Zahlreiche therapeutische Verbindungen wurden aus natürlich reichlich vorhandenen organischen Ressourcen isoliert

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Zahlreiche therapeutische Verbindungen wurden aus natürlich reichlich vorhandenen organischen Ressourcen isoliert, die wirtschaftliche und nachhaltige Quellen für Verbindungen mit sicheren und wirksamen biologischen Aktivitäten bieten können. In der Kosmetikindustrie werden eifrig Naturstoffe mit Anti-Aging-Wirkung gesucht. Daher haben wir verschiedene Extrakte aus Rubusfraxinifolius-Blättern hergestellt und mithilfe von Enzyminhibitionsassays Verbindungen mit Schutzwirkung gegen Hautalterung isoliert. Aus Rubus fraxinifolius Poir wurden zwei Triterpenoide isoliert. Laub. Die Strukturen wurden durch spektroskopische Analysen (LC-ESI-MS, 1D/2D-NMR) und Vergleich mit berichteten Daten charakterisiert. Verbindung 1 und 2 wurden als 2,3-O-Ethylenglykol,19-Hydroxyure-12-en-23,28-Disäure und 2,{{15} bestimmt. }O-Propandiol,19-Hydroxyur-12-en-28-säure. Methanolextrakte und -isolate wurden auf ihre hemmenden Wirkungen auf Elastase und Tyrosinase untersucht. Die Verbindungen 1 und 2 hemmten Elastase mit ICso 122,199 ug/ml und 98,22 ug/ml und hemmten auch Tyrosinase mit ICso 207,79 ug/Armee bzw. 221,51 ug/ml. Das molekulare Docking bewies, dass beide Verbindungen Affinitäten zu den Enzymen haben.

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Obwohl es schwierig zu erreichen ist, können natürliche Anti-Aging-Substanzen, die für den Menschen sicher sind, wirtschaftlich und nachhaltig aus reichlich vorhandenen natürlichen Ressourcen gewonnen werden. Etwa 700 Arten von Rubus (Rosaceae) sind weltweit verbreitet, obwohl nur wenige Arten in den Tropen vorkommen. Diese Gattung enthält Nährstoffe (Zucker, Vitamine usw.), Sekundärmetabolite (Triterpenoide, Flavonoide, Polyphenole usw.) und hat viele Anti-Aging-Aktivitäten (Antioxidans, Ameisenelastase, Ameisentyrosinase, Antikollagenase, Anti-UV, entzündungshemmend, wundheilend, etc.)1. Darüber hinaus wurde auch von Rubus-Spezies berichtet, dass sie verschiedene Triterpene mit verschiedenen biologischen Aktivitäten enthalten.

In Indonesien R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) ist in Java, Borneo usw. verbreitet und im Volksmund als 'urban' bekannt.was ist cistancheDarüber hinaus ernten einige lokale Bauern diese Pflanzen, und die Beerenfrucht wird normalerweise entweder frisch oder gefroren verzehrt. Unsere frühere Studie hat gezeigt, dass R. frascinifolius-Stammextrakt die Aktivität hat, Elastase, Tyrosinase zu hemmen und als Antioxidans8. Einige andere Untersuchungen zeigten auch, dass die Blätter und Früchte von R. fraxinifolius eine starke antioxidative Aktivität haben?10. Die Untersuchung von R. fraxinifolius wurde jedoch wenig erforscht, und es wurden keine Studien über chemische Komponenten berichtet.

Cistanche kann Anti-Aging

Elastase ist ein Serinprotease-Enzym, das eine entscheidende Rolle bei der Faltenbildung oder Erschlaffung der Haut durch den Abbau der elastischen Hautfasern (Elastin) spielt und einen Verlust der Hautelastizität verursacht. Eines davon ist von Hautfibroblasten stammende Elastase. Als Moderatoren des Elastinfaserabbaus, der die Hautalterung verursacht, haben Elastase-Inhibitoren als Mittel für kosmetische Präparate Aufmerksamkeit erregt12. Die Melanogenese wird durch Tyrosinase vermittelt und reguliert die Melaninbiosynthese durch eine zweistufige Reaktion. Im ersten Schritt wird L-Tyrosin zu L-3,4--Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) hydroxyliert. Im zweiten Schritt wird L-DOPA zum entsprechenden O-Chinon oxidiert. Daher werden in der Kosmetik häufig Naturstoffe mit tyrosinasehemmender Wirkung eingesetzt, die die Hyperpigmentierung mit Melanin hemmen und damit die Hautaufhellung begünstigen.Anti-Aging-CistancheDie Elastase- und Tyrosinase-Enzym-Inhibitoren könnten als Hautaufheller, Anti-Aging- oder Anti-Falten-Mittel zur Behandlung dermatologischer Erkrankungen entwickelt werden44.

