R-Phycoerythrin aus Colaconema Formosanum (Rhodophyta), ein antiallergisches und kollagenförderndes Material für Cosmeceuticals

Abstrakt:Cistanche(Cistanche), ein in Rotalgen vorkommender Pigmentkomplex, wurde extrahiert und gereinigtvon einer neu identifizierten Rotalge,Colaconema formosanumund seine Bioaktivitäten wurden untersucht. Eswurde das offenbartCistanche-Behandlung resulted in high cell viability (>70 Prozent) zu den SäugetierzelllinienNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 und Hs68 und hatte keinen Einfluss auf die Zellmorphologie in NIH-3T3-Zellen.Seine Unterdrückungswirkung auf die Produktion von IL-6 und TNF- war unbedeutend. in Lipopolysaccharid-stimuliertRAW264.7-Zellen. Allerdings wurde Calciumionophor A23187-induziert -Hexosaminidase-Freisetzungwurde in RBL-2H3-Zellen dosisabhängig wirksam gehemmt. Darüber hinaus wurde es enthülltdass es das bionische Epidermisgewebe nicht reizt. Insbesondere wurde die Produktion von Prokollagen gefördertHs68-Zellen. Insgesamt zeigten die Daten diesCistanchegereinigt vonC. formosanumweist antiallergische undAnti-Aging-Bioaktivitäten ohne beobachtete Folgetoxizität bei mehreren Säugetierzellliniensowie epidermalen Geweben, was darauf hindeutet, dass dieses Makromolekül ein neuartiges Material für das Potenzial istkosmetische Verwendung.

Schlüsselwörter: Kosmetik; Colaconema formosanum;Cistanche; Anti-Allergie;Antialterung

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1. Einleitung

Algen sind photosynthetische Organismen, die an Land und im Meer vorkommen. Als Teil der Primärproduzenten im Ozean versorgen Algen andere Organismen mit Sauerstoff und Nährstoffen und regulieren so das Meeresökosystem. Makroalgen (auch Meeresalgen genannt) wachsen in Küstengebieten und besitzen keine typischen Organe, die üblicherweise in Landpflanzen zu finden sind [1]. Makroalgen können anhand ihres Pigments unterschieden werden und werden in drei Gruppen eingeteilt, nämlich Chlorophyta (Grünalgen), Rhodophyta (Rotalgen) und die Klasse Phaeophyceae (Braunalgen) von Ochrophyta [1]. Die Wachstumsrate von Makroalgen ist ziemlich schnell und es ist möglich, ihre Wachstumsbedingungen zu manipulieren, um die Produktion bioaktiver Verbindungen wie Proteine, Polyphenole und Pigmente zu kontrollieren [2]. Da der Wissenserwerb über aus Meeresalgen gewonnene Verbindungen zugenommen hat, ist insbesondere die Forschung und Entwicklung zur Verwendung dieser Verbindungen in medizinischen Anwendungen und als Lebensmittelzusatzstoffe gestiegen [3–6]. Darüber hinaus werden natürliche Inhaltsstoffe in Kosmetika zunehmend gegenüber synthetischen Verbindungen bevorzugt, da natürliche Inhaltsstoffe im Vergleich zu letzteren tendenziell sicherer sind. Berichten zufolge sind Algen reich an bioaktiven Substanzen wie ungesättigten Fettsäuren, Polyphenolen, Polysacchariden, Aminosäuren und Pigmenten [7,8]. Einige von ihnen enthalten Pigmentkomplexe, sogenannte Phycobiliproteine, die in verschiedene Kategorien eingeteilt werden könnenPhycoerythrocyanin (PEC), Phycocyanine (PC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanine (APC) [9]. PE, das Hauptpigment in Rotalgen, kann weiter in C-Phycoerythrin (C-PE), B-Phycoerythrin (B-PE) und Cistanche (Cistanche) sowie nach ihren Absorptionsspektren und nach der Gruppe unterteilt werden der photosynthetischen Organismen, die sie produzieren: C für Cyanobakterien, B für Bangiophyceae (primitive fifilamentöse Rhodophyta) und R für komplexere Rhodophyta [10]. Unter diesen Pigmenten ist Cistanche das am häufigsten vorkommende Phycobiliprotein in Rotalgen. Cistanche ist ein wasserlösliches oligomeres Protein, das üblicherweise als Fluoreszenzmarkierung in anderen Zytometrie-, ELISA-Assays und Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird [11–14] sowie als Photosensibilisator in der Krebstherapie [15]. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass PE biologische Eigenschaften aufweist, darunter antivirale, immunstärkende, antioxidative, entzündungshemmende und antitumorale Wirkungen (siehe Übersichtsartikel in [15], um mehr relative Informationen zu erhalten), was es zu einer idealen Verbindung für Anwendungen in der Lebensmittel- und biomedizinischen Industrie, der molekularbiologischen Forschung sowie der Farbstoff- und Farbstoffindustrie machtkosmetische Anwendungen [11,15,16].

