Heutzutage wird die zelluläre Seneszenz als eine gemeinsame Reaktion fast aller Arten von proliferierenden Zellen angesehen

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AbstraktDie gezielte Eliminierung seneszenter Zellen, Analyse, ist einer der Kerntrends in der Anti-Aging-Therapie. Herzglykoside haben sich kürzlich als Breitbandsenolytika erwiesen. Hier haben wir die senolytischen Eigenschaften von Herzglykosiden gegenüber humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) getestet. Herzglykoside hatten keine senolytische Fähigkeit gegenüber seneszenten hMSCs verschiedener Herkunft. Unter Verwendung biologischer und bioinformatischer Ansätze vergleichen wir die Seneszenzentwicklung in „Herzglykosid-sensitiven“ A549 und „-insensitiven“ hMSCs. Es wurde festgestellt, dass das Fehlen einer Analyse durch den effektiven Kaliumimport und eine erhöhte Apoptoseresistenz in seneszenten hMSCs vermittelt wird. Eine Schwächung der „antiapoptotischen Abwehr“ prädisponiert hMSCs für eine Analyse. Wir haben gezeigt, dass die Apoptoseresistenz, die zuvor als gemeinsames Merkmal der Seneszenz erkannt wurde, tatsächlich kein allgemeines Merkmal von seneszenten Zellen ist. Darüber hinaus sind nur seneszente Apoptose-Prolin-Zellen empfindlich gegenüber Herzglykosid-induzierter Analyse. Daher können wir spekulieren, dass die Wirksamkeit der Analyse davon abhängen könnte, ob seneszente Zellen im Vergleich zu ihren proliferierenden Gegenstücken tatsächlich apoptoseresistent werden.

SchlüsselwörterStammzellen. Senolyse·Seneszenz·Apoptose·Stressresistenz

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Einführung

Heutzutage wird zelluläre Seneszenz als häufige Reaktion fast aller Arten von proliferierenden Zellen, einschließlich Krebs- und Stammzellen, sowie einiger postmitotischer Zellen auf eine Vielzahl von Stressreizen angesehen [1-3]. Je nach Herkunft des auslösenden Faktors können folgende Arten der zellulären Seneszenz unterschieden werden: replikativ (aufgrund der DNA-Schädigung an den verkürzten Telomerenden), onkogeninduziert (als Reaktion auf eine fehlerhafte Aktivierung onkogener Signalwege), stressinduziert ( vermittelt durch DNA-Schäden, die durch oxidativen Stress, Hitzeschock, UV- und Y-Strahlung usw. verursacht werden) und Chemotherapie-induziert (in Krebszellen als Reaktion auf Chemotherapeutika aktiviert) [4-7]. Es gibt Heterogenität in Markern, die von seneszenten Zellen exprimiert werden, abhängig sowohl vom Zelltyp als auch von einem Angriff, der verwendet wird, um die Seneszenz zu induzieren. Es gibt jedoch einige gemeinsame Merkmale, die für die meisten Arten von seneszenten Zellen typisch sind. Das wesentliche Merkmal der Seneszenz für jede Art von sich teilenden Zellen ist der irreversible Proliferationsverlust [8].cistanche tubulosa-ExtraktDie Irreversibilität des Zellzyklusarrests wird durch die Cyclin-abhängigen Kinase (CDK)-Inhibitoren pl6 und p21 kontrolliert und oft durch das Tumorsuppressorprotein p53 reguliert [8,9]. Die anderen wichtigen Merkmale seneszenter Zellen sind die Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort; Zellhypertrophie, die häufig als Folge einer beeinträchtigten ribosomalen Biogenese und Proteinsynthese entsteht; Störung des lysosomalen Abbaus und Funktionsstörung der übrigen Abbausysteme; erhöhte Aktivität des spezifischen lysosomalen Enzyms Seneszenz-assoziierte - -Galactosidase; verschiedene mitochondriale Veränderungen; Erwerb des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP), bestehend aus entzündungsfördernden Faktoren, matrixabbauenden Enzymen, reaktiven Sauerstoffspezies usw.; epigenetische und Chromatinlandschaftsveränderungen, einschließlich der Bildung von seneszenzassoziierten heterochromatischen Foci und seneszenzassoziierter Ausdehnung von Satelliten [8-10]. die Ursprungszellen.