Diese Studie isolierte Ursan-Triterpenoide aus R.fraxinifolius-Blättern und erläuterte ihre Strukturen in spektroskopischen Analysen mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektroskopie (ESI-MS) und 'H-NMR, |3C-NMR und 2D-NMR (DEPT, HSQC, HMQC und HMBC). Anschließend führten wir Assays der Elastase- und Tyrosinase-Hemmaktivitäten von Rohextrakten, Fraktionen und isolierten Verbindungen durch.

Die Aktivität von zwei ausgewählten Verbindungen wurde in dieser Forschung auch durch die In-Silico-Methode beobachtet. Ein molekularer Docking-Ansatz wurde mit DockThorl516 durchgeführt. Die in dieser Forschung verwendeten Makromoleküle wurden aus der Proteindatenbank (RCSB PDB, 2000) mit den Identitäten 2y9x und 3hgp für Tyrosinase bzw. Elastase erhalten1718. Die Makromoleküle wurden in UCSF Chimera und den molekularen Docking-Ergebnissen optimiert wurden mit PyMOL1920 beobachtet.

Resultate und Diskussion

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 Prozent in 100 ug/ml, während n-Hexan-Extrakt keine Aktivität aufwies (Fig. 1). Einige Rubus zeigten auch Elastase-hemmende Aktivität, wie R. Sanctus (Prozent Hemmung 14,68-49,20 in 100 ug/ml), R.compactus,R. robustus usw.221. Daher fraktionierten wir die aktiven Extrakte unter Verwendung von Vakuumflüssigkeitschromatographie/VLC und sammelten 11 Fraktionen von jedem. Fraktionen aus Ethylacetat-Extrakt zeigten schwache Elastase-hemmende Aktivitäten (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Die Isolate wurden unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie (LCMS), 'H- und 13C-NMR, DEPT, heteronuklearer Einzelquantenkohärenz (HSQC), heteronuklearer Mehrfachquantenkorrelation (HMQC) und heteronuklearer Mehrfachbindungskorrelation (HMBC) identifiziert und charakterisiert. Tabelle 1 zeigt die NMR-Spektraldaten von Verbindungen.

Verbindung 1: wurde als amorphes weißes Pulver isoliert. LCMS-ESI-Spektren für diese Verbindung zeigten einen Molekularionenpeak bei m/z 543,32 [MH]t, was auf die Molekularformel C32H48O- mit neun Ungesättigtheitsäquivalenten hindeutet olefinische (1,684 cm-1)-funktionelle Gruppen. Darüber hinaus zeigten die 'H-NMR-Spektren von Verbindung I für das Methinproton (CH) ein Singulett-Signal bei 2,6, ein charakteristisches Signal für H-18 vom Ursan-Typ Triterpene mit 19-O-Substitutionen. Auch der Triterpentyp 19a-Hydroxy-Ursan hat ein typisches Protonensignal im Bereich um 2,6 ppm. Dieses entschirmte Signal kann sich deutlich von anderen ordinalen Methylenprotonensignalen unterscheiden, mit einer charakteristischen Verschiebung aufgrund eines olefinischen Protons (H12) bei etwa 5,28 (t, J{=6}Hz).cistanche benefíciosVollständige und eindeutige Zuordnungen der chemischen Verschiebungen von 'H und 13C wurden durch HMQC(13Cx'H)- und HMBC(15Cx'H)-Spektren unterstützt. Aus dem HMBC-Kreuzpeak wurde bestätigt, dass das Proton bei ou 2,60 H{ ist {5}}(Abb.2a). Andere spezifische Merkmale wurden für die fünf Methyl-Singuletts bei 1,89,1,02,0,82,1,32,1,20 (jeweils H24-27;29), ein Methyl-Dublett bei og 0,92 (d, J=6 Hz) und das olefinische Protonensignal bei 5,30 (t, J=7 Hz, H-12). Die vorliegenden 13C-NMR-Spektren zeigen 32 Kohlenstoffresonanzen und zeigten mit DEPT- und HMQC-Spektren zwei Carbonylkohlenstoffe (δC183,70, C-28 und 8-178,96, C-23), einen olefinischen Kohlenstoff bei oc 127.23,C-12,ein olefinischer quartärer Kohlenstoff (oc139.49,C-13),ein sauerstoffhaltiger quartärer Kohlenstoff （o-72.7, C-19 ）, zehn aliphatische Methylene und sechs Methylkohlenstoffe. Die beiden olefinischen Kohlenstoffe bei δ-127,23 (C-12) und 139,49 (C-13) waren charakteristisch für den Ursan-Triterpenoid-Typ. Ein weiteres Signal, das auf die Anwesenheit von Ethylenglycol （-OCH-CH-O-） hinwies, wurde bei Signalen bei δ4,62 (d, J=11,5 Hz), 4,05 (d, J=11) gezeigt. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）und 4.06（d, J=11.5Hz）und unterstützt mit δ61.27（t）und 63.20（t）. Es befand sich bei C-2 und C-3 basierend auf dem Vorhandensein einer langreichweitigen Korrelation in den HMBC-Spektren. Daher wurde Verbindung 1 als 2,3-O-Ethylenglycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-diic acid identifiziert (Abb. 3a).