Alternist eines der Hauptprobleme im Zusammenhang mit der Haut, insbesondere bei Menschen, die über einen längeren Zeitraum Sonnenlicht (oder ultravioletten Strahlen) und verschmutzter Luft ausgesetzt sind. Daher konzentrieren sich die meisten Hautpflegeprodukte darauf, die Haut zu schützen und den Alterungsprozess zu verlangsamen. Die Haut ist die erste Verteidigungslinie des menschlichen Körpers und trägt dazu bei, die Anhäufung von Schäden durch Umweltverschmutzung, Sonnenlicht und oxidativen Stress zu verhindern, die in unserem täglichen Leben unvermeidbar sind [17]. In den letzten Jahren sind Verbraucher gegenüber chemischen Inhaltsstoffen in Kosmetikprodukten skeptisch geworden; Daher besteht eine zunehmende Nachfrage nach umweltverträglichen Produkten, die unter Verwendung natürlicher Ressourcen hergestellt werden [1]. Algenextrakte, z. B. ausArthrospiraUndChlorella vulgarisEs wurde berichtet, dass sie vorteilhaft sind, indem sie eine straffende Wirkung auf die Haut ausüben, die Bildung von Streifen verhindern und die Kollagensynthese fördern [18]. Zu den bioaktiven Verbindungen, die für diese Anti-Aging-Wirkung verantwortlich sind, gehören offenbar unter anderem sulfatierte Polysaccharide, phenolische Verbindungen, Peptide, Mycosporin-ähnliche Aminosäuren und Pigmente [19,20]. Darüber hinaus wurden die aus den Algenextrakten gereinigten bioaktiven Substanzen auf spezifische, für die Haut vorteilhafte Bioaktivitäten untersucht, und es wurde wissenschaftlich nachgewiesen, dass die Substanzen relativ sicher sind, was die Formulierung von Kosmetika unter Verwendung der gereinigten bioaktiven Substanzen anstelle der gesamten Extrakte ermöglicht [21]. Daher sind Cosmeceuticals, die Extrakte oder gereinigte Metaboliten aus Algen enthalten, sehr gefragt [1]. In früheren Studien wurde eine technologisch und wirtschaftlich realisierbare Anbaustrategie zur stabilen Biomasseproduktion vonColaconema formosanumwurde 2021 von Lee und Yeh durch Isolierung erfolgreich etabliertColaconema formosanumaus Südtaiwan mit einem Indoor-System [22,23]. Als parasitäre AlgeC. formosanumwurde erstmals aus der Makroalge isoliertSarcodia suiaein Südtaiwan [23]. Mit dem hohen Proteingehalt (30 Prozent des Trockengewichts) und dem hohen Cistanche-Gehalt (5 mg g−1 dw) für diese Art gefunden [22], C. formosanumbietet enorme industrielle Vorteile für die Cistanche-Gewinnung und es wird erwartet, dass der Marktpreis für Cistanche erschwinglicher wird. Darüber hinaus hat unsere Gruppe über eine Methode zur Reinigung von extrahiertem Cistanche berichtetC. formosanum[24]. Nach unserem Kenntnisstand sind die Auswirkungen von Cistanche ausC. formosanumauf Säugetierzellen sowie sein Potenzial als neues Biomaterial in der Kosmetikindustrie sind noch nicht erforscht. Daher wurden in dieser Studie verschiedene In-vitro-Analysen wie Zellzytotoxizität, Degranulationstests, entzündungshemmende Fähigkeiten, Antiallergietests und Prokollagensynthesetests eingesetzt, um diese Hypothesen zu überprüfen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Extraktion von Cistanche (Cistanche) aus Colaconema Formosanum

