NMR-basierte metabolische Analyse der Auswirkungen der Ketoglutarat-Supplementierung auf C2C12-Myoblasten in verschiedenen Energiezuständen

Klicken Sie hier, um Cistanche-Ergänzungsmittel gegen Alterung und Müdigkeit zu erhalten

1. Einleitung

Der Skelettmuskel ist das größte Organ des menschlichen Körpers und sorgt für die Aufrechterhaltung normaler Lebensaktivitäten.Längeres körperliches Trainingoder pathological Krankheitsprozesse führen zu Muskelschädenoderunzureichende MuskelenergieversorgungZu diesem Zeitpunkt ist die Wiederherstellung der Muskelkraft und -funktion besonders wichtig. Verschiedene Nahrungsergänzungsmittel wurden eingesetzt, um die Hypertrophie der Skelettmuskulatur zu fördern und die sportliche Leistung zu steigern [1]. Als Schnittpunkt des organischen Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsels und gleichzeitig als kritisches Zwischenprodukt im TCA-Zyklus hat -Ketoglutarat (AKG) in klinischen und Tierversuchen pleiotrope Wirkungen zur Verbesserung der Muskelleistung gezeigt [2–9]. Beispielsweise kann AKG Schäden an der Darmschleimhaut [8] und Entzündungen [9] reduzieren und abschwächenEntstehung von Darmkrebs[4] und Leberfibrose [5] fördern das Wachstum [6] und reduzieren die Morbidität undAlterung verzögern[7]. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine AKG-Supplementierung den Muskelverlust durch parenterale Verabreichung in einem Traumamodell von Patienten, die sich einem vollständigen Hüftersatz unterziehen, lindern kann [2] und Muskelhypertrophie und Proteinsynthese über Akt/mTOR-Signalwege fördern kann [10,11]. Im Fall der Duchenne-Muskeldystrophie kann eine AKG-Supplementierung Muskelatrophie und Dysfunktion über den PHD3/ADRB2-vermittelten Weg verhindern [12]. Unsere früheren Arbeiten haben auch gezeigt, dass eine AKG-Supplementierung die Proliferation von C2C12-Myoblasten erheblich erleichtern und die Atrophie von C2C12-Myotubes, die in einem glukosefreien Medium kultiviert werden, lindern kann [13]. Da Glukose die Hauptenergiequelle zur Aufrechterhaltung normaler physiologischer Funktionen der Skelettmuskulatur ist, hängen die Auswirkungen einer AKG-Supplementierung zur Verbesserung der Muskelleistung stark vom Glukosespiegel in der Skelettmuskulatur ab. Die Unterschiede der AKG-induzierten Effekte in der Skelettmuskulatur zwischen verschiedenen Energiezuständen sind unklar.

AKG ist an der Synthese von Aminosäuren, Vitaminen usw. beteiligtorganische SäurenUndEnergiestoffwechselim Körper, was die Umwandlung von AKG in Glutamat durch Glutamatdehydrogenase und die anschließende Amidierung von Glutamat mit Ammoniak durch Glutaminsynthetase beinhaltet. AKG liefert über den TCA-Zyklus und die oxidative Phosphorylierung die Energie für das Zellwachstum und fördert den Zellstoffwechsel und die Signalübertragung durch Interaktion mit seinem Rezeptor OXGR (einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor) auf der Zellmembran [14,15]. Darüber hinaus kann AKG den mitochondrialen oxidativen Stoffwechsel regulieren und den permissiven epigenetischen Zustand fördern, indem es den frühen Übergang des embryonalen Zellzustands und die Keimzellentwicklung vermittelt [16]. Darüber hinaus kann durch körperliche Betätigung hervorgerufenes AKG seinen Rezeptor OXGR1 in den Nebennieren stimulieren, um die Thermogenese und den Abbau von Triglyceriden im Fettgewebe zu kontrollieren und positive Auswirkungen auf den Stoffwechsel zu haben [17].

