NGF moduliert den Cholesterinstoffwechsel und stimuliert die ApoE-Sekretion in Gliazellen und verleiht so Neuroprotektion gegen oxidativen Stress Teil 1

Abstrakt:

Cholesterin spielt eine entscheidende Rolle im Gehirn, wo die Astrozytenaktivität insbesondere den Stoffwechsel reguliert. Tatsächlich unterdrücken erwachsene Neuronen ihre Cholesterinbiosynthese und importieren dieses Sterol über ApoE-reiche Partikel, die von Astrozyten abgesondert werden. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Nervenwachstumsfaktor (NGF) eine neurotrophe Aktivität ausüben kann, indem er den Zellstoffwechsel beeinflusst.

Neuronen sind die Grundeinheiten, aus denen das menschliche Gehirn besteht. Durch die Verbindungen zwischen Neuronen bilden sie unsere Großhirnrinde, die unser gesamtes Wissen und unsere Erinnerungen trägt. Daher sind Neuronen eng mit der Gedächtnisfähigkeit verbunden.

Die Hauptfunktion von Neuronen besteht darin, Informationen zu übertragen. Jedes Neuron verfügt über eine Synapse, die die Dendriten und Axone anderer Neuronen verbindet. Wenn ein Neuron ein Signal empfängt, leitet es das Signal an die Neuronen weiter, mit denen es verbunden ist. Diese Signalübertragung, neuronale Übertragung genannt, ist einer der Schlüsselprozesse bei der Bildung, Speicherung und dem Abruf von Erinnerungen.

Indem wir unser Gehirn gesund halten, können wir durch Bewegung die ordnungsgemäße Funktion unserer Neuronen fördern. Körperliche Bewegung verbessert die Durchblutung und Sauerstoffversorgung des Gehirns und erhöht dadurch die Anzahl und Verbindungen der Neuronen. Gleichzeitig können vielfältige soziale Aktivitäten und Lernaktivitäten neue Neuronen in neuen Hirnarealen bilden und die Plastizität des Gehirns erhöhen.

Wenn wir mehr und aktivere Neuronen haben, wird unser Gedächtnis stärker. Die Synchronisation zwischen Neuronen in der Großhirnrinde wird gleichmäßiger, was es für uns einfacher macht, Informationen zu speichern und abzurufen und unsere kognitiven Fähigkeiten zu verbessern. Darüber hinaus verbessern eine große Anzahl von Neuronen und Verbindungen zwischen Neuronen auch unsere Reaktionsgeschwindigkeit und Entscheidungsfähigkeit.

Daher gehen die Erhaltung gesunder Neuronen und die Verbesserung des Gedächtnisses Hand in Hand. Wir können unser Gedächtnis verbessern, indem wir gesunde Neuronen fördern, indem wir uns auf körperliche Bewegung, verschiedene soziale Aktivitäten und Lernaktivitäten sowie Ernährungsgewohnheiten konzentrieren. Lassen Sie uns zusammenarbeiten, um die Gesundheit unseres Gehirns zu unterstützen! Es ist ersichtlich, dass wir unser Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen ist, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Hackfleisch beruht auf einer Vielzahl von darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Carbonsäuren, Polysaccharide, Flavonoide usw. Diese Inhaltsstoffe können über verschiedene Kanäle die Gesundheit des Gehirns fördern.

Klicken Sie auf Möglichkeiten zur Verbesserung der Gehirnfunktion

Dennoch ist die Wirkung von NGF auf die Glia-Cholesterin-Homöostase noch nicht geklärt. In diesem Projekt soll untersucht werden, ob NGF den Cholesterinstoffwechsel in Gliazellen beeinflussen könnte. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die von Astrozyten abgeleitete Zelllinie U373 als experimentelles Modell verwendet. Immunblot- und ELISA-Analysen zeigten, dass Proteine ​​und Enzyme, die zum Netzwerk des Cholesterinstoffwechsels gehören, durch die NGF-Behandlung in Gliazellen erhöht wurden. Darüber hinaus erhöhte NGF die ApoE-Sekretion und die Menge an extrazellulärem Cholesterin im Kulturmedium signifikant.