Verbindung 2: wurde als weißes amorphes Pulver erhalten. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (berechnet für 528,3815). In LCMS-ESI-Spektren ist ein Molekularionenpeak bei m/z 527,33 [MH]t vorhanden, was auf die Summenformel CH Os hinweist, die 8 Grade an Ungesättigtheit erforderte. {15}}) und olefinische (1.686 cm-1) funktionelle Gruppen. Darüber hinaus zeigten die 'HNMR-Spektren für Verbindung 2 ein Singulett bei 2,42, was charakteristisch für das H18 eines Triterpens vom Ursan-Typ mit {{24 }}O-Substitution.Cistanche-Extrakt gegen StrahlungAndere spezifische charakteristische Spektren umfassten das Vorhandensein von sechs Methyl-Singuletts bei og1.22 0.76, 0.97, 0.69, 1.30 und 1.17 (jeweils H -24-28, H-30), ein Methyldublett bei 0,91 (d, J=7 Hz) und das olefinische Protonensignal bei ou 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Entsprechende l3(CNMR- und DEPT-Spektren zeigen 33 Kohlenstoffresonanzen, und HSQC- und HMQC-Spektren zeigen das Vorhandensein eines Carbonylkohlenstoffs (oc 182.23, C-28), eines olefinischen Kohlenstoffs （δ-129.36, C -12）, ein olefinischer quartärer Kohlenstoff （δ-140.24, C-13）, ein sauerstoffhaltiger quartärer Kohlenstoff (oc73.68, C-19), elf aliphatisch Methylen und sieben Methylkohlenstoffatome. Diese Daten zeigten, dass Verbindung 2 ein Ursan-Triterpenoid-Skelett trägt. Die anderen Signale zeigen das Vorhandensein von 1, 3- funktioneller Propandiolgruppe bei og 3,22 (d, J{=11) an. 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10,5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) und 4,02 (d, J=11,5 Hz) und 3,36 (t, J{ {57}}.5Hz). Seine funktionelle Gruppe hat eine langreichweitige Korrelation mit C2-C3. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde Verbindung 2 somit als 2,3-O-Propandiol,{{ 66}}hydroxyurs-12-en-28-oic acid (Abb. 2b und 3b). Eine ähnliche Verbindung ist 2,3-O-Isopropylidene quält Säure, isoliert aus Rubus xanthocarpus.7

In Tabelle 1 wurden alle 'H- und 'C-NMR-Spektren mit Tortensäure (TA/2a,3a,19-trihydroxy-12-ursen-28-oesäure）² verglichen, was a ist Ursan-Triterpenoid, das in mehreren Rubus-Spezies gefunden wurde-p Tormentic-Säure wies starke Ähnlichkeiten mit den Verbindungen 1 und 2 auf, außer dass sich die chemischen Verschiebungen in Bezug auf C-23 und C31-33 unterschieden. Diese Einheit wurde auch in bestätigt DEPT-, HMQC- und HMBC-Experimente (Abb. 2).

