Norwogonin dämpft Hypoxie-induzierten oxidativen Stress und Apoptose in PC12-Zellen

Für mehr Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Abstrakt

Hintergrund: Norwogonin ist ein natürliches Flavon mit drei phenolischen Hydroxylgruppen in Skelettstruktur und hat eine hervorragende WirkungAntioxidansAktivität. Die neuroprotektive Wirkung von Norwogonin bleibt jedoch unklar. Hier untersuchten wir die Schutzkapazität von Norwogonin gegen oxidative Schäden, die durch Hypoxie in PC12-Zellen hervorgerufen werden. Methoden: Die Zelllebensfähigkeit und Apoptose wurden mittels MTT-Assay bzw. Annexin V-FITC/PI-Färbung untersucht. Der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurde unter Verwendung des DCFH-DA-Assays gemessen. Laktatdehydrogenase (LDH), Malondialdehyd (MDA) undAntioxidansEnzymspiegel wurden unter Verwendung kommerzieller Kits bestimmt. Die Expression verwandter Gene und Proteine ​​wurde durch quantitative Echtzeit-PCR bzw. Western-Blotting gemessen. Ergebnisse: Wir fanden heraus, dass Norwogonin die Hypoxie-induzierte Schädigung in PC12-Zellen linderte, indem es die Zelllebensfähigkeit erhöhte, die LDH-Freisetzung verringerte und die Veränderungen in der Zellmorphologie verbesserte. Norwogonin fungierte auch alsAntioxidansdurch Abfangen von ROS, Reduzierung der MDA-Produktion, Aufrechterhaltung der Aktivitäten von Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Glutathionperoxidase (GPx) und Verringerung der Expressionsniveaus von HIF-1 und VEGF. Darüber hinaus verhinderte Wogonin die Zellapoptose, indem es die Expressionsniveaus von Caspase-3, Cytochrom c und Bax hemmte, während es die Expressionsniveaus von Bcl-2 und das Verhältnis von Bcl-2/Bax erhöhte. Schlussfolgerungen: Norwogonin dämpft die durch Hypoxie induzierte Verletzung in PC12-Zellen, indem es ROS löscht und die Aktivitäten von aufrechterhältAntioxidansEnzyme und Hemmung des mitochondrialen Apoptosewegs.

Schlüsselwörter: Norwogonin,Antioxidative Aktivität, Hypoxie, oxidativer Stress, Apoptose

Hintergrund

Aerobe Organismen benötigen Sauerstoff (O2) zur Energiegewinnung. Hypoxie ist definiert als unzureichende O2-Versorgung zur Aufrechterhaltung der Zellfunktion im Gewebe und tritt häufig in einigen physiologischen Situationen wie Höhenlage [1] und in vielen pathologischen Situationen wie Schlaganfall [2] auf. Das Gehirn ist aufgrund seines hohen Sauerstoffverbrauchs, reich an ungesättigten Fettsäuren und niedrig, besonders empfindlich gegenüber Hypoxie-induzierten VerletzungenAntioxidansKapazität [3]. Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass Hypoxie negative Auswirkungen auf das Gehirn haben kann [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia und Huiping Ma

Department of Pharmacy, the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Lanzhou 730050, Gansu, China

Oxidativer Stress und Apoptose werden als zwei Faktoren angesehen, die zu Hypoxie-induzierten Verletzungen beitragen [7, 8]. Es wurde berichtet, dass eine Hypoxie-Exposition die Produktion von intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erhöht, was oxidativen Stress erleichtert. Übermäßiges ROS, wie Superoxidanion (O2−˙ ), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxylradikal (HO•), führt zu strukturellen und funktionellen zellulären Veränderungen, indem es Lipide, Membranen, Proteine ​​und DNA angreift und anschließend Zellschäden verursacht [ 9].