Co-Kultur- und U373--konditionierte Medium-Experimente zeigten, dass die NGF-Behandlung der Rotenon-vermittelten Zytotoxizität in neuronalen N1E-115-Zellen wirksam entgegenwirkte. Umgekehrt wurde die durch die NGF-Behandlung vermittelte Neuroprotektion unterdrückt, wenn N1E-115 zusammen mit ApoE-stummgeschalteten U373-Zellen kultiviert wurden. Diese Daten legen nahe, dass NGF die Cholesterinhomöostase in Gliazellen kontrolliert. Noch wichtiger ist, dass NGF einen Neuroschutz gegen oxidativen Stress ausübt, der wahrscheinlich mit der Induktion der Glia-ApoE-Sekretion verbunden ist.

Schlüsselwörter:

ApoE; Astrozyt; Cholesterin; Differenzierung; Nervenwachstumsfaktor; Stoffwechsel; Neuron; reaktive Sauerstoffspezies; Rotenon.

1. Einleitung

Das Gehirn zeichnet sich durch den höchsten Cholesterinspiegel im gesamten Körper aus [1]. Die außergewöhnliche Konzentration dieses Sterols im Zentralnervensystem (ZNS) wird durch die Tatsache gerechtfertigt, dass Cholesterin an mehreren grundlegenden biologischen Prozessen beteiligt ist. Bemerkenswert ist, dass eine erhebliche Menge Cholesterin in die Plasmamembranen von Astrozyten und Neuronen integriert wird, wo es für eine ordnungsgemäße Zellmorphologie und die korrekte Funktion von Membranrezeptoren und synaptischer Neurotransmission sorgt [2].
Cholesterin ist auch wichtig für die Bildung neuer Membranen, die für das Neuritenwachstum, die Synaptogenese und die Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich sind, und ist daher von entscheidender Bedeutung für die neuronale Differenzierung und Reifung [3–7].

Im Wesentlichen stammt das gesamte Cholesterin im Gehirn aus der De-novo-Biosynthese in situ. Insbesondere verhindert die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​die Aufnahme von Cholesterin aus Lipoproteinen, die durch den systemischen Kreislauf transportiert werden [8]. Aus diesem Grund entwickeln Nervenzellen ein beispielhaftes regulatorisches Netzwerk, um ihren eigenen Bedarf an diesem Lipid selbstständig zu steuern. Ein allgemein anerkanntes Modell besagt, dass nach der Embryogenese, während der postnatalen Phase, die Cholesterinbiosynthese in Neuronen dramatisch abnimmt, wobei versucht wird, die für die Erzeugung der Aktionspotentiale aufgewendete Energie einzusparen.

Dementsprechend erfüllten Astrozyten den zweifelhaften neuronalen Bedarf an Cholesterin, dessen Synthese besonders ausgeprägt ist [1,9,10]. Die Abgabe von Cholesterin, das von Astrozyten produziert wird, an Neuronen impliziert einen eleganten Mechanismus des horizontalen Transports, an dem kritische Proteine ​​und Partikel beteiligt sind. Insbesondere beginnt der Cholesterinexport in Astrozyten, wo neosynthetisiertes Cholesterin in entstehende Lipoproteinpartikel geladen wird, die Apolipoprotein E (ApoE) enthalten. Es häufen sich Hinweise darauf, dass die Lipidierung ApoE-reicher Partikel durch die Transporter-ATP-Bindungskassette A1 (ABCA1) vermittelt wird [11]. Anschließend werden ApoE-haltige Lipoproteine, sobald sie in den extrazellulären Raum freigesetzt werden, durch rezeptorvermittelte Endozytose von Neuronen aufgenommen. Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor (LDLr) und LDLr-verwandtes Protein 1 (LRP1) [12].