Das Triterpenoid Quälsäure ist in natürlichen pflanzlichen Lebensmitteln weit verbreitet. Es hat verschiedene Bioaktivitäten: hypoglykämische Wirkungen, entzündungshemmende und antiatherogene Eigenschaften, verringerte die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen und antiproliferative Aktivitäten in Nieren-, Prostata- und Melanom-Krebszelllinien2426. Da diese Verbindungen das gleiche Gerüst haben, haben sie daher möglicherweise geeignete potentielle Aktivitäten.

Fig. 4 zeigt die inhibitorische Elastase- und Tyrosinase-Aktivität von Isolaten. Die aus in-vitro-Enzymhemmtests erhaltenen Daten wurden als Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Verbindungen 1 und 2 hemmten Elastase mit ICso 122,199 und 98,22 ug/ml und hemmten auch Tyrosinase mit ICso 207,79 bzw. 221,51 ug/ml. Von einigen pentazyklischen Triterpenoiden (Ursolsäure und Oleanolsäure) wurde berichtet, dass sie Elastase-hemmende Wirkung haben2728. Auch der Elastase-Hemmwert von Verbindung 2 ist niedriger als der von Verbindung 1. Beide Verbindungen zeigten eine geringere Hemmaktivität als die Positivkontrolle Oleanolsäure, die einen ICso-Wert von 90,39 ug/ml aufwies. In Übereinstimmung damit zeigten frühere Studien einen ICso-Wert von 76,5 ug/ml für Oleanolsäure und einen ICso-Wert von 31,0 ug/ml für Ursolsäure28. Zuvor berichtete kinetische Analysen von pentacyclischen Triterpenen zeigten, dass diese Verbindungen kompetitiv und reversibel Neutrophilen-Elastase hemmen. In derselben Studie zeigten molekulare Docking-Experimente, dass die molekulare Gerüsteinheit 28-COOH und Doppelbindungen in pentacyclischen Triterpenen für ihre inhibitorischen Aktivitäten wesentlich sind

Eines der Probleme, die mit zunehmendem Alter auftreten, ist die Hyperpigmentierung.cistanche herbaDaher wird ständig nach hautaufhellenden Wirkstoffen oder neuen Depigmentierungen gesucht. Die Unterdrückung der Tyrosinase kann gegen die Melanogenese wirken.“ Wie in Fig. 4 gezeigt, zeigten der Methanolextrakt und die Verbindungen I und 2 mäßige Aktivitäten als Tyrosinase-Inhibitoren.

In dieser Forschung wurde Molecular Docking auch verwendet, um die Bindungsaktivitäten ausgewählter Verbindungen an Tyrosinase und Elastase als ihre Ziele zu analysieren. Die verwendeten Kristallstrukturen waren 2Y9X, eine Kristallstruktur von Tyrosinase aus Agaricus bisporus mit Inhibitor Tropolon; und BHGP, eine Kristallstruktur von Schweine-Pankreas-Elastase, komplexiert mit einem potenten Peptidyl-Inhibitor FR130180. Beide wurden ausgewählt, weil sie von demselben Organismus erhalten wurden, der für den in vitro-Assay dieser Forschung verwendet wurde. Die Makromoleküle sind auch an ihre jeweiligen Inhibitoren gebunden, so dass der aktive Zustand der Enzymkonformationen erhalten werden konnte. Die Kokristalle wurden als Zentrum des molekularen Docking-Targets verwendet, um die Bindungswahrscheinlichkeiten der Verbindungen einzugrenzen, damit der Bewertungsprozess effizienter wird.

Aus dem molekularen Docking wurden durchschnittliche Bindungsaffinitäten für beide Verbindungen erhalten, wie in den Fig. 5 und 6 gezeigt. Die Affinitätsvorhersage wird verwendet, um verschiedene Liganden unter Berücksichtigung der höchsten Energielage jeder Verbindung einzustufen, eine Vorhersage einer besseren Energielage wird durch gezeigt niedrigere Bindungsaffinitätswerte16. Das Redocking des designierten Inhibitors Tropolon erfolgte mit durchschnittlichen Bindungsaffinitäten von -7,41 kcal/mol. Die durchschnittlichen Bindungsaffinitäten der Verbindungen 1 und 2 an Tyrosinase waren -7,84 kcal/mol bzw. -8,37 kcal/mol (Tabelle 2). Es wurde vorhergesagt, dass beide Verbindungen eine bessere Affinität als der Inhibitor haben.