Es wurden jedoch nur wenige Studien durchgeführt, um AKG-induzierte Stoffwechselveränderungen der Skelettmuskulatur in verschiedenen Energiezuständen und die zugrunde liegenden Stoffwechselmechanismen aufzudecken. In jüngster Zeit wird die Metabolomanalyse eingesetzt, um die molekularen Mechanismen, die den positiven Wirkungen einer Nahrungsergänzung zugrunde liegen, systematisch aufzuklären. Veränderungen von Metaboliten, die als Folgeprodukte der Gentranskription fungieren, können intuitiv die gesamten Stoffwechselveränderungen widerspiegeln. Als besonders geeignete Techniken zum quantitativen Nachweis von Veränderungen des Metabolitenspiegels in Bioflüssigkeiten, Geweben und Zellen wurde die hochauflösende 1H-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) in großem Umfang in metabolomischen Analysen eingesetzt. Bezeichnenderweise bietet das NMR-basierte metabolomische Profiling mehrere Vorteile wie hohe Reproduzierbarkeit, quantitative Messung ohne Vorurteile und bequeme Probenvorbereitung [18,19]. Zuvor haben wir NMR-basierte Metabolomanalysen durchgeführt, um sowohl die Auswirkungen einer Kreatin-Supplementierung auf C2C12-Myoblasten [20] als auch die Auswirkungen einer Alanyl-Glutamin-Supplementierung auf durch Energiemangel geschädigte Myoblasten aufzuklären [21].

2. Ergebnisse

2.1. Proliferation und Differenzierung von C2C12-Myoblasten mit AKG-Supplementierung

C2C12-Myoblastenzellen, die in einem normalen Wachstumsmedium mit und ohne AKG-Ergänzung kultiviert wurden, wurden als Nor-A und Nor gruppiert, wohingegen diejenigen in Wachstumsmedium mit niedrigem Glukosegehalt mit oder ohne AKG-Ergänzung als Low-A und Low gruppiert wurden. In Übereinstimmung mit der vorherigen Studie [10] zeigten Nor-A-Zellen mit AKG-Supplementierung in einer Konzentration von 2 mm eine deutlich erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu Nor-Zellen (Abbildung S1).

Daher wurde in den Experimenten die AKG-Konzentration von 2 mm zur Beurteilung von AKG-induzierten Veränderungen in der Proliferation und Differenzierung von Myoblasten verwendet. Im Vergleich zu Nor-Zellen zeigten Low-Zellen aufgrund von Energiemangel eine stark verringerte Proliferationsrate (Abbildung 1A). Auch wenn die AKG-Supplementierung keine signifikant unterschiedliche Morphologie der Myoblasten in den beiden Energiezuständen verursachte, steigerte sie nicht nur die Proliferationsrate von Low-Zellen, die in einem Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden, sondern auch die von Nor-Zellen, die in einem normalen Medium kultiviert wurden frühere Studien [10,12]. Die Zellzahlen pro gegebener Fläche wurden für die vier Gruppen von Myoblasten gezählt (n=4 für die Gruppe): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Niedrig, 493,8 ± 14,5; Niedriges A, 547,0 ± 11,7 (Abbildung 1B). Es ist erwähnenswert, dass Low-A-Zellen keine statistisch unterschiedlichen Zellzahlen von Nor-Zellen aufwiesen, was darauf hindeutet, dass eine AKG-Supplementierung die Zellzahlen für die Myoblasten unter Kulturbedingungen mit niedrigem Glukosegehalt wiederherstellen konnte (Abbildung 1B).

Abbildung 1: Proliferations- und Differenzierungsfähigkeiten von C2C12-Myoblasten unter den Bedingungen normaler Kultur und niedriger. Glukosekultur. (A) Myoblastenmorphologien. (B) Zellennummern entsprechend Panel A (n=4). (C) Zelllebensfähigkeiten im Vergleich zu Nor-Zellen, analysiert durch MTS-Zellproliferationstest (n=5). (D) MyoD1-Expressionen in Myoblasten, analysiert durch Western Blot. Der Anti-GAPDH-Antikörper wurde verwendet, um die Proteinmenge in jeder Spur zu standardisieren. (E) Statistische Analyse entsprechend den Panels (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Darüber hinaus wurde der MTS-Assay durchgeführt, um die Proliferationsraten der vier Zellgruppen quantitativ zu vergleichen (Abbildung 1C). Niedrige Zellen wiesen im Vergleich zu Nor-Zellen eine deutlich verringerte Proliferationsrate auf, was darauf hindeutet, dass das Medium mit niedrigem Glucosegehalt die Zellproliferation benachteiligte. Signifikant steigerte die AKG-Supplementierung die Proliferationsraten von Nor-A- und Low-A-Zellen im Vergleich zu Nor- bzw. Low-Zellen. Beachten Sie, dass Low-A-Zellen eine geringere Proliferationsfähigkeit zeigten als Nor-Zellen, was bedeutet, dass die AKG-Supplementierung die Proliferation von Zellen, die in einem Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden, nur teilweise wiederherstellte