Entsprechend der zentralen Rolle von aus Astrozyten stammendem Cholesterin bei der neuronalen Homöostase deuten experimentelle Ergebnisse darauf hin, dass in ApoE-reichen Lipoproteinen enthaltenes Cholesterin die Dendritendifferenzierung und die synaptische Funktion deutlich steigert [13,14]. Accordinastrozyten-konditioniertes Medium aus Astrozyten der Huntington-Krankheit (HD), die nur eine geringe Menge an ApoE-Lipoprotein-gebundenem Cholesterin absondern, beeinträchtigt das Neuritenwachstum und die synaptische Aktivität in Huntington-Neuronen erheblich [15].

Die neurotrophe Wirkung von aus Astrozyten stammenden ApoE-haltigen Partikeln wird durch die Auswirkungen eines ApoE-Mangels, der die adulte Neurogenese im Hippocampus deutlich behindert, zusätzlich verstärkt (16). Der Cholesterin-Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen ist auch für den Neuroschutz vor oxidativem Stress von entscheidender Bedeutung. Einige Berichte zeigen beispielsweise, dass ApoE oxidative Schäden und Apoptose verhindert, die durch die Exposition gegenüber Wasserstoffperoxid verursacht werden [17,18].

Aus diesen Beobachtungen geht hervor, dass die Aufrechterhaltung der Cholesterinhomöostase im Gehirn notwendig ist, um die Funktion der Nervenzellen zu gewährleisten, und dass die Stoffwechselwege, die der Regulierung dieses Lipids zugrunde liegen, genau kontrolliert werden sollten, um das Auftreten mehrerer neurophysiologischer Prozesse zu gewährleisten.

In den letzten Jahren haben sich Neurotrophine als wesentliche Akteure im Zellstoffwechsel herausgestellt [2,19–22]. Neurotrophine gehören zu einer kleinen Familie von Wachstumsfaktoren, die unbestreitbar eine Rolle bei der neuronalen Entwicklung, dem Überleben und der Plastizität spielen [23]. In jüngerer Zeit wurden diese Signalmoleküle auch als entscheidende Modulatoren des Zellstoffwechsels, einschließlich des Cholesterinstoffwechsels, erkannt [2,22].

Experimentelle Erkenntnisse belegen, dass der Nervenwachstumsfaktor (NGF), das Prototypmitglied der Neurotrophinfamilie, die Cholesterinbiosynthese in neuronalen Zellen und Hepatozyten stimuliert [24,25]. Interessanterweise ist an diesen Ereignissen zumindest teilweise der niederaffine Neurotrophinrezeptor p75NTR beteiligt, der die Aktivierung des Sterol-Regulierungselement-Bindungsproteins 2 (SREBP-2) auslöst und wiederum die Transkription von Cholesterin induziert Gene [25]. Die Aktivität von NGF auf den Cholesterinstoffwechsel ist nicht auf die Biosynthese beschränkt, da es auch die Cholesterinaufnahme fördert, indem es die LDLr-Expression in Neuronen erhöht [26].

Trotz dieser Informationen scheint das Wissen über den möglichen Beitrag von NGF bei der Regulierung der Cholesterinhomöostase immer noch besonders begrenzt zu sein. Insbesondere mangelt es an systematischen Studien, die die Rolle von NGF bei der Regulierung des Cholesterinstoffwechsels in Astrozytenzellen untersuchen. Angesichts der Tatsache, dass von Astrozyten produziertes Cholesterin für die neuronale Physiologie unerlässlich ist, ist es wichtig zu verstehen, ob es den Cholesterinstoffwechsel in Gliazellen sowie den interzellulären Cholesterintransport beeinflussen kann, dessen besondere Regulierung für die Gesundheit des Gehirns unerlässlich ist.

Ziel dieser Arbeit ist es, die voraussichtliche Beteiligung von NGF an der Modulation des Cholesterinstoffwechsels in Gliazellen sowie seinen Einfluss auf die neuronale Differenzierung und das neuronale Überleben unter oxidativen Stressbedingungen zu untersuchen.