Unterdessen betrug die durchschnittliche Bindungsaffinität von Elastaseredocking -7,84 kcal/mol. Die durchschnittlichen Bindungsaffinitäten der Verbindungen 1 und 2 an Elastase waren -7,58 kcal/mol bzw. -8,06 kcal/mol. Obwohl das Ergebnis zeigte, dass Verbindung 1 niedrigere Affinitäten als der Cokristall hat, ist es etwas anders (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Methoden

Allgemeine experimentelle Verfahren. 'H- und '-NMR-Spektren wurden bei 500 MHz unter Verwendung eines JEOL JNM-ECZ500R/S1-Instruments aufgezeichnet. Infrarot (IR)-Spektren wurden mit einem FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu gemessen. Andere Analysen wurden unter Verwendung eines Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof-Instruments, eines VersaMax-Mikroplatten-Lesegeräts und eines BioTek ELX800-Mikroplatten-Lesegeräts, Lore-beschichteter Aluminiumblätter TLC-Kieselgel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. , Säulenchromatographie (CC) wurden unter Verwendung von Kieselgel 60 (Merck, Darmstadt, Deutschland) mit 70-230-Mesh für offene Chromatographie und 230-400-Mesh für Vakuumchromatographie durchgeführt. Pflanzenmaterialien. Blätter von R. fraxinifolius wurden im Dezember 2018 von einem Plantagengebiet im Berg Pangrango, West-Java, in einer Höhe von 4.343 Fuß gesammelt. Das Exemplar wurde von einem Botaniker (Dr. Joni Setijo) am Forschungszentrum für Biologie des Indonesischen Instituts für identifiziert Sciences, Indonesien, mit der Exemplarnummer 033/IPH.1.01/If.07. Die Sammlung von Pflanzenmaterial hatte die Genehmigung des Landwirts erhalten und entsprach den institutionellen Vorschriften und Richtlinien.

Extraktion und Isolierung. Luftgetrocknete pulverisierte Blätter (2300 g) wurden unter Verwendung einer Soxhlet-Apparatur mit einem Lösungsmittelgradienten (n-Hexan, EtOAc und MeOH) extrahiert, um die entsprechenden Extrakte bereitzustellen, und dann mit einem Rotationsverdampfer eingedampft und Vakuumofen. Der Methanolextrakt (291 g) und der Ethylacetatextrakt (65 g) wurden auf dem Kieselgel adsorbiert und einer Vakuumflüssigkeitschromatographie/VLC unterzogen, wobei mit einem schrittweisen Gradienten von EtOAc:MeOH (von 1:0 bis 0:1) eluiert wurde Produziere Fraktionen für jeden Extrakt (Eal-Hall und M1-Mill and). Ähnliche Fraktionen, die positive Reaktionen mit Vanillin-Schwefelsäure-Reagenzien in TLC zeigten, wurden vereinigt. Fraktionsausbeute: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); und M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }} (2,9 g). Alle Fraktionen wurden für die Inhibitor-Elastase-Aktivität vorgelegt, Fr. M8 ergab die größte Ausbeute und hatte eine starke Aktivität. Fr. M8 sukzessive weitere Verteilung durch CC über Kieselgel (Elutionsmittel CH2Cl2/MeOH mit schrittweisem Gradienten) und Reinigung unter Verwendung einer Sephadex LH-20-Säule (Elution mit CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Zwei Fraktionen zeigten eine feste Beschaffenheit und wurden mit Chloroform und Methanol kristallisiert, um zwei Isolate zu erhalten: Verbindung 1 (18 mg) und Verbindung 2 (31 mg).Die Reinheit aller Isolate wurde durch zweidimensionale TLC und Sichtbarmachen des Flecks unter Verwendung von 5 Prozent Schwefelsäure bewertet Säure in Methanol, gefolgt von Erhitzen der Platten bei 110 Grad für 5 min.

