isoliert. Für andere Proteine ​​wurden Gesamtzelllysate durch SDS-PAGE (10 Prozent -15 Prozent) getrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die Polyvinylidenfluoridmembranen wurden dann mit 5 % fettfreier Milch blockiert und mit den angegebenen primären Antikörpern bei 4 Grad über Nacht inkubiert. Die Membranen wurden dreimal mit PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,1 Prozent Tween 20) gewaschen und mit Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. Dann wurden die Membranen weitere dreimal mit PBST gewaschen und unter Verwendung eines verbesserten chemilumineszierenden Substrats sichtbar gemacht und mit dem Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA) gescannt.

statistische Analyse

Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen Mittelwerten wurde durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung des Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0-Software) bestimmt. P < 0,05="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="">

Ergebnisse

BSHX-Extrakt schützt PC12-Zellen vor HG-induzierter Zellschädigung

Um zu untersuchen, ob BSHX-Extrakt PC12-Zellen vor HG-Befall schützen könnte, behandelten wir PC12-Zellen mit einer Reihe von BSHX-Extraktkonzentrationen (20, 50 und 100 mg/l) für 48 h unter HG-Bedingungen (75 mM). Die Bewertung der Zelllebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assays zeigte, dass die HG-Beleidigung eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit von PC12-Zellen verursachte (die Zelllebensfähigkeit betrug ungefähr 56,9 ± 6,7 Prozent) und dass die Behandlung mit BSHX-Extrakt den Zelltod in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant verhinderte. Die Zelllebensfähigkeit stieg auf 87,8 ± 9,2 Prozent, wenn die Zellen gleichzeitig mit BSHX-Extrakt (100 mg/l) behandelt wurden (Abbildung 1A). Laktatdehydrogenase (LDH) wird aus geschädigten Zellen freigesetzt und kann daher auch als Indikator für Zelltoxizität verwendet werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des MTT-Assays stellten wir fest, dass die HG-Beleidigung die LDH-Freisetzung aus PC12-Zellen signifikant erhöhte und dass die Behandlung mit BSHX-Extrakt die LDH-Freisetzung auf konzentrationsabhängige Weise verhinderte (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der BSHX-Extrakt die Lebensfähigkeit der Zellen erhöht in HG-induzierten PC12-Zellen.

BSHX-Extrakt hemmt die Apoptose von PC12-Zellen über den Caspase-9/3--abhängigen Signalweg

Um die Wirkung von BSHX-Extrakt auf die Zellapoptose zu bestimmen, verwendeten wir den DNA-Farbstoff Hoechst 33258 als sensitiven Assay für Apoptose. Die mit Hoechst 33258 gefärbten Zellkerne normaler Zellen zeigten eine gleichmäßige blaue Fluoreszenz, während apoptotische Zellen, die eine Kernchromatinwolkenpyknose aufwiesen, hyperchromatische und dichte fluoreszierende Partikel zeigten. Der Prozentsatz der Apoptose wurde gemäß der Anzahl an apoptotischen Zellen gegenüber der Gesamtzahl an Zellen berechnet. Unsere Daten zeigten, dass die HG (75 mM)-Beleidigung den Anteil apoptotischer Zellen dramatisch erhöhte (51,7 ± 4,3 Prozent) und die Behandlung mit BSHX-Extrakt signifikant vor HG-induzierter Apoptose in PC12-Zellen schützte (Abbildung 2A). Diese Ergebnisse wurden weiter durch die AO/EB-Doppelfärbungsanalyse gestützt. AO dringt sowohl in normale als auch in apoptotische Zellen ein und emittiert grüne Fluoreszenz, während EB nur in apoptotische Zellen eindringt und rote Fluoreszenz emittiert [13]. Der AO/EB-Assay zeigte, dass der Prozentsatz apoptotischer Zellen nach HG (75 mM) Insult (47,8,7 ± 2,6 Prozent) signifikant zunahm und nach Behandlung mit BSHX-Extrakt in PC12-Zellen abnahm (Abbildung 2B), was darauf hindeutet, dass BSHX-Extrakt wirksam sein könnte hemmen die durch HG induzierte Apoptose von PC12-Zellen.