2. Ergebnisse

2.1. U373 exprimiert sowohl die NGF-Rezeptoren TrkA als auch p75NTR

NGF wurde ursprünglich als Wachstumsfaktor mit einem spezifischen Tropismus für neuronale Zellen identifiziert. Allerdings häufen sich Beweise dafür, dass dieses Neurotrophin auch biologische Wirkungen in mehreren nicht-neuronalen Zellen und Geweben hervorruft [22]. Die Aktivität von NGF wird durch seine Bindung an den hochaffinen Rezeptor TrkAd an den niedrigaffinen Rezeptor p75NTR sichergestellt [2].

Daher haben wir zunächst festgestellt, ob U373-Zellen NGF-Rezeptoren exprimieren. Insbesondere handelt es sich bei U373 um eine Astrozytom-Zelllinie, die häufig als Astrozyten-Zellkulturmodell eingesetzt wird, da mehrere Berichte darauf hinwiesen, dass sie die morphologischen, metabolischen und funktionellen Eigenschaften von Astrozyten widerspiegeln [27–29]. Laut veröffentlichten Daten [30] zeigte die Immunfluoreszenzanalyse, dass U373-Zellen sowohl TrkA als auch p75NTR in nennenswerten Mengen exprimieren (Abbildung S1A). Diese Ergebnisse wurden auch durch Western-Blot-Analyse bestätigt, was darauf hindeutet, dass U373-Zellen das Potenzial haben, vollständig auf NGF zu reagieren.

Da die Verabreichung von NGF die Expressionsniveaus seiner Rezeptoren beeinflussen und möglicherweise das Gleichgewicht zwischen den durch TrkA und/oder p75NTR ausgelösten Signalwegen verändern kann (31–33), wurde die Expression beider Rezeptoren auch nach 48 Stunden NGF-Behandlung überprüft. Allerdings wurden nach der Stimulation mit dem Neurotrophin keine Veränderungen in der Proteinmenge von TrkA und p75NTR beobachtet (Abbildung S1B).

2.3. NGF erhöht die Cholesterinsekretion durch U373 in das Kulturmedium

Die erhaltenen Ergebnisse veranlassten uns zu untersuchen, ob die durch NGF vermittelten Wirkungen die Modulation des Cholesteringehalts widerspiegeln könnten. Eine Ölrot-O-Färbung wurde durchgeführt, um neutrale Lipide, einschließlich Cholesterinester, sichtbar zu machen. Die Größe und Anzahl der in U373-Zellen gefundenen Lipidtröpfchen ähnelte denen, die für primäre Astrozyten berichtet wurden [34,35].

Bei der NGF-Behandlung wurden jedoch keine Veränderungen beobachtet (Abbildungen 2A und S2A, B). Ebenso wurden keine Veränderungen in der Menge an freiem Cholesterin festgestellt, bewertet durch Filipin-Färbung (Abbildungen 2B und S2C). Das Fehlen signifikanter Auswirkungen auf den intrazellulären Cholesterinspiegel wurde durch einen enzymatischen Cholesterintest weiter bestätigt, der zeigte, dass NGF den Gehalt an Gesamtcholesterin, freiem Cholesterin und Cholesterinester nicht veränderte (Abbildung 2C).

Umgekehrt war die Menge an Cholesterin (freies, Ester- und Gesamtcholesterin) im Kulturmedium von U373-behandeltem NGF deutlich erhöht (Abbildung 2D). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass NGF die Cholesterinextrusion fördert, indem es den ABCA1-vermittelten Ausfluss von ApoE-haltigen Partikeln verstärkt.

Abbildung 1. NGF moduliert die Expression der Hauptproteine, die an der Cholesterinhomöostase in U373-Zellen beteiligt sind, und steigert die ApoE-Sekretion n im U373-Kulturmedium. (A–G) Repräsentative Western-Blot- und densitometrische Analyse von SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 und ApoE in U373-Zellen, behandelt mit Vehikel (Ctrl) und NGF (100 ng). /ml) für 48 Stunden. n=6 verschiedene Experimente.