Cistanche kann Anti-Aging

Es ist nun klar, dass seneszente Zellen die umgebende Mikroumgebung verändern können, die sowohl benachbarte Zellen als auch zelluläre Nischen beeinflusst, was zu Gewebefehlfunktionen führen kann und daher mit dem Fortschreiten des Alterns und altersbedingten Krankheiten zusammenhängen kann [11,12]. Vor diesem Hintergrund richtet sich heute mehr Aufmerksamkeit auf die Strategien zum gezielten „Abtöten“ von seneszenten Zellen[13-15]. Zu diesem Zweck entwickelt sich aktiv eine neue Klasse von Arzneimitteln, die als Senolytika bezeichnet werden. Senolytika zielen auf Signalwege ab, die zur Resistenz seneszenter Zellen gegen Apoptose beitragen, wodurch die Apoptose bevorzugt in seneszenten Zellen induziert wird[16]. Die Liste der Senolytika wird ständig mit neuen Wirkstoffen ergänzt. Die bekanntesten Verbindungen mit der angegebenen senolytischen Aktivität sind Navitoclax (Inhibitor der Bcl-2-Familie), eine Kombination aus Dasatinib (einem Inhibitor mehrerer Tyrosinkinasen) und Quercetin (einem natürlichen Flavonol), Hsp90-Inhibitoren, MDM2-Inhibitoren, FOXO{ {8}}p53 interferierendes Peptid, ein Proteinabbauer der BET-Familie, uPAR-spezifisches CAR-T, galactokonjugiertes Navitoclax und verschiedene senolytische Naturstoffe[16-24]. Kürzlich identifizierten zwei unabhängige Forschungsgruppen unter Verwendung von Hochdurchsatz-Medikamentenscreening Herzglykoside, insbesondere Ouabain, Digoxin und Bufalin, als Breitspektrum-Senolytika [25,26].cistanche tubulosa bewertungenErwähnenswert ist, dass fast alle deklarierten Senolytika Einschränkungen aufweisen, wie z. B. unerwünschte Nebenwirkungen oder Unwirksamkeit gegenüber einigen Zelltypen. Mesenchymale Stammzellen (MSCs), die praktisch in allen postnatalen Organen/Geweben vorkommen, zeichnen sich durch die Fähigkeit zur Selbsterneuerung (symmetrische Teilung) und zur Differenzierung aus und tragen so zur Erhaltung und Regeneration des vorhandenen Gewebes bei [27]. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften, zusammen mit den starken entzündungshemmenden und immunsuppressiven Funktionen, werden MSCs in großem Umfang in der Zellersatztherapie zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt, darunter Diabetes mellitus, Multiple Sklerose, Myokardinfarkt und so weiter [28]. Ähnlich wie ihre differenzierten Nachkommen und andere unipotente Zellen sind MSCs jedoch in der Lage, entweder replikativ oder vorzeitig als Reaktion auf die Aktivierung von Onkogenen und Stressreize zu altern [29, 30]. Die Alterung von MSCs hat viele unerwünschte Folgen, darunter die Erschöpfung des Stammzellpools, reduzierte Gewebeerhaltung und -regeneration, beeinträchtigte Differenzierungskapazität, SASP-vermittelte Seneszenzausbreitung, reduzierte angiogene Eigenschaften, Modifikation der Stammzellnische [29,31-33]. Unter Berücksichtigung der biologischen Bedeutung der ordnungsgemäßen Funktion der MSCs könnten seneszente MSCs als das entscheidende Ziel für die Analyse angesehen werden. Im Einklang mit diesem Vorschlag wurden im vergangenen Jahr eine Reihe von Übersichtsarbeiten veröffentlicht, die mögliche vorteilhafte Ergebnisse der Entfernung alternder MSC hervorheben [29, 31, 34, 35]. Dennoch gibt es nur wenige experimentelle Daten zu diesem Thema [36-40].