Dann untersuchten wir die Wirkung von BSHX-Extrakt auf den Caspase-3/PARP-Weg, einen wichtigen Weg für mitochondrienbezogene Apoptose [14]. Western Blot zeigte, dass HG (75 mM) Insult die Expression aktiver Formen von Caspase-3 und PARP signifikant erhöhte und die Expression von Gesamtcaspase-3 und PARP in PC12-Zellen verringerte, und dieser Effekt wurde deutlich umgekehrt durch Behandlung mit BSHX-Extrakt (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass BSHX-Extrakt PC12-Zellen über die Regulierung des mitochondrienabhängigen Caspase-3/PARP-Signalwegs effektiv vor Apoptose schützte.

BSHX-Extrakt hemmt die intrazelluläre ROS-Produktion in HG-induzierten PC12-Zellen

Da HG die Bildung von intrazellulärem ROS verstärken könnte [15], testeten wir den Gehalt an intrazellulärem ROS, um festzustellen, ob BSHX-Extrakt die Bildung von ROS hemmen könnte. Es wurde ein 3,23--facher Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität in PC12-Zellen beobachtet, die 48 h lang 75 mM HG im Vergleich zur Kontrolle ausgesetzt wurden. Im Gegensatz dazu verringerte die gleichzeitige Behandlung mit BSHX-Extrakt die mittlere Fluoreszenzintensität signifikant auf etwa 0,76-, 0,{{10}} und 0,{ {12}}-fach der Modellgruppe, was darauf hindeutet, dass BSHX-Extrakt die durch HG induzierte Produktion von ROS hemmen könnte (Abbildungen. 3A, B).

BSHX-Extrakt hält die mitochondriale Homöostase in HG-induzierten PC12-Zellen aufrecht, indem es die Bax- und Bcl-2-Expression reguliert

Das mitochondriale Membranpotential ist ein wichtiger Parameter der mitochondrialen Funktion, der als Indikator für die Zellgesundheit verwendet wird. JC-1 ist ein lipophiler, kationischer Farbstoff, der selektiv in die Mitochondrien eindringen und mit steigendem Membranpotential reversibel die Farbe von grün nach rot ändern kann. In gesunden Zellen mit hohem mitochondrialen Membranpotential bildet JC-1 spontan Komplexe, die als J-Aggregate mit intensiver roter Fluoreszenz bekannt sind. Andererseits bleibt JC-1 in apoptotischen Zellen mit niedrigem mitochondrialen Membranpotential in der monomeren Form, die nur grüne Fluoreszenz zeigt [16, 17]. Das Verhältnis von grüner Fluoreszenz zu roter Fluoreszenz kann daher die mitochondriale Depolarisation widerspiegeln. In unserer Studie war die Anzahl der Zellen mit depolarisierten Mitochondrien (grüne Fluoreszenz) nach HG (75 mM) für 48 h signifikant erhöht, und dieser Anstieg wurde durch die Behandlung mit BSHX-Extrakt konzentrationsabhängig umgekehrt (Abbildung 4A).

Als nächstes entdeckten wir die mitochondriale und zytoplasmatische Verteilung von Cytochrom c, einem Schlüsselspieler im Aktivierungs-Caspase-abhängigen Apoptoseweg. Wir fanden heraus, dass HG (75 mM) Insult für 48 h eine dramatische Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma induzierte, und diese Relokation wurde durch die Behandlung mit BSHX-Extrakt signifikant verhindert (Abbildung 4B), was darauf hinweist, dass BSHX-Extrakt die Freisetzung von hemmen könnte Cytochrom c aus Mitochondrien.