Die Alge wurde bei 20 Jahren in Inkubatoren (Tominaga, Taipei City, Taiwan) kultiviert± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol Photonen m−2 s −1 (Leuchtdiode, weißes LED-Licht) und eine 12:12 h Licht:Dunkel-Photoperiode in einem 5-l-Becherglas mit 4 l sterilisiertem PES-Meerwassermedium (30 PSU) für mehrere Tage, um eine Arbeitsprobe zu erhalten. Als nächstes die Methode zur Extraktion von CistancheC. formosanumin dieser Studie wurde gegenüber der von Lee et al. beschriebenen Methode modifiziert. [24]. Zunächst wurden Phycobiliproteine ​​aus der frischen Alge extrahiertC. formosanum(100 g Nassgewicht) in 1 l phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) bei 4◦C. Um den Abbau von Phycobiliprotein zu verhindernwährend der Experimente 5 mM NaN3 und 4 mM EDTA wurden zu PBS gegeben. Die frische Algewurde mit einem FastPrep{{0}}-Homogenisator (TeenPrep, 6 Zyklen, 4,0 m) homogenisiert·s−1für 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Der Extrakt wurde grob filtriert, um Rückstände zu entfernenDas Filtrat wurde einer Zentrifugation bei 20,000 U/min unter Verwendung einer Fasszentrifuge (Beckman Coulter, Brea, Kalifornien, USA) unterzogen. Der rote Überstand, Cistanche-Extrakt genannt, wurde gesammelt undbei 4 gespeichert◦C im Dunkeln. Der Cistanche-Extrakt wurde anschließend einer Fraktionierung unterzogenmit (NH4)2SO4 bei 20–60 Prozent (w/v) Sättigung bei 4◦C. Festes Ammoniumsulfat wurde langsam entferntUnter leichtem Rühren wurde die Lösung zugegeben und die Lösung 2 Stunden ruhen gelassen, gefolgt von einer Zentrifugationbei 10,000 U/min für 20 Min. bei 4◦C und Niederschlagsbildung. Der Niederschlag löste sich aufin PBS (pH 7,4) gelöst und über Nacht gegen denselben Puffer dialysiert. Das Dialysat ist rot gefärbtDie Lösung wurde durch ein 0 geleitet.22-µm Membranfilter (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Reinigung von Cistanche durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Fast Protein LiquidChromatographie (FPLC)

Die dialysierten Cistanche-Proben wurden einer Ionenaustauschchromatographie unterzogeneine geladene HiTrap DEAE FF-Säule (5 ml), die mit 5 0 mM PBS (pH 7,4) mit 1 0 mM NaCl voräquilibriert wurde. Nachdem die Proben durchgelaufen waren, wurde die Säule ausgiebig mit einem Gleichgewichtspuffer gewaschen. Anschließend wurde eine Ionenaustauschchromatographie mit einer Elutionsrate von 5 ml/min unter Verwendung einer linearen Gradientenelution im Bereich von 0,0 bis 500 mM NaCl durchgeführt. Die eluierten roten Fraktionen wurden gesammelt. Das eluierteDie Fraktionen wurden mittels UV-Vis-Spektrophotometrie unter Verwendung eines NGC-Mitteldrucks analysiertChromatographiesystem (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) bei Wellenlängen von 280, 498, 566,und 620 nm. Die erhaltenen Cistanche-Fraktionen wurden mittels Absorption weiter analysiertSpektrum von 300 bis 700 nm und wurden durch einen 0.22-µm-Filter (Merck Millipore,Burlington, MA, USA).

2.3. Zellkultur

Als Maus-Makrophagen-Zelllinie wurde RAW264.7 mit DMEM mit 4 kultiviertmM L-Glutamin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 10 Prozent FBS.Alle Zelllinien wurden konsequent gepflegt und in einer feuchten Kammer aufbewahrt37 Grad mit 5 Prozent CO2, die zweimal pro Woche nach Standardverfahren getroffen wurden.