Die Kristalle wurden unter Verwendung von Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie (LCMS), LH- und 3C-Verzerrungsverstärkung durch Polarisationstransfer(DEPT)-NMR, heteronukleare Einzelquantenkohärenz (HSQC), heteronukleare Mehrfachquantenkorrelation (HMQC) und heteronukleare Mehrfache identifiziert und charakterisiert Bond-Korrelation (HMBC).

Elastase-Hemmtest. Der Elastase-Inhibitionsassay wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen durchgeführt32. Kurz gesagt, in Nunc-96-Well-Mikrotiterplatten,20-μl-Aliquots von 0.8-Einheiten/ml PPE in Trizma-Grad-Basispuffer (pH 8).0 ） wurden mit 20- μL-Proben gemischt, und die Mischungen wurden dann auf 180 μL in Trizma-Basispuffer verdünnt. Die Testextrakte wurden mit Enzym 15 min lang vorinkubiert, und 20- μl-Aliquots des Substrats N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid (A3PVN; 2,9 mM) wurden zugegeben und weitere 15 min lang inkubiert. Positive Kontroll- und Blindvertiefungen enthielten Oleanolsäure bzw. Wasser. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt, und die Hemmraten wurden gemäß der Absorption bestimmt; ance bei 401 nm unter Verwendung eines VersaMax-Mikroplatten-Lesegeräts. Die prozentuale Hemmung wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

wobei Eis die Extinktion der Enzymreaktion, Eb die Extinktion der Enzymleerprobe, T die Extinktion der Testprobe und Tb die Extinktion der Testleerprobe ist. außerdem wurden Werte aus einem linearen Diagramm der prozentualen Elastase-Hemmung gegen die Konzentration bestimmt (50,75.100.125.150 ug/ml). Tyrosinase-Hemmtest. Die Tyrosinasehemmung wurde unter Verwendung des DOPA-Chrom-Bildungsverfahrens, wie zuvor beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen bestimmt13. Kurz gesagt, in 96-Well-Platten wurden 20-μl-Aliquots von DMSO (Kontrolle) oder Testverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen mit 40-μl-Aliquots von 30 U/ml Pilz-Tyrosinase (Sigma Aldrich) und 100--μl davon gemischt 0,1- M Phosphatpuffer (pH 6,8). Sie wurden 10 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 4 &mgr;l-Aliquots von 10 mML-DOPA zu jeder Vertiefung und Inkubation bei 37 Grad für 20 Minuten initiiert. Die Tyrosinase-Aktivität wurde dann durch Messung der Extinktion bei 475 nm bestimmt. Kojisäure wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Der Prozentsatz der Tyrosinase-Hemmung wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:

wobei E die Extinktion der Enzymreaktion, Eb die Extinktion der Enzymleerprobe, T die Extinktion der Testprobe und Tb die Extinktion der Testleerprobe ist. auch wurden Werte aus einem linearen Diagramm der prozentualen Elastase-Hemmung gegen die Konzentration (250.125.62,5, 31,25, 15,6 ug/ml) bestimmt.

Molekulares Andocken. In dieser Forschung wurde die pharmakologische Aktivität in silico mit molekularem Docking unter Verwendung eines Arztes vorhergesagt. Gezieltes molekulares Andocken wurde durch Verwendung eines cokristallisierten Liganden als Zentrum des aktiven Zentrums erreicht. Die Struktur 2Y9X wurde für das molekulare Andocken von Tyrosinase mit Tropolon, einem Inhibitor der Pilz-Tyrosinase, als Cokristall verwendet. Das Zentrum der molekularen Andockstelle ist bei -10.032; -28.769 und -43.467 als X-, Y- bzw. Z-Dimension definiert. Kette A wurde zur Verwendung getrennt und das Holmiumatom wurde aus der Struktur unter Verwendung von UCSF Chimera entfernt.

Die Struktur von 3HGP, einer Schweine-Elastase, wurde ebenfalls in dieser Forschung verwendet. FR130180, da der Kokristall als Zentrum der molekularen Andockstelle verwendet wurde. Die Koordinaten waren 12.453, 9.237 bzw. 1.199 für die X-, Y- und Z-Dimensionen. Die Bindungsaffinität wurde von den zehn besten Konformeren jeder molekularen Docking-Berechnung analysiert.

Dieser Artikel ist aus Scientific Reports|extrahiert (2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x