Darüber hinaus sind Proteine ​​der Bcl-2-Familie wichtige Regulatoren verschiedener apoptotischer Wege. Bcl-2 kann die Zellapoptose hemmen, die durch eine Vielzahl zytotoxischer Faktoren verursacht wird, und ist der Inhibitor der Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma. Allerdings ist Bax als Mitglied der Bcl-2-Familie ein Pro-Apoptose-Faktor. Wenn Apoptose induziert wird, wandert Bax aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien und zerstört die mitochondriale Integrität [5, 18]. In unserer Studie wurde der Proteinspiegel von Bcl-2 durch HG (75 mM) Insult für 48 h herunterreguliert und Bax hochreguliert, dieser Effekt wurde durch BSHX-Extrakt konzentrationsabhängig umgekehrt (Abbildung 4C). Alle diese oben genannten Ergebnisse deuteten darauf hin, dass BSHX-Extrakt PC12-Zellen vor HG-induzierter mitochondrialer Depolarisation schützte, indem es die Expression von Bax und Bcl-2 regulierte.

Wirkung von BSHX-Extrakt auf Zellapoptose über JNK/p38 MAPK-Signalwege

Einige Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte ROS-Produktion mit der Aktivierung von MAPK-Wegen in Verbindung gebracht wurde, um Zellapoptose auszulösen9 [19, 20]. Daher untersuchten wir die Wirkung von BSHX-Extrakt auf den Signalweg der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK), um festzustellen, ob BSHX-Extrakt die HG-induzierte Apoptose abschwächen könnte. Wie in Abbildung 5 gezeigt, erhöhte HG (75 mM) Insult für 48 h die Phosphorylierungen von c-Jun NH2--terminaler Kinase (JNK) und p38 in PC12-Zellen, die durch BSHX-Extrakt in einer Konzentration signifikant gehemmt wurden - abhängige Weise. Ein ähnliches Ergebnis wurde jedoch mit extrazellulärer regulierter Proteinkinase (ERK) MAPK nicht beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass BSHX-Extrakt die HG-induzierte Zellapoptose über JNK/p38 MAPK-Signalwege hemmen könnte.

Diskussion

Die diabetische Enzephalopathie (DE) ist eine häufige Komplikation des Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM). Es kann kognitive Beeinträchtigungen des Gehirns verursachen und ist ein wichtiger Risikofaktor für Mortalität und Behinderung bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus weltweit [3]. Daher ist es wichtig, den Mechanismus von DE sowie seine Präventions- und Behandlungsstrategien zu untersuchen.

Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird in China seit vielen Jahren zur Behandlung von DM eingesetzt und hat eine heilende Wirkung gezeigt. Einige klinische Studien deuten darauf hin, dass TCMs, die auf nährenden Nieren und aktivierenden Blutstrategien basieren, den Blutzuckerspiegel herunterregulieren, die Durchblutung fördern und die kognitive Dysfunktion des Gehirns verbessern können. BSHX Rezept ist ein Vertreter dieser TCMs. Unsere vorläufige klinische Studie zeigte, dass die Verschreibung von BSHX den Blutzucker, das Homocystein (HCY) und das hochempfindliche C-reaktive Protein (hs-CPR) im Serum wirksam verbessern und die kognitive Funktion von Diabetikern mit leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI) verbessern kann. [12]. Bisher fehlt es jedoch an Beweisen, um die Wirksamkeit und den pharmakologischen Mechanismus zu beweisen.

In dieser Studie stellten wir fest, dass BSHX-Extrakt die durch HG induzierte Reduzierung der Zelllebensfähigkeit abschwächen konnte, gemessen durch MTT, LDH-Assay. Um die schützende Wirkung von BSHX-Extrakt auf die Zelllebensfähigkeit weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Apoptose durch Hoechst 33258 und die AO/EB-Färbungsanalyse. Die Ergebnisse zeigten, dass BSHX-Extrakt die durch HG induzierte Apoptose signifikant reduzieren konnte. Als Apoptosemarker waren Caspase-3 und PARP nach Behandlung mit HG signifikant erhöht, jedoch wurde die Aktivierung dieser pro-apoptotischen Faktoren durch BSHX-Extrakt konzentrationsabhängig gehemmt. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass BSHX-Extrakt eine schützende Wirkung auf PC12-Zellschäden hatte, die durch HG induziert wurden.