Als Beladungskontrollen dienten Actin und Vinculin. (H) Quantifizierung der ApoE-Spiegel (µg/ml) durch ELISA-Assay in Vehikel- und NGF-behandeltem U373-Kulturmedium. n=3 verschiedene Experimente. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD dar. Die statistische Analyse wurde durch einen einzelnen ungepaarten Studet-Test-Test bewertet. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR ist teilweise an den NGF-vermittelten Wirkungen auf das Cholesterin-Protein-Netzwerk beteiligt

Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass NGF den Cholesterinstoffwechsel in Leberzellen durch die Aktivierung seines niedrigaffinen Rezeptors p75NTR beeinflusst [25]. Um zu testen, ob dieser Signalweg möglicherweise auch in Astrozytenzellen erhalten bleibt, behandelten wir U373 mit LM11A-31, einem kleinen Liganden, der als spezifischer p75NTR-Modulator fungiert. Diese Verbindung aktiviert TrkA nicht, löst aber ähnlich wie NGF die Induktion von p75NTR-Downstream-Signalwegen aus [36]. LM11A-31 ahmte den NGF-vermittelten Anstieg von HMGCR nach (Abbildung 3A).

Es wurden jedoch keine Veränderungen bei den anderen am Cholesterinstoffwechsel beteiligten Proteinen beobachtet (Abbildung 3B–D) und auch nicht bei der Menge an extrazellulärem ApoE (Abbildung 3E) und Cholesterin (gesamt, frei und Ester), die in das Kulturmedium freigesetzt wurden (Abbildung 3F). ). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die NGF-induzierte Expression von HMGCR durch die p75NTR-Aktivität vermittelt wird, wohingegen die Auswirkungen auf NPC1, ABCA1, ApoE-Sekretion und Cholesterinextrusion wahrscheinlich von anderen Transduktionswegen abhängen, möglicherweise unter Beteiligung von TrkA.

Abbildung 2. Auswirkungen von NGF auf neutrale Lipide und den Cholesteringehalt. (A) U373-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikel (Ctrl) oder NGF (100 ng/ml) behandelt und dann mit Oil Red O gefärbt, um den intrazellulären Gehalt an neutralen Lipiden sichtbar zu machen. n=3 verschiedene Experimente. (B) Repräsentatives Bild der Filipin-Färbung, die an U373-Zellen durchgeführt wurde, die 48 Stunden lang mit Vehikel (Strg) und NGF (100 ng/ml) behandelt wurden. n=3 verschiedene Experimente. (C) Quantifizierung der intrazellulären Cholesterinspiegel (Gesamtcholesterin, freies Cholesterin und Cholesterinester) in mit Vehikel und NGF behandelten U373-Zellen. n=3 verschiedene Experimente. (D) Cholesterinquantifizierung (Gesamtcholesterin, freies Cholesterin und Cholesterinester) im Kulturmedium von U373-Zellen, die 48 Stunden lang mit Vehikel (Ctrl) und NGF (100 ng/ml) behandelt wurden. n=3 verschiedene Experimente. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD dar. Die statistische Analyse wurde durch Durchführen eines ungepaarten Student-T-Tests durchgeführt. ** P<0.01.

Abbildung 3. Auswirkungen der p75NTR-Modulation durch LM11A-31 auf den Cholesterinstoffwechsel und die Cholesterinsekretion. (A–D) Repräsentative Western-Blot- und densitometrische Analyse von HMGCR, ABCA1, NPC1 und ApoE in U373-Zellen, die 48 Stunden lang mit Vehikel (Strg) und LM11A-31 (0,1 µM) behandelt wurden. n=4 verschiedene Experimente.

Vinculin diente als Haushaltsprotein zur Normalisierung der Proteinbelastung. (E) Quantifizierung der ApoE-Menge (µg/ml) durch ELISA-Assay in Kulturmedium aus Vehikel- und LM11A-31-behandelten U373-Zellen. n=3 verschiedene Experimente. (F) Cholesterinquantifizierung (Gesamtcholesterin, freies Cholesterin und Cholesterinester) im Kulturmedium von U373-Zellen, die 48 Stunden lang mit Vehikel (Strg) und LM11A-31 (0,1 µM) behandelt wurden. n=3 verschiedene Experimente. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe eines einzelnen ungepaarten Studet-Test-Tests durchgeführt. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com