Klicken Sie auf Cistanches für Antioxidantien

Gleichzeitig erleichtert überproduziertes ROS auch die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) [10] und die Übertragung von Pro-Apoptose-Proteinen auf die äußere Mitochondrienmembran, was eine Depolarisation der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Cytochrom c induziert [11]. Diese Veränderungen verursachen letztendlich eine mitochondrienabhängige Apoptose [12]. Also wird das geglaubtAntioxidantienmit der Fähigkeit, übermäßige ROS zu hemmen oder zu eliminieren, können ihre Schutzwirkung über die Abschwächung von oxidativem Stress und durch Hypoxie induzierter Apoptose ausüben. Das haben viele Studien bewiesenAntioxidansNahrungsergänzungsmittel wie Vitamin C [13], Isoflavon [8] und Nitroxidradikale [14] können die durch Hypoxie induzierte Schädigung in vitro und in vivo begrenzen. Flavonoide sind eine große und vielfältige Klasse von allgegenwärtigen sekundären Pflanzenmetaboliten. Sie werden immer als ausgezeichnete Natur angesehenAntioxidansmit der Fähigkeit, freie Radikale abzufangen und die Lipidperoxidation zu hemmen.

Derzeit wird dieser Klasse von Verbindungen aufgrund ihrer positiven Wirkungen auf die menschliche Gesundheit immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt. Es wurde gezeigt, dass Flavonoide ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen besitzen, wie z. B. entzündungshemmende, antinozizeptive und neuroprotektive Aktivität usw., die alle auf ihre antioxidativen Aktivitäten zurückgeführt werden können [15]. Viele Studien haben gezeigt, dass Flavonoide hervorragende Schutzwirkungen auf Hypoxie-induziertes Versagen aufweisen. Beispielsweise hat Rutin eine starke neuroprotektive Wirkung gegen den durch Hypoxie induzierten retinalen Ganglienzelltod [16]. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt auch, dass Rutin durch Cobaltchlorid induzierte Hypoxieschäden lindern kann, indem es oxidativen Stress und Apoptose in H9c2-Zellen hemmt [17]. Darüber hinaus schlagen Liu et al. vor, dass Nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-Hexamethoxyflavon) die myokardiale I/R-Verletzung über die Aktivierung des Akt/GSK-3-Signalwegs in H9c2-Zellen dämpft [18]. Darüber hinaus kann Acacetin Ratten-Kardiomyozyten und H9C2-Kardiomyoblasten über eine AMPK-vermittelte Aktivierung des Nrf2-Signalwegs vor einer durch Hypoxie/Reoxygenierung induzierten Schädigung schützen [19].

Norwogonin (5,7,8-Trihydroxyflavon, Abb. 1) ist ein pharmakologisch aktives Flavon, das aus der Wurzel von Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" auf Chinesisch), einem traditionellen chinesischen Kraut zur Behandlung von Grippe und Krebs, abgetrennt wird [20, 21]. Aufgrund seiner geringen Konzentrationen in natürlichen Pflanzen wurden jedoch nur begrenzte Studien zu den biologischen Aktivitäten von Norwogonin berichtet. Um dieses Problem anzugehen, wird über mehrere Syntheseverfahren von Norwogonin berichtet [22, 23].

Unsere frühere Studie etablierte auch eine einfache Methode zur Gewinnung von Norwogonin aus Chrysin in vier Schritten [24]. Diese Forschungen haben die weitere Bewertung der biologischen Aktivitäten von Norwogonin positiv beeinflusst. Studien haben gezeigt, dass Norwogonin antioxidative [25], krebshemmende [26, 27], antivirale [28] und antimikrobielle Aktivitäten [29] besitzt sowie die durch Cyanid stimulierte Produktion von ROS hemmt [30]. Ob Norwogonin jedoch Schutzkapazitäten gegen Hypoxie-induzierte Verletzungen besitzt, ist noch nicht bekannt. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Schutzwirkung von Norwogonin gegen Hypoxie-induzierten oxidativen Stress und Apoptose in PC12-Zellen zu untersuchen.

Methoden

Materialien und Reagenzien

Norwogonin (Reinheit größer als oder gleich 98 Prozent) wurde gemäß unserer zuvor beschriebenen Methode synthetisiert [24]. Rutin (Reinheit größer als oder gleich 96 Prozent) wurde von Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, China) gekauft. Norwogonin und Rutin wurden in sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, bei –20 Grad gelagert und unmittelbar vor der Verwendung im Zellkulturmedium verdünnt. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS), Streptomycin und Penicillin wurden von Solarbio Co., Ltd. (Peking, China) bezogen.