ROS wird während des Prozesses der oxidativen Phosphorylierung von Zellen gebildet, und seine Produktionssteigerung oder die Schädigung antioxidativer Systeme kann zu oxidativem Stress in Zellen führen [21]. Studien haben gezeigt, dass eine hohe Glukose zur Akkumulation von intrazellulärem ROS und schließlich zu einem aktiven apoptotischen Signalweg führen kann. Und der gemeinsame Mechanismus diabetischer Komplikationen ist oxidativer Stress [22, 23]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine hohe Glukose zu einem Anstieg von ROS in PC12-Zellen führen könnte, was mit früheren Studien übereinstimmte [24]. Es wird spekuliert, dass die Toxizität von hoher Glukose für Zellen durch ROS-induzierte Apoptose erreicht werden kann. Mitochondrien sind die Hauptorte der intrazellulären ROS-Produktion und auch das Hauptzielorgan für ROS-Angriffe [25]. Unter pathologischen Bedingungen kann der schnelle Anstieg von ROS zu einer mitochondrialen Dysfunktion, einem Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials und schließlich zu Zellapoptose führen [26]. Wir haben also die Unversehrtheit der Mitochondrien festgestellt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine hohe Glukose das mitochondriale Membranpotential signifikant verringerte, das Verhältnis von Bax/Bcl-2 erhöhte, das den Schalter der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (MPTP) kontrollierte, und das Austreten von Cytochrom c förderte, während BSHX-Extrakt dies konnte diese Änderungen rückgängig machen. Diese legen nahe, dass die neuroprotektive Wirkung von BSHX-Extrakt gegen HG-induzierte PC12-Zellen aus der Aufrechterhaltung der Integrität von Mitochondrien resultieren kann.

Der MAPK-Signalweg spielt auch eine wichtige Rolle bei der Zellapoptose. JNK, ERK und p38 MAPK sind die am besten untersuchten Mitglieder der MAPK-Familie. Ihre Hauptwirkung besteht darin, ihre spezifischen Stellen zu phosphorylieren und dadurch die Zellapoptose zu regulieren [8, 27, 28]. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass eine übermäßige Produktion von ROS die p38MAPK-Phosphorylierung [29-31] auslösen kann und ROS die Aktivierung der MAPK-Signalwege induzieren oder vermitteln kann [32]. Mehrere zelluläre Stimuli, die die ROS-Produktion auch parallel induzieren, können MAPK-Wege in mehreren Zelltypen aktivieren [32, 33]. Die möglichen Mechanismen für die MAPK-Aktivierung durch ROS können die Inaktivierung und den Abbau der MAPK-Phosphatasen umfassen, die den Signalweg in einem inaktiven Zustand halten [19]. Um andererseits weiter zu bestätigen, ob MAPK-Wege durch die ROS-Erzeugung aktiviert wurden, wurden die Zellen mit Antioxidantien (z. B. NAC, einem ROS-Fänger) vorbehandelt, um eine ROS-Ansammlung zu verhindern. Und die Ergebnisse zeigten, dass die MAPK-Aktivierung nach Zellstimulation mit zellulären Stimuli fast gehemmt wurde [32, 33], was auf die Beteiligung von ROS-Inaktivierung von MAPK-Signalwegen hinweist. Darüber hinaus zeigten Studien, dass bei Behandlung von Zellen mit dem spezifischen JNK-Inhibitor SP600125 die durch Cardiotoxin III induzierte Apoptose blockiert werden konnte [34]. Unsere frühere Studie ergab, dass eine modifizierte Wu-Zi-Yan-Zong-Rezeptur (MWP) die Aktivierung von ERK/p38 MAPK in A-aktivierten BV2-Mikroglia hemmen könnte [10]. In dieser Studie fanden wir jedoch heraus, dass BSHX-Extrakt die Phosphorylierung von JNK und p38 MAPK hemmen konnte, und wir erzielten nicht das gleiche Ergebnis mit p-ERK. Wir spekulieren, dass Blutegel im BSHX-Extrakt eine andere Rolle spielen. Die Ergebnisse legen nahe, dass ein weiterer Schutzmechanismus des BSHX-Extrakts gegen Apoptose in HG-induzierten PC12-Zellen durch die Regulierung der JNK/p38-MAPK-Signalwege erfolgen könnte.