In der vorliegenden Studie zeigen wir zum ersten Mal, dass Herzglykoside, nämlich Ouabain und Bufalin, keine hämolytische Aktivität gegenüber humanen MSCs (hMSCs) zeigen, die aus dem Endometrium (END-MSCs), Fettgewebe (AD-MSCs) stammen Zahnpulpa (DP-MSCs) und Warton-Gelee (WJ-MSCs). Darüber hinaus bestätigen wir, dass beide Herzglykoside in der Lage sind, Apoptose bevorzugt in senes-cent A549 und SK-HEP-1 zu induzieren, wie zuvor beschrieben in den Pilotstudien [25,26]. Durch die Bewertung von Veränderungen in der ionischen Homöostase, die durch die Nat/K plus -ATPase-Blockierung und die Expressionsniveaus der verwandten Gene verursacht werden, zeigen wir, dass das Fehlen einer Ouabain-induzierten Analyse durch die erhöhte Wirksamkeit des kompensatorischen K plus-Imports in seneszenten END- vermittelt werden könnte. MSCs im Vergleich zu alternden A549. Darüber hinaus zeigen wir mithilfe fortschrittlicher Bioinformatik, dass die Seneszenz von END-MSCs, die gegen Ouabain-induzierte Analyse resistent sind, mit dem Erwerb eines Apoptose-resistenten Phänotyps einhergeht, während dies bei der Seneszenz von Ouabain-sensitivem A549 nicht der Fall ist. Wichtig ist, dass die Blockierung der Aktivität des antiapoptotischen Proteins MCL-1 vor der Herzglykosidbehandlung zur Analyse von Apoptose-resistenten seneszenten END-MSCs führte. Daher liefern wir klare Beweise dafür, dass Apoptose-Resistenz kein allgemeines Merkmal seneszenter Zellen ist. Basierend auf den erhaltenen Daten schlussfolgern wir, dass die Wirksamkeit analytischer Ansätze davon abhängen könnte, ob Zellen während der Seneszenzentwicklung tatsächlich apoptoseresistent wurden.

Materialen und Methoden

Zellen

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 und SK-Help wurden von der Russian Collection of Cell Cultures (Institut für Zytologie, Sankt-Petersburg, Russland) bezogen. A549- und SK-Help-Linien wurden durch Karyologie, Tumorigenität, Isoenzymtests (LDH und G6PD) und STR-Analyse authentifiziert. Die Zellen wurden in Vollmedium DMEM F12 (Gibco BRL), ergänzt mit 10 Prozent FBS (HyClone), 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (Gibco BRL) und 1 Prozent Glutamin (Gibco BRL), kultiviert. Alle Zellen wurden routinemäßig auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Seneszenz- und stressauslösende Bedingungen

Für durch oxidativen Stress induzierte Seneszenz wurden END-MSCs/WJ-MSCs mit 200 uM/100 uM HO(Sigma) für 1 h behandelt. Für Doxorubicin-induzierte Seneszenz wurden DP-MSCs/A549 mit 1 μM Doxorubicin (Veropharm) für 3 Tage behandelt. In jedem Fall wurden die Zellen frühestens 14 Tage nach der Behandlung als seneszent angesehen. Für die replikative Seneszenz wurden AD-MSCs vor der 4. Passage als Kontrollzellen und nach der 10. Passage als seneszente Zellen identifiziert. Für Etoposid-induzierte Seneszenz wurden A549/END-MSCs/SK-Help mit 2 uM/5 uM/3 uM Etoposid (Veropharm) für 3 Tage behandelt und frühestens 7 Tage nach der Seneszenzinduktion analysiert. In diesem Fall stimmte das Behandlungsdesign vollständig mit dem in der Studie beschriebenen überein, aus der die RNA-seq-Daten stammten (Wang et al., 2017). Zwei Herzglykoside, die wir als senolytische Verbindungen angewendet haben – Ouabain (Sigma) und Bufalin (Calbiochem).

Um die Stressresistenz zwischen Kontroll- und seneszenten END-MSCs oder A549 zu vergleichen, wurden Zellen entweder mit 400/800 uM HO2 (Sigma) für 1 h oder mit 0,3/1 uM Staurosporin (Sigma) behandelt. Die Zelllebensfähigkeit wurde 48 h nach Stressinduktion analysiert.

Um die MCL-1-Aktivität zu blockieren, wurden END-MSCs mit 10 uM A-1210477 (Sigma) für 3 Tage vorbehandelt.