Die Kits von Malondialdehyd (MDA), Lactatdehydrogenase (LDH), Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Glutathionperoxidase (GPx) wurden vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, China) bezogen. 2′,7′-Dichlorid-Hydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) und (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazolium). Bromid) Tetrazolium (MTT) wurde von Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA) bezogen. Primärantikörper für Hypoxie-induzierbaren Faktor-1 (HIF-1), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} assoziiertes X-Protein (Bax), Caspase-3, Cytochrom C und -Actin wurden alle von Abcam (Cambridge, UK) gekauft. Sekundärantikörper wurden von ZsBio Company (Peking, China) erhalten.

Ein Apoptose-Analysekit wurde vom Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, China) erhalten. Alle Chemikalien und Lösungsmittel waren von analytischer Qualität und wurden von einem kommerziellen Lieferanten in China bezogen. Zellkultur Die PC12-Zellen wurden von der Cell Bank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (TCR 9, Shanghai, China) erworben und in DMEM mit 10 Prozent (v/v) FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin gehalten bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO2. Um die Zytotoxizität von Norwogonin zu bewerten, wurden PC12-Zellen (Passage 4–6) mit verschiedenen Konzentrationen (10–8, 10–7, 10–6, 10–5, 10–4 mol/L) von Norwogonin für vorinkubiert 1 h und dann für 24 h kultiviert. Hypoxie-Exposition Um ein Zell-Hypoxie-Verletzungsmodell zu induzieren, wurden PC12-Zellen einer Hypoxie-Umgebung (1 Prozent O2, 5 Prozent CO2 und 94 Prozent N2) bei 37 Grad für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer ausgesetzt. Normoxische Kontrollzellen wurden bei 37 Grad in einem Inkubator mit 5 Prozent CO2 für 24 Stunden kultiviert.

Um die Schutzwirkung von Norwogonin gegen Hypoxie-induzierte Schädigung zu bewerten, wurden PC12-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen vorinkubiert (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) von Norwogonin für 1 h vor der Hypoxiebehandlung. Lebensfähigkeit der Zellen Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch einen MTT-Assay wie zuvor beschrieben gemessen [31]. Kurz gesagt, PC12-Zellen (1 × 10 5 Zellen/ml) wurden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Dann wurden den Vertiefungen unterschiedliche Konzentrationen von Norwogonin zugesetzt. Den Kontrollvertiefungen wurde ein gleiches Volumen DMSO zugesetzt. Die Endkonzentration von DMSO im Zellkulturmedium beträgt 0,1 Prozent. Nach der Inkubation unter normoxischen oder hypoxiischen Bedingungen wurden 10 &mgr;l MTT (5,0 mg/ml) zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37 Grad für 4 h. Dann wurde der Überstand mit MTT entfernt und das Formazan-Produkt in 100 &mgr;l DMSO gelöst. Die Extinktion wurde auf einem SpectraMax i3-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei 570 nm gemessen. Die Ergebnisse wurden als relativer Prozentsatz der Kontrollgruppe ausgedrückt. Mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbte PC12-Zellen, die auf Deckgläschen aus Glas ausgesät wurden, wurden 24 h lang inkubiert, bevor sie mit Norwogonin auf die gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt wurden.

Das Medium wurde entfernt und die Deckgläser wurden mit kaltem PBS gewaschen, gefolgt von einer Fixierung mit Methanol für 10 min bei Raumtemperatur und dann dreimal für 5 min mit kaltem PBS gewaschen. Abschließend wurden die Zellen nach dem HE-Färbeprotokoll gefärbt [32]. Die Analysen der Zelle wurden unter Verwendung eines OLYMPUS IX73-Mikroskops (100×) durchgeführt, um zellmorphologische Veränderungen zu verifizieren. Digitale Bilder wurden unter Verwendung der mit dem Mikroskop verbundenen Digitalkamera DXM 1200 C (Nikon) erhalten. ROS-Gehalt Der intrazelluläre ROS-Gehalt in PC12-Zellen wurde mit dem DCFH-DA-Assay bestimmt [33]. Kurz gesagt, PC12-Zellen (1 × 10 5 Zellen/ml) wurden in Platten mit 6- Vertiefungen ausgesät. Nach der Hypoxiebehandlung wurden die PC12-Zellen mit PBS gewaschen und dann in dem Kulturmedium, das 10 &mgr;M DCFH-DA enthielt, für 30 Minuten im Dunkeln bei 37 Grad inkubiert. Die Zellen wurden mit einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop von Olympus (Tokio, Japan) beobachtet und mit einem Becton Dickinson FACScan-Durchflusszytometer (BD Biosciences, CA, USA) mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm analysiert. Der ROS-Gehalt wurde als relativer Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. LDH-Leckage, MDA-Gehalt und antioxidative Enzymaktivität PC12-Zellen (1 × 10 5 Zellen/ml) wurden in eine 90-mm-Schale ausgesät. Nach der oben beschriebenen Hypoxiebehandlung wurden 50 &mgr;l Kulturüberstand von jeder Schale gesammelt, und die LDH-Aktivität im Medium wurde unter Verwendung von kommerziellen Assay-Kits (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) nachgewiesen und als U/ml ausgedrückt. Die PC12-Zellen wurden geerntet und nach zweimaligem Waschen mit kaltem PBS homogenisiert. Die Konzentration des Gesamtproteins wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemessen. Der MDA-Gehalt und die antioxidative Enzymaktivität wurden unter Verwendung kommerzieller Assay-Kits (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) bestimmt.