Fazit

BSHX-Extrakt, eine polykräuterartige Formel, zeigt neuroprotektive Wirkungen auf PC12-Zellen gegen HG-Befall. Der BSHX-Extrakt hemmte wirksam die HG-induzierte PC12-Zellapoptose, indem er die intrazelluläre ROS-Erzeugung verringerte, die Integrität der mitochondrialen Membran aufrechterhielt und die Caspase-3- und JNK/p38-MAPK-Signalwege blockierte (Abbildung 6). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass BSHX-Extrakt ein vielversprechendes Mittel zur Behandlung von DE in klinischen Anwendungen ist.

Autorenbeiträge

Konzipierte und gestaltete die Experimente: Zeng KW, Wang XM. Führte das Experiment durch: Zhao SY. Analysiert die Daten: Zhao SY, Zeng KW und Wang XM. Beigesteuerte Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW und Wang XM. Schrieb den Pater: Zhao SY.

Verweise

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Das diabetische Gehirn und Kognition. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Hirnverletzung mit Diabetes mellitus: Beweise, Mechanismen und Auswirkungen auf die Behandlung. Experte Rev. Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Die Theorie des "metabolischen Gedächtnisses" und die frühe Behandlung von Hyperglykämie zur Vorbeugung diabetischer Komplikationen. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Das mitochondriale Membranpotential (Δψm) bei Apoptose; ein Update. Apoptose 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Verbindung von mitochondrialen Dynamiken und Ereignissen auf Leben und Tod durch Proteine ​​der Bcl-2-Familie. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. P. Bernardi, L. Scorrano, R. Colonna et al. Mitochondrien und Zelltod. Mechanistische Aspekte und methodische Fragen. Februar J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L., Wu L., Du S., et al. 1,25-(OH)2D3 hemmt die durch hohe Glukose induzierte Apoptose und ROS-Produktion in menschlichen peritonealen Mesothelzellen über den MAPK/P38-Signalweg. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman, R., Jiang, H., Schaefer, E., et al. Die Vorbehandlung mit dem Nervenwachstumsfaktor dämpft die durch Sauerstoff- und Glukosemangel induzierte Aktivierung der aminoterminalen c-Jun-Kinase 1 und der stressaktivierten Kinasen p38 und p38 und verleiht dem Phäochromozytom-PC12-Modell Neuroprotektion. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. W. Zou, J. Zeng, M. Zhuo, W. Xu, L. Sun, J. Wang et al. Beteiligung von Caspase-3 und p38-Mitogen-aktivierter Proteinkinase an der Kobaltchlorid-induzierten Apoptose in PC12-Zellen. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Antineuroinflammatorische Wirkungen der modifizierten Wu-Zi-Yan-Zong-Verschreibung bei -Amyloid-stimulierter BV2-Mikroglia über die NF-κB- und ERK/p38-MAPK-Signalwege. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Die modifizierte Wu-Zi-Yan-Zong-Rezeptur, eine traditionelle chinesische Polykräuterformel, unterdrückt Lipopolysaccharid-induzierte neuroinflammatorische Prozesse in Ratten-Astrozyten über NF-κB- und JNK/p38-MAPK-Signalwege. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. H. Fu, WW Lin, H. Wang et al. Wirkung der Verschreibung von Bushen Huoxue auf die Behandlung von leichten kognitiven Beeinträchtigungen bei Typ-2-Diabetes. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Analyse der Cycloheximid-induzierten Apoptose in menschlichen Leukozyten: Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Annexin V/Propidiumiodid versus Acridinorange/Ethidiumbromid. Zellbiol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L., Lópezsoto A., Kumar S., et al. Caspasen verbinden die Zelltod-Signalgebung mit der Homöostase des Organismus. Immunität 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Stickoxid: ein Schlüsselfaktor hinter der Dysfunktion von endothelialen Vorläuferzellen beim Typ Diabetes mellitus-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. A. Perelman, C. Wachtel, M. Cohen et al. JC-1: Alternative Anregungswellenlängen erleichtern die mitochondriale Membranpotentialzytometrie. Zelltod Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Mitochondriale Membranpotentialsonden und der Protonengradient: ein praktischer Anwendungsleitfaden. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Wie induzieren BCL-2-Proteine ​​die Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Sohn Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Mitogen-aktivierte Proteinkinasen und reaktive Sauerstoffspezies: Wie können ROS MAPK-Signalwege aktivieren? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Aromatische heterocyclische Ester von Podophyllotoxin üben über den ROS/MAPK-Signalweg eine Anti-MDR-Aktivität in humanen Leukämie-K562/ADR-Zellen aus. Eur. J. Med. Chem. 2016, 123: 226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Ausrichtung auf Glykogensynthasekinase-3 für therapeutischen Nutzen gegen oxidativen Stress bei der Alzheimer-Krankheit: Beteiligung des Nrf2-ARE-Signalwegs. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Die Rolle von oxidativem Stress bei diabetischer Neuropathie: Erzeugung freier Radikale in der Glykationsreaktion und Genpolymorphismen, die antioxidative Enzyme für die genetische Anfälligkeit für diabetische Neuropathie in Populationen von Patienten mit Typ-I-Diabetes codieren. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Zelltod, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und diabetische Komplikationen. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K., Zhang M., Chen BD, et al. Ginkgolid B hemmt die Apoptose in durch hohe Glukose stimulierten Endothelzellen der menschlichen Nabelvene. Chinesisches Pharmakologisches Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Schädliche Rolle der Superoxiddismutase im mitochondrialen Intermembranraum. J. Biol. Chem. 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Stockwerk KB. Mitogen-aktivierte Proteinkinasen: neue Signalwege, die bei zellulären Reaktionen auf Umweltstress funktionieren. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N., Lin X., Zhao X., et al. MiR-125b wirkt als Onkogen in Glioblastomzellen und hemmt die Zellapoptose über p53- und p38MAPK-unabhängige Signalwege. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L., Yu X., Yang H., et al. Fortgeschrittene Glykationsendprodukte induzieren die Apoptose menschlicher Hornhautepithelzellen durch die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies und die Aktivierung von JNK- und p38-MAPK-Wegen. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H., Kim E., Lee DH, et al. Ghrelin hemmt die Apoptose in neuronalen Zellen des Hypothalamus während eines Sauerstoff-Glucose-Mangels. Endokrinologie 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A verändert regulatorische Proteine ​​des Zellzyklus und induziert Apoptose durch reaktive Sauerstoffspezies-abhängige p38MAPK-Aktivierung in der menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. ROS-induzierte oxidative Schädigung, die an der Pathogenese von Pilzkeratitis über p38-MAPK-Aktivierung beteiligt ist. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Durch reaktive Sauerstoffspezies induzierte Aktivierung der MAP-Kinase-Signalwege. Antioxid-Redox-Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox-Signalisierung und die MAP-Kinase-Signalwege. Biofaktoren 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxin III induziert c-jun N-terminale Kinase-abhängige Apoptose in humanen HL-60-Leukämiezellen. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.