Durchflusszytometrische Analyse

Messungen der Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Zellgröße, Autofluoreszenz, Apoptoseraten, Caspase 3/7-Spaltung, mitochondriales Membranpotential und Membrandepolarisation wurden durch Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde unter Verwendung des CytoFLEX (Beckman Coulter) durchgeführt und die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung der CytExpert-Softwareversion 2 analysiert.0. Anhaftende Zellen wurden zweimal mit PBS gespült und durch Trypsinisierung geerntet. Abgelöste Zellen wurden gepoolt und in frischem Medium resuspendiert und dann gezählt und auf Autofluoreszenz analysiert. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erreichen, wurden jeder Probe unmittelbar vor der Analyse 50 ug/ml Propidiumiodid (Life Technologies) zugesetzt. Die Zellgröße wurde durch zytometrische Vorwärtslichtstreuung von PI-negativen Zellen bewertet. Die Apoptose-Induktion wurde unter Verwendung von Annexin-V-APC (Invitrogen) und DAPI (Sigma) Co-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers verifiziert. Die Caspase-Aktivität wurde mit dem CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) gemäß dem Herstellerprotokoll bewertet. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials wurde unter Verwendung des ratiometrischen Farbstoffs JC-1 (Invitrogen) bewertet. Das Färbeverfahren wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Für die Membrandepolarisation verwendeten wir eine DiBAC4(3)-Fluoreszenzsonde (Invitrogen).

Seneszenz-assoziierte Galactosidase-Färbung

Seneszenz-assoziierte -Galactosidase (SA- -Gal)-Färbung wurde unter Verwendung eines Seneszenz-Galactosidase-Färbekits (Cell Signaling Technology) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die quantitative Analyse von Bildern wurde mit der Anwendung des MatLab-Pakets gemäß dem zuvor beschriebenen Algorithmus erstellt [41]. Für jeden experimentellen Punkt wurden nicht weniger als 50 zufällig ausgewählte Zellen analysiert.

Western-Blotting

Western Blotting wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [41]. SDS-PAGE-Elektrophorese, Übertragung auf eine Nitrozellulosemembran und Immunoblotting mit ECL-Nachweis (Thermo Scientific) wurden gemäß Standardprotokollen des Herstellers (Bio-Rad Laboratories) durchgeführt. Es wurden Antikörper gegen die folgenden Proteine ​​verwendet: Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)(Klon 14C10), Phospho-p53(Ser15), p21(Klon 12D1), Phospho-Rb (Ser807/811) B. HMGB1 (Klon D3E5), sowie mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG. Verdünnungsraten waren 1:1000 für alle primären Antikörper und 1:7000 für sekundäre. Alle Antikörper wurden von Cell Signaling bezogen. Das Scion Image 4.0 (Scion Corporation) wurde verwendet, um die vom Hintergrund subtrahierte Dichte der Banden in allen Gelen und Blots auszuwählen und zu bestimmen.

Transkriptomische Analyse

Proben aus den folgenden drei Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq-Datensätzen wurden in der Analyse verwendet: GSE102639 (GSM2742113-GSM2742114 und GSM2742121-GSM2742122 für Kontroll- und seneszente A549-Zellen entsprechend); GSE122081 (GSM3454482-GSM3454484 und GSM3454500-GSM3454502 entsprechend für Kontroll- und seneszente IMR-90-Zellen); und unser Datensatz GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 und GSM4877907-GSM4877910 für Kontroll- bzw. alternde END-MSCs). Die Daten für alle Datensätze wurden auf die gleiche Weise verarbeitet.

Rohlesedaten wurden einer Qualitätsfilterung und Adaptertrimmung über FilterByTile- und BBDuk-Skripte aus dem BBtools-Paket (Version 38.75) unter Verwendung der Standardoptionen unterzogen. Die verbleibenden Reads wurden zusätzlich gefiltert und unter Verwendung eines Trimester-Skripts aus dem FastqPuri-Paket (Version 1.0.7) getrimmt.cistanche UKDer Trimmvorgang wurde für beide Enden von Reads angewendet, wenn sie Ns enthielten oder ihre Qualität unter der auf 27 gesetzten Qualitätsschwelle lag, alle Reads, die kürzer als 25 Basen waren, wurden verworfen. Die Qualitätskontrolle des Trimmens wurde mit der FastQC-Software (Version 0.11.7) und FastqPuri-Skripten durchgeführt. Die Lesevorgänge, die alle Operationen bestanden haben, umfassen nicht weniger als 90 Prozent der ursprünglichen Daten.