Der MDA-Gehalt wurde als nmol/mg Protein angegeben. Die Aktivitäten von SOD, CAT und GPx wurden als U/mg Protein dargestellt. Zellapoptose (Annexin-V/PI-Färbung) Nach Hypoxiebehandlung wurden PC12-Zellen geerntet, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und dann mit Bindungspuffer suspendiert. Die Zellen wurden mit der Lösung von Annexin V-FITC und PI gemäß dem Protokoll des Herstellers (Beyotime, Shanghai, China) behandelt. Datensammlungen wurden unter Verwendung des Becton Dickinson FACScan-Durchflusszytometers (BD Biosciences, CA, USA) durchgeführt. Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse Die Gesamt-RNA von PC12-Zellen wurde mit Trizol-Reagenz (Takara, Dalian, China) extrahiert und mit dem PrimeScript TM RT-Reagenz-Kit (AK4301,

Takara, Dalian, China). Die cDNA, die das HIF-1-, VEGF-, Bcl-2-, Bax-, Caspase-3-, Cytochrom C- und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen kodiert, wurde durch quantitative Real- Zeit-PCR unter Verwendung eines 7300-Echtzeit-Detektionssystems (Applied Biosystems, CA, USA). Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 gezeigt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren 95 Grad für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 Grad für 5 s und 60 Grad für 31 s. Die mRNA-Spiegel wurden mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet und auf GAPDH, das Referenzgen, normalisiert. Western-Blot-PC12-Zellen wurden geerntet und in RIPA-Mitteln homogenisiert. Die Konzentration der Gesamtproteine ​​wurde unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits quantifiziert. 30 ug Proben wurden auf 12 % SDS-PAGE-Elektrophorese aufgelöst und dann auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen.

Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBST-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und mit primären Antikörpern inkubiert: Anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), Anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), Anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), Anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), Anti-Caspase-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), Anti-Cytochrom C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) und Anti-- -Aktin (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) bei 4 Grad über Nacht. Dann wurden die Membranen gewaschen und mit sekundären Antikörpern (1:2000, ZsBio, Peking, China;) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die immunreaktiven Banden wurden unter Verwendung von Reagenzien mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL) sichtbar gemacht. Die relativen Intensitäten der Banden wurden auf die interne -Actin-Kontrolle normalisiert und unter Verwendung von Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) analysiert.

statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, der aus mindestens drei unabhängigen Experimenten abgeleitet wurde. Der Unterschied zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von dem Student-Newman-Keuls-Post-hoc-Test analysiert. Ein P-Wert von < 0,05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="">

Ergebnisse

Norwogonin schützt PC12-Zellen vor Hypoxie-induzierter Verletzung

Zunächst wurde, um die proliferative Aktivität von Norwogonin auszuschließen, seine Cytotoxizität auf normale PC12-Zellen unter Verwendung eines MTT-Assays bestimmt. Wie in Abb. 2a zu sehen ist, wurde die Zellproliferation nach der Behandlung mit Norwogonin in Konzentrationen von 1 × 10– 8 -1 × 10– 5 mol/L (P > 0,05 ). Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm jedoch signifikant ab, wenn die Konzentration von Norwogonin auf 1 × 10– 4 mol/L (P < 0,05)="" erhöht="" wurde.="" die="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" norwogonin="" bei="" konzentrationen="" von="" 1="" ×="" 10–="" 8="" -1="" ×="" 10–="" 5="" mol/l="" keine="" toxizität="" oder="" proliferative="" aktivität="" auf="" pc12-zellen="">