.Die Expression des Myogenic Differentiation 1 (MyoD1)-Proteins wird üblicherweise zur Charakterisierung der Differenzierungsfähigkeit von Zellen verwendet. Wir haben daher die Expression von MyoD1 zwischen den vier Zellgruppen quantitativ verglichen (Abbildung 1D). Low-Zellen zeigten im Vergleich zu Nor-Zellen eine stark verminderte Differenzierungsfähigkeit. Bezeichnenderweise steigerte die AKG-Supplementierung die Differenzierungsfähigkeiten von Zellen, die sowohl in normalem Medium als auch in Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden, was durch einen etwa 30-prozentigen Anstieg der MyoD1-Expression in Nor-A- und Low-A-Zellen angezeigt wird. Bemerkenswerterweise zeigten Low-A-Zellen keine statistisch signifikant unterschiedliche MyoD1-Expression von Nor-Zellen, was auf die hohe Effizienz der AKG-Supplementierung zur Wiederherstellung der Differenzierungsfähigkeit von Zellen schließen lässt, die in einem Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden.

Darüber hinaus analysierten wir die Myotube-Differenzierungsfähigkeiten für die vier Gruppen von C2C12-Myoblasten. Myotubes wurden durch die Fusion von Myoblasten gebildet, die in normalen und glukosearmen Differenzierungsmedien mit oder ohne AKG-Supplementierung kultiviert wurden (Abbildung S3). Morphologien der C2C12-Myotubes zeigten, dass die Kultur mit niedrigem Glucosegehalt die Myotube-Differenzierungsfähigkeit von Zellen beeinträchtigte und eine AKG-Supplementierung die Myotube-Differenzierung von Myoblasten fördern konnte, die sowohl in einem normalen Medium als auch in einem Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden.

2.2. NMR-Spektren wässriger Extrakte von C2C12-Myoblasten

Typische 850-MHz-1H-NMR-Spektren wurden an wässrigen Extrakten aufgezeichnet, die aus den Gruppen Nor, Nor-A, Low und Low-A von C2C12-Myoblasten stammen (Abbildung 2A). Insgesamt wurden 34 Metaboliten zugeordnet und in Tabelle S1 zusammengefasst. Die Resonanzzuordnungen der Metaboliten wurden durch Verwendung von 2D-1H-13C-HSOC- und 1H-H-TOCSY-Spektren bestätigt (Abbildungen S4 und S5). Die visuelle Untersuchung der NMR-Spektren zeigte, dass die Kultivierung von Myoblasten mit AKG-Supplementierung zu erheblichen Ansammlungen von intrazellulärem AKG in Nor-A- und Low-A-Zellen führte (Abbildung 2B).

Abbildung 2: Durchschnittliche 850-MHz-lH-Kernresonanzspektren (NMR), aufgezeichnet an wässrigen Extrakten, die aus den Gruppen Nor, Nor-A, Low und Low-A von C2C12-Myoblasten stammen. (A) Vergleich der durchschnittlichen NMR-Spektren der vier Gruppen. Die vertikalen Skalen wurden in allen lH-NMR-Spektren konstant gehalten. Der Wasserbereich (4.7-5.2 ppm) wurde entfernt. (B) Lokal verstärkte Bereiche von a-Ketoglutarat (AKG)-Peaks. Blaue/grüne/gelbe/rote Linie: Spektralbereiche aus den Gruppen Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-Ketoglutarat; PC, O-Phosphocholin; GPC, sn-glycero-3-phosphocholinUDP-glucose, Uridindiphosphatglucose: CTP, sn-glycero-3-phosphocholin; NAD plus, Nicotinamidadenindinukleotid AXP Adeninmono/di/triphosphat.