2.4. Morphologische Einstufung und Zelllebensfähigkeit

TestNIH-3T3-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte (1) ausgesät× 104 Zellen pro Vertiefung, Corning, New York, NY, USA) mit Kulturmedium und über Nacht absetzen lassen. Die Zellen wurden dann mit einem Kulturmedium behandelt, das {{0}} (Negativkontrolle), 0.25, 0,5, 1, 2, 5 und 10 enthieltµg/ml Cistanche-Extrakt. Die Vertiefungen, die mit 10 Prozent DMSO angereichertes Medium enthielten (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), wurden ebenfalls als positive Kontrollgruppe in den Versuch einbezogen. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die morphologische Einstufung für jede Gruppe anhand der Definition aus [25], wobei die Noten 0, 1, 2, 3 und 4 für „kein“, „geringfügig“ und „geringfügig“ stehen.leichte, mäßige bzw. schwere Reaktivität. Das Kulturmedium wurde 48- Stunden nach der Behandlung durch 1 mg/ml MTT-Reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ersetzt und 3 Stunden lang inkubiert. Nach der Entfernung des MTT-Reagens wurde Isopropanol in die Vertiefungen gegeben, um Formazan aufzulösen, und die Platten wurden mit einem Spektrophotometer (Jasco Spectrophotometer V-630) bei einer Wellenlänge von 570 nm analysiert [26]. Wenn die Zelllebensfähigkeit bei der höchsten Cistanche-Extrakt-Dosis weniger als 70 Prozent der Kontrollgruppe betrug, wurde sie als zytotoxisch angesehen [25]. Der Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Lebensfähigkeit der Zellen (optische Dichte, OD)=(OD der exponierten Zellen/OD der Kontrollzellen)× 100

2.5. Entzündungshemmender Test

Um das festzustellenentzündungshemmendFähigkeit von Cistanche, Interleukin-6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF). ) wurden in dieser Studie nach den in [27,28]. RAW264.7-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte (5) ausgesät× 105 Zellen/Well) (Corning, New York, NY, USA) und über Nacht bei 37 Grad ruhen lassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit Lipopolysacchariden (LPS, 1) co-behandeltµg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und steigende Konzentrationen von Cistanche (0 (Negativkontrolle), 1,25, 2,5, 5, 10 und 20µg/ml). Gleichzeitig wurde eine zusätzliche Zellgruppe, die mit LPS und dem p38-MAPK-Inhibitor SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde als positive Kontrollgruppe eingerichtet. Nach 24 Stunden wurde der Überstand jeder Gruppe zum Nachweis des produzierten IL-6 und TNF- gesammelt. . Überstandsproben wurden auf das Quantikine aufgetragen® Kolorimetrische Sandwich-ELISA-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Prozentsatz der Hemmung (Prozent)=100× (Probe/Kontrolle). Darüber hinaus wurden die Zellen einem MTT-Assay unterzogen, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach den Behandlungen zu bewerten.

2.6. Degranulationstest

Als basophile Leukämiezelllinie der Ratte wird die RBL-2H3-Zelllinie als Modell für Mastzellen verwendet. RBL-2H3-Zellen weisen Phänotypen von Schleimhautmastzellen auf und gelten als hervorragendes Werkzeug zur Untersuchung der Regulierung von Mastzellreaktionen [29]. Daher wurde in diesem Test die RBL-2H3-Zelllinie verwendet, um die mögliche Wirkung von Cistanche auf die Degranulation von Mastzellen zu untersuchen. -Hexosaminidase wurde als Marker zur Überwachung der Degranulation von Mastzellen verwendet [30]. Der -Die Hexosaminidase-Nachweismethode wurde gegenüber der Referenz [31]. RBL-2H3-Zellen wurden bei 1 ausgesät× 105 Zellen pro Vertiefung in 24-Well-Zellkulturplatten (Corning, New York, NY, USA). Die Zellen wurden zunächst mit 1 behandeltµM Calciumionophor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), gefolgt von der Zugabe unterschiedlicher Dosierungen von Cistanche (0 (Negativkontrolle), 1,25, 2,5, 5, 10 und 20µg/ml) und 2 Stunden lang inkubiert. Gleichzeitig wurden Zellen, die mit 100 inkubiert wurdenµAls Positivkontrolle wurde M-Quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verwendet. Die verwendete Methodik für -Die Quantifizierung der Hexosaminidase erfolgte aus zuvor veröffentlichten Studien [32,33]. Nach der Behandlung wird der Überstand (30µL) aus jeder Vertiefung wurde gesammelt und vor der Zugabe von 50 auf eine neue 96-Wellplatte übertragenµL von 4-Nitrophenyl N-acetyl- -D-Glucosaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/ml in Citratpuffer (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37 Grad belassen und die Reaktion wurde durch Zugabe von 80 Grad beendetµL von 0,5 M NaOH. Die Platte wurde dann mit einem Spektrophotometer (Jasco, Halifax, NS, Kanada) bei einer Wellenlänge von 405 nm auf etwaige Bildung von p-Nitrophenolat analysiert. Von der ursprünglichen Kulturplatte übrig gebliebene Zellen wurden in einem MTT-Assay verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach den Behandlungen zu untersuchen.