Transkripthäufigkeiten wurden unter Verwendung des Salmon Lightweight Mapping (Version 1.1.0) geschätzt, das im selektiven Ausrichtungsmodus ausgeführt wurde. Die Liste der Köder wurde basierend auf dem menschlichen Gencode-Referenzgenom GRCh38.p13 (Version 33) erstellt und weiter verwendet, um den Index auf verketteten Transkriptom- und Genom-Gencode-Referenzdateien (Version 33) unter Verwendung einer kmer-Größe von 21 aufzubauen. Mapping-Operationen wurden durchgeführt mit zusätzlichen Flags – – numBootstraps 30 – – Pailletten – – gcBias – – Zuordnungen validieren. Die resultierenden Abbildungsraten lagen bei rund 70 Prozent.

Die weitere Datenverarbeitung wurde unter Verwendung von R Version 3.6.3 mit der Tidyverse-Sammlung von Paketen (Version 1.3.0) durchgeführt. Geschätzte Genzahlen, Metadaten und Transkriptbereiche wurden in R geladen und mit tximeta (Version 1.4.5) auf Genebene zusammengefasst. Die resultierende Zählungsmatrix wurde gefiltert, um Zeilen mit mindestens 5 geschätzten Zählungen über alle Proben zu enthalten, die resultierende Matrix enthielt 20.400 Gene.

Für die PCA- und Heatmap-Darstellung wurden die Lesezahlen mithilfe der Protokolltransformation aus dem DESeq2-Paket (Version 1.26.0) normalisiert.cistanche wirkungHeatmaps wurden unter Verwendung von Paketen für Genfilter (Version 1.38.0) und Heatmap (Version 1.0.12)R erstellt. Die Validierung von Teilungsproben nach Seneszenzvariable wurde durch Unterteilung normalisierter Read-Zählungen nach Genen durchgeführt, die mit dem Gene-Ontology-Begriff "Zelluläre Seneszenz" (GO 0090398) verwandt sind. Die Differenzialexpressionsanalyse und die Schätzung der Log-Fold-Änderungen wurden unter Verwendung von DESeq2 für die letzte Variable in der Designformel berechnet, die den Alterungsstatus der Zellen, die Ouabain-Behandlungsreaktion und die Wechselwirkung der angegebenen Faktoren kontrolliert. Um das Testen des Differentialausdrucks zu verstärken, wurde eine Log-Fold-Change-Korrektur mit einer Kombination aus einem adaptiven Schrumpfungsschätzer aus dem Palm-Paket (Version 1.8.0) und der Angabe eines zusätzlichen Log-Fold-Change-Schwellenwerts von 0,667 angewendet. Die resultierenden geschrumpften Schätzungen wurden weiter für das Gen-Ranking und die Ausführung der Gene Set Enrichment Analysis unter Verwendung von Clusterprofil (Version 3.14.3) und Fuse (Version 1.12.0)R-Paketen mit p-Werten verwendet, die für Mehrfachvergleiche gemäß der Benjamin-Hochberg-Methode angepasst wurden. Affymetrix-Microarray-Proben für Kontroll- und seneszente AD-MSCs wurden aus der GEO-Datenbank (GSE66236) bezogen und mit der Phantasus-Webanwendung mit log2- und Quantilzahl-Normalisierung verarbeitet. Die Genset-Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung eines Fuse (Version 1.12.0)R-Pakets durchgeführt.

RNA-Extraktion, reverse Transkription und Echtzeit-PCR

RNA-Extraktion, reverse Transkription und Echtzeit-PCR wurden wie in unserer vorherigen Studie beschrieben durchgeführt [32]. Reagenzien für die RNA-Extraktion (ExtractRNA-Reagenz), reverse Transkription (MMLV RT-Kit) und Echtzeit-PCR (HS SYBR-Kit) wurden von Evrogen bezogen. Die Genexpressionsniveaus wurden unter Verwendung des Echtzeit-PCR BioRad CFX-96-Verstärkers (BioRad) mit dem folgenden Laufprogramm für alle untersuchten Gene bewertet: 40 Schmelzzyklen für 10 s bei 95 Grad, Annealing für 15 s bei 57,5 ​​Grad und Synthese für 15 s bei 72 Grad . Die Schmelzkurvenanalyse wurde angewendet, um die Spezifität der Reaktionen zu kontrollieren. Die folgende Analyse der erhaltenen Daten wurde unter Verwendung der Bio-Rad CFX Manager-Software (BioRad) mit dem Standard-2deltaCt-Quantifizierungsverfahren unter Verwendung der GAPDH-Expression als Referenz durchgeführt. Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