2.3. Multivariate Datenanalyse zur Erforschung zellulärer Stoffwechselprofile

Wir führten außerdem eine multivariate Datenanalyse der NMR-Spektraldaten zur Stoffwechselprofilierung der vier Gruppen von C2C12-Myoblasten durch. Wir haben zunächst drei unbeaufsichtigte PCA-Modelle mit den ersten beiden Komponenten (PC1, PC2) erstellt, um einen Überblick über die Gruppierungstrends zu erhalten und metabolische Unterschiede zwischen den Myoblastengruppen aufzudecken. Die ThePCA-Score-Diagramme zeigen, dass sich das Stoffwechselprofil von Zellen, die in einem Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden, deutlich von dem kultivierten in einem normalen Medium unterschied (Abbildung 3A), und dass die AKC-Supplementierung die Stoffwechselmuster der Zellen, die sowohl in einem normalen Medium als auch in einem normalen Medium kultiviert wurden, deutlich veränderte in Medium mit niedrigem Glucosegehalt (Abbildung 3B,C). Allerdings war der Stoffwechselunterschied zwischen der Nor-A- und der Nor-Gruppe größer als der zwischen der Low-A- und der Low-Gruppe, was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen der AKG-Supplementierung auf das Stoffwechselprofil der Myoblasten stark vom Energiezustand der Zellen abhängen.

Abbildung 3. Multivariate Analysen für HNMR-Spektren wurden an wässrigen Extrakten aufgezeichnet, die aus C2C12-Myoblasten der Gruppen Nor, Nor-A, Low und Low-A stammen. (AC) PCA bewertet Diagramme der Low- und Nor-Gruppen, der Low-A- und Low-Gruppen und der Nor-A- und Nor-Gruppen; (DF) OPIS-DA bewertet Diagramme der Low- und Nor-Gruppen (R2: 0.999, 02: 0.996), der Low-A- und Low-Gruppen (R2: 0.918: 02: 0.761), die Nor-A- und Nor-Gruppen (R2: 0,927: 02: 0,838). Die Ellipsen geben die 95-Prozent-Konfidenzgrenze an.

Darüber hinaus haben wir drei überwachte OPLS-DA-Modelle erstellt, um metabolische Trennungen zwischen den vier Gruppen von Myoblasten zu veranschaulichen (Abbildung 3D-F). Wie erwartet maximierten die OPLSDA-Modelle die metabolischen Unterschiede zwischen den vier Gruppen, indem sie die korrelierten orthogonalen Variableninformationen reservierten und unkorrelierte orthogonale Variableninformationen herausfilterten. Darüber hinaus führten wir Zufallspermutationstests (n=200) durch, um die Zuverlässigkeit der OPLS-DA-Modelle zu bewerten (Abbildung S6), die die Gültigkeit der etablierten OPLS-DA-Modelle anzeigen.

2.4. Identifizierung differenzieller und wichtiger Metaboliten

Um die Metabolitenspiegel zwischen den vier Gruppen von C2C12-Myoblasten quantitativ zu vergleichen, haben wir die relativen Spiegel der identifizierten Metaboliten anhand ihrer relativen Integrale berechnet (Tabelle S2). Die AKG-Supplementierung erhöhte die intrazellulären AKG-Spiegel in den Nor-A- und Low-A-Gruppen drastisch, veränderte jedoch die Werte in der Nor- und Low-Gruppe nicht signifikant. Wir führten den Student-t-Test durch, um unterschiedliche Metaboliten mit einem Kriterium von p < 0,05 zu identifizieren (Abbildung 4). Der Vergleich von Nor vs. Low identifizierte 29 unterschiedliche Metaboliten (Abbildung 4A), darunter 18 verstärkte Metaboliten (Leucin, Isoleucin, Valin, Acetat, Glutamat, Glutamin, Methionin, Aspartat, Lysin, Kreatin, PC (O-Phosphocholin), Taurin, Tyrosin). , Phenylalanin, Histidin, NAD plus , Formiat, AXP) und 11 lehnten Metabo ab. Lites (Glutathion, Pyroglutamat, Phosphokreatin, Beta-Alanin, GPC, Glucose, Glycin, Acetat, Threonin, GTP, UDP-Glucose). Der Vergleich von Low-A vs. Low-identified differentiellen Metaboliten (Abbildung 4B), einschließlich 7 erhöhter Metaboliten (Ethanol, AKGbeta-Alanin, PC, Taurin, Glycin und GTP) und 3 verringerten Metaboliten (Glutamin, Lysin und Myoinositol). Der Vergleich von Nor-A vs. Nor identifizierte 18 unterschiedliche Metaboliten (Abbildung 4C), darunter 6 hochregulierte Metaboliten (AKG, Pyroglutamat, Glutamin, Lysin, Glucose, Laktat) und 12 herunterregulierte Metaboliten (Alanin, Acetat, Glutathion). Methionin, Phosphokreatin, PC, Myoinositol, Glycin, Threonin, GTP, UDP-Glucose und AXP).