Dann untersuchten wir die schützende Wirkung von Norwogonin gegen eine durch Hypoxie induzierte Schädigung von PC12-Zellen. Wie in Abb. 2b gezeigt, war die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe in der Hypoxiegruppe auf 58,71 Prozent verringert (P < 0.01).="" verglichen="" mit="" der="" hypoxiebehandlung,="" vorbehandelt="" mit="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" und="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" norwogonin="" dosisabhängig="" geschütztes="" pc12="" zellen="" gegen="" hypoxie-induzierte="" schädigung,="" wiederherstellung="" der="" zelllebensfähigkeit="" von="" 58,71="" bis="" 62,79="" prozent="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" prozent="" (p="">< 0,01)="" bzw.="" 69,88="" prozent="" (p="">< 0,01).="" auch="" die="" vorbehandlung="" mit="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" rutin="" zeigte="" einen="" protektiven="" effekt="" und="" erhöhte="" die="" zellviabilität="" signifikant="" auf="" 63,78="" prozent="" im="" vergleich="" zur="" hypoxiebehandlung.="" die="" mit="" 1="" ×="" 10−5="" mol/l="" norwogonin="" vorbehandelte="" lebensfähigkeit="" war="" auf="" 63,43="" prozent="" gesunken,="" was="" immer="" noch="" signifikant="" höher="" ist="" als="" in="" der="" hypoxiegruppe="" (p="">< 0,05).="" diese="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" norwogonin="" bei="" konzentrationen="" von="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" eine="" signifikante="" zytoprotektion="" zeigte="" und="" die="" wirksamste="" konzentration="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" beträgt.="" dann="" wurde="" diese="" dosis="" als="" optimale="" dosis="" in="" den="" folgenden="" experimenten="">

Die Schutzkapazität von Norwogonin wurde auch durch morphologische Veränderungen bestätigt. Wie in Fig. 2c gezeigt, wuchsen PC12-Zellen ohne Hypoxiebehandlung gut mit regelmäßigen Formen (fusiform), einheitlichen Größen. Nach Hypoxie-Exposition zeigten PC12-Zellen Schrumpfung, abgerundete Form, Abschuppung und reduzierte Zelldichte. Die vor der Hypoxie-Exposition mit Norwogonin oder Rutin vorbehandelten Zellen wuchsen besser, die Anzahl der Desquamationszellen nahm ab und die Zellform erholte sich normal. Außerdem wurde die Schutzfähigkeit von Norwogonin durch das LDH-Leck bestätigt, das mit dem Verlust der Zellmembranintegrität verbunden ist. Wie in Fig. 2d gezeigt, war die LDH-Aktivität im Kulturmedium nach Hypoxie-Exposition merklich erhöht (P <>

Die Vorbehandlung mit Norwogonin oder Rutin verringerte die LDH-Leckage dramatisch, was darauf hindeutet, dass Norwogonin und Rutin die Integrität der Zellmembran wiederherstellten. Norwogonin hemmt Hypoxie-induzierten oxidativen Stress in PC12-Zellen ROS und MDA sind zwei wichtige Indikatoren für zellulären oxidativen Stress, der durch Hypoxie induziert wird. Wie in Abb. 3a und b gezeigt, wurde in PC12-Zellen nach Hypoxie-Exposition ein signifikant erhöhter Gehalt an ROS und MDA beobachtet. Eine Vorbehandlung mit Norwogonin oder Rutin hemmte signifikant die Produktion von ROS und MDA.

Antioxidative Enzyme wie SOD, CAT und GPx gelten als das wichtigste Abwehrsystem gegen oxidativen Stress in Zellen. Wie in 3c –e gezeigt, hemmte die Hypoxie-Exposition die Aktivitäten von SOD, CAT und GPx in PC12-Zellen signifikant. Die Behandlung mit Norwogonin oder Rutin kehrte diese Veränderungen um und stellte die Aktivitäten antioxidativer Enzyme wieder her. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass Norwogonin die PC12-Zellen vor oxidativem Stress schützte, der durch Hypoxie induziert wurde.