statistische Analyse

Um den Unterschied zwischen den beiden Gruppen signifikant zu machen, wurde der t-Test nach Student oder der t-Test nach Welch angewendet. Für mehrere Vergleiche zwischen Gruppen wurde ANOVA mit Tukey's HSD verwendet. Sofern nicht anders angegeben, sind alle quantitativen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, und die Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede wie folgt hin: ns, nicht signifikant,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Ergebnisse

H2O2-behandelte END-MSCs treten in die vorzeitige Seneszenz ein

In der vorliegenden Studie verwendeten wir humane mesenchymale Stammzellen, die aus desquamiertem Endometrium (END-MSCs) isoliert wurden und die Mindestkriterien erfüllen, die von der ISCT zur Definition von hMSCs vorgeschlagen wurden [41]. Zuvor haben wir ein zuverlässiges experimentelles Modell entwickelt, um verschiedene Aspekte der vorzeitigen Seneszenz von END-MSCs zu untersuchen [30]. Wir haben nämlich gezeigt, dass END-MSCs, die subletalem oxidativem Stress ausgesetzt waren, allmählich alle typischen Merkmale seneszenter Zellen annahmen, einschließlich anhaltender DNA-Schädigungsherde und aktiver DNA-Schadensantwort, irreversibler Zellzyklusarrest, vermittelt durch das klassische p53/p21/Rb Signalweg, Proliferationsverlust, Zellhypertrophie, Auftreten von SA- -Gal-Färbung und Entwicklung eines mit Seneszenz assoziierten sekretorischen Phänotyps [30, 32, 42]. Hier haben wir das entworfene Modell angewendet, um die senolytische Wirkung von Ouabain zu untersuchen und die zugrunde liegenden intrazellulären Veränderungen in der Ionenhomöostase aufzudecken. Zunächst bestätigten wir durch Abschätzung der häufigsten Parameter, dass eine Einzeldosis (1 h, 200 μM) HO-Behandlung ausreichte, um die Seneszenz in END-MSCs zu induzieren. Wichtig ist, dass gestresste END-MSCs zwei Wochen nach dem oxidativen Stress als seneszent galten; daher wurden alle Alterungsmarker frühestens 14 Tage nach der H-Oz-Behandlung bewertet. Tatsächlich führte die H-Oz-Behandlung von END-MSCs zu einem Proliferationsblock, einer Zellhypertrophie, wie durch die erhöhte Zellgröße angezeigt, einer Akkumulation des Lipofuscins, nachgewiesen durch die Erhöhung der Autofluoreszenz, dem Auftreten von SA- -Gal, einer Aktivierung der Der p21/Rb-Weg und der Verlust von HMGB1 unterstützen zusammen die Seneszenzbildung unter den gewählten experimentellen Bedingungen (Abb. ac, e, f).

Es wird angenommen, dass die schädlichsten Wirkungen seneszenter Zellen auf Gewebe- und Organismusebene die Folge ihrer verlängerten Vitalität sind. In Übereinstimmung mit diesem Punkt behielten mit HO? behandelte END-MSCs eine hohe Lebensfähigkeit selbst in den späten Stadien der Seneszenzentwicklung (die Lebensfähigkeit von seneszenten END-MSCs wurde 17 Tage (14 Tage – 3 Tage) nach dem anfänglichen oxidativen Stress bewertet) (Abb. 1d ). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die subletale HO2--Behandlung von END-MSCs das geeignete Modell der vorzeitigen Seneszenz ist und relevant ist, um die Wirkungen senolytischer Verbindungen auf END-MSCs zu untersuchen.