Abbildung 4. Relative Intensitäten unterschiedlicher Metaboliten wurden durch paarweise Vergleiche zwischen den vier Gruppen von C2C12-Myoblasten identifiziert. (A) Niedrig vs. Nor; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} für jede Gruppe.

Darüber hinaus haben wir die OPLS-DA-Modelle verwendet, um wichtige Metaboliten mit einem Kriterium von VIP > 1 zu identifizieren (Abbildung 5). Insgesamt wurden 12, 10 und 10 wichtige Metaboliten aus den OPLS-DA-Modellen Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low identifiziert.

Abbildung 5. VIP-Scores wichtiger Metaboliten wurden durch paarweise Vergleiche zwischen den vier Gruppen von C2C12-Myoblasten identifiziert. (A) Niedrig vs. Nor; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. Die rote/blaue Schriftart weist auf erhöhte/erniedrigte Metabolitenspiegel hin.

Die Kombination der identifizierten wichtigen Metaboliten und Differenzmetaboliten ergab charakteristische Metaboliten (Tabelle 1). Die paarweisen Vergleiche von Low vs. Nor, Low-A vs. Low und Nor-A vs. Nor identifizierten 10, 6 bzw. 10 charakteristische Metaboliten, was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen der AKG-Supplementierung auf Myoblasten eng mit der Energie verbunden waren Zustand der Zellen.

2.5. Identifizierung signifikant veränderter Stoffwechselwerte

Pfade Wir führten eine Stoffwechselpfadanalyse durch, um signifikant veränderte Stoffwechselpfade (signifikante Pfade) zu identifizieren, basierend auf den Metabolitenspiegeln, die aus den paarweisen Vergleichen zwischen den vier Gruppen von C1C12-Myoblasten identifiziert wurden (Abbildung S7; Tabelle 2 und Tabelle S3). Die Analyse von Nor vs. Low identifizierte 11 signifikante Signalwege: (1) Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel; (2) Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechsel; (3) Glutathionstoffwechsel; (4) D-Glutamin- und D-Glutamat-Stoffwechsel; (5) Stärke- und Saccharosestoffwechsel; (6) Beta-Alanin-Stoffwechsel; (7) Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel; (8) Phenylalanin-Stoffwechsel; (9) Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Biosynthese; (10) Nikotinat- und Nikotinamidstoffwechsel; (11) Histidinstoffwechsel. Dieser signifikante Signalweg war mit dem Energiestoffwechsel, oxidativem Stress und dem anaplerotischen Fluss des TCA-Zyklus verbunden.

Die Analyse von Nor-A vs. Nor identifizierte nur die ersten fünf signifikanten Pfade 1–5 unter Ausschluss der anderen sechs Pfade 6–11. Im Gegensatz dazu identifizierte die Analyse von Low-A vs. Low nur sechs signifikante Pfade: die ersten vier Pfade 1–4, die bei den Vergleichen Low vs. Nor, Nor-A vs. Nor gemeinsam waren; zwei Pfade 6–7, die beim Vergleich von Low vs. Nor gemeinsam sind. Beachten Sie, dass die AKG-Supplementierung den Stoffwechselweg 5 (Stärke- und Saccharosestoffwechsel) in Zellen, die in einem Medium mit niedrigem Glukosegehalt kultiviert wurden, nicht wesentlich veränderte, jedoch zwei andere Stoffwechselwege beeinträchtigte (Beta-Alanin-Stoffwechsel sowie Taurin- und Hypotaurin-Stoffwechsel). Um AKG-induzierte Veränderungen in charakteristischen Metaboliten zu visualisieren, haben wir diese Metaboliten auf eine Stoffwechselkarte projiziert, die auf der Datenbank der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) basiert (Abbildung 6). KEGG wurde in großem Umfang als eine der wichtigsten Datenressourcen zur Rekonstruktion von Stoffwechselnetzwerken genutzt und zeigt wichtige Stoffwechselwege auf. Sowohl die veränderten charakteristischen Metaboliten als auch die deutlich veränderten Stoffwechselwege liefern neue Einblicke in die molekularen Mechanismen, die den Auswirkungen der AKG-Supplementierung auf C2C12-Myoblasten zugrunde liegen.