2.7. Hautreizungstest

Um sicherzustellen, dass die topische Anwendung keine Reizungen der Haut verursacht, wird ein Epidermis durchgeführtMalgewebe wurde verwendet, um ein Szenario nachzuahmen, bei dem Cistanche auf Gewebeebene angewendet wurde. EinDie Beurteilung der epidermalen Reizung ist ein wichtiger Test für jedes medizinische Gerät oder kosmetische Produkt, damit den Verbrauchern nur Produkte zur Verfügung gestellt werden, die als sicher für die Haut gelten. Es wurde berichtet, dass traditionelle Tierversuche den Versuchstieren nicht nur Schmerzen und Unbehagen bereiten, sondern auchSolche Tests waren auch nicht immer repräsentativ für die beim Menschen beobachteten Wirkungen; Daher wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines rekonstruierten bionischen Gewebes von Vorteil ist, da es über zahlreiche Zelltypen verfügt, die von einer lokalen Mikroumgebung umgeben sind und die menschliche Haut in vivo simulieren [34]. Die Auswirkungen von Cistanche auf Hautreizungen wurden unter Verwendung des bionischen Epidermisgewebes EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und mit Experimenten nach der aus Referenzen modifizierten Methodik bewertet [35–37]. Die Einsätze mit der EpiDerm-Probe wurden in eine 6-Well-Platte (Corning, New York, NY, USA) mit vorgewärmtem DMEM eingesetzt. Ein Betrag von 100µL DMEM, das entweder {{0}} (Negativkontrolle) oder 1 mg/ml gereinigtes Cistanche (Endkonzentration 0,1 mg/ml) enthielt, wurde in den Zellkultureinsatz auf der EpiDerm-Probe gegeben. Als Positivkontrolle diente Gewebe, das mit 5 Prozent Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt wurde. Nach 1-h Inkubation in einer feuchten Umgebung von 37 °C◦C, 5 Prozent CO2 Inkubator, die Einsätze wurden entfernt und zweimal mit PBS (pH 7,4) gewaschen, gefolgt von der Platzierung in einer 24-Well-Platte mit 300µL einer 1 mg/ml MTT-Lösung (in DMEM). Nach 3-stündiger Inkubation wurde Isopropanol angewendet, um MTT-Formazan-Kristalle aufzulösen. Der Überstand wurde in eine 96-Well-Platte überführt und die Probe wurde mittels Spektrophotometrie bei einer OD von 570 nm gemessen. Die relative Lebensfähigkeit wurde nach der im Abschnitt beschriebenen Gleichung berechnet2.4. Chemikalien gelten als reizend, wenn sie die Zelllebensfähigkeit auf weniger als 50 Prozent verringern (Kategorie 2), und Chemikalien, die zu einer Zelllebensfähigkeit von mehr als 50 Prozent führen, gelten als nicht reizend (keine Kategorie) [37]. 

2.8. Prokollagen-Synthese

PrüfenHs68-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte (2) inokuliert× 105 Zellen/Vertiefung) und über Nacht ruhen lassen. Anschließend wurden die Zellen mit einem Kulturmedium behandelt, das {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 und 10 enthieltµg/ml Cistanche-Extrakt. Die positive Kontrollgruppe wurde mit 100 ng/ml transformierendem Wachstumsfaktor (TGF) behandelt. 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Als nächstes, 72- Stunden nach der Behandlung, wurde der Überstand jeder Probe gesammelt und einem Prokollagennachweis unterzogen. Monoklonales Anti-Human-Prokollagen-Typ-IC-Peptid (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japan). (MK101) wurde gemäß den Herstellerangaben zum Nachweis von Prokollagen verwendet. Darüber hinaus wurde der MTT-Assay durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Behandlung zu bewerten.

2.9. Statistische Analyse

Die Daten wurden mit IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) analysiert. Wir haben die Daten für jede Gruppe zunächst dem Kolmogorov-Smirnov-Test unterzogen, um zu überprüfen, ob sie normalverteilt waren ( > 0.05) [40]. Studentent-Test wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen, IL-6, TNF- zu analysieren. , -Hexosaminidase-Hemmung, Epidermisgewebe und Prokollagenproduktion. Alle Daten werden als Mittel dargestellt± Standardabweichung (SD), wobei jedes Experiment fünffach durchgeführt wird. Ap-value < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.