Herzglykosid Ouabain hat in einem weiten Konzentrationsbereich keine senolytische Aktivität gegenüber seneszenten END-MSCs

Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Herzglykoside, einschließlich Ouabain, Digoxin und Bufalin, eine Familie von Verbindungen mit hämolytischer Aktivität darstellen [25,26]. Auch wenn Herzglykoside heute als Breitspektrum-Senolytika gelten, fehlen Daten zu ihrer Wirkung auf seneszente hMSC. Daher haben wir hier getestet, ob Ouabain das Potenzial hat, bei seneszenten END-MSCs selektiv den Tod zu induzieren. Dazu bewerteten wir die Lebensfähigkeit von Kontroll- und seneszenten END-MSCs nach Behandlung mit Ouabain in einem weiten Konzentrationsbereich (von 10-' bis 10~ M). Interessanterweise führte keine der angewendeten Konzentrationen am ersten Tag nach der Ouabain-Anwendung zu einer merklichen Abnahme der Lebensfähigkeit sowohl der Kontroll- als auch der seneszenten Zellen (Abb. 2 und ergänzende Abb. S1).

Am dritten Tag nach der Ouabain-Behandlung zeigten wir jedoch einen signifikanten dosisabhängigen Rückgang der Lebensfähigkeit von Kontroll-END-MSCs (Abb. 2a und ergänzende Abb. S1). Unerwarteterweise erwiesen sich seneszente Zellen bei jeder getesteten Konzentration als resistenter gegenüber Ouabain. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis führte 10-M Ouabain zu einem anfälligeren apoptotischen Tod in Kontrollzellen (20,75 Prozent An plus /PI und 36,47 Prozent An plus /PI plus) im Vergleich zu seneszenten Zellen (15,01 Prozent An＋/PI -und 12,15 Prozent An plus /PI plus )(Abb.2b). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass Ouabain im Zusammenhang mit seneszenten END-MSCs keine senolytische Aktivität aufweist.

Um mögliche Wirkungen im Zusammenhang mit der Variabilität von Seneszenz-induzierenden Stimuli auf die senolytische Wirkung von Ouabain auszuschließen, führten wir eine zusätzliche Reihe von Experimenten durch. Wir behandelten nämlich END-MSCs mit Etoposid anstelle von oxidativem Stress, um eine vorzeitige Seneszenz zu induzieren.Zitrus-BioflavonoideMit Etoposid behandelte END-MSCs zeigten alle für seneszente Zellen typischen Merkmale (Abb. 3a-e).

Wichtig ist, dass Ouabain keine hämolytische Wirkung auf mit Etoposid behandelte seneszente END-MSCs hatte (Abb. 3f und ergänzende Abb. S2). Diese Daten liefern eine zusätzliche Bestätigung für die obigen Ergebnisse und einen Beweis dafür, dass das Fehlen einer Ouabain-induzierten Analyse nicht die Folge des konkreten Seneszenzauslösers ist, der verwendet wird, um die Seneszenz zu induzieren.

Abb. 1 Validierung des durch oxidativen Stress induzierten vorzeitigen Alterungsmodells von END-MSCs. Seneszente END-MSCs a lockere Proliferation, b unterliegen einer Hypertrophie, c erwerben eine erhöhte Autofluoreszenz, behalten eine hohe Zelllebensfähigkeit bei, d und e zeigen SA- -Gal-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen. f Phosphorylierungsniveaus von p53 und Rb und Expressionsniveaus von p21 und HMGBI-Proteinen in Kontroll- und seneszenten END-Ouabain hat keine hämolytische Wirkung auf humane mesenchymale Stammzellen verschiedener Herkunft Um unsere Beobachtungen bezüglich des Fehlens einer Ouabain-induzierten Analyse in END-MSCs zu erweitern analysierten wir die Wirkung von Ouabain auf hMSCs, die aus anderen Quellen isoliert wurden, darunter Fettgewebe, Zahnpulpa und Wharton-Gelee. Um unsere Daten zusätzlich zu stärken, haben wir verschiedene Modelle der Seneszenz angewendet – replikative Seneszenz für AD-MSCs, Doxorubicin-induzierte Seneszenz für DP-MSCs und oxidative Stress-induzierte Seneszenz für WJ-MSCs (Abb. 4a-f).

Wie in Abb. 4g gezeigt, unterschieden sich verschiedene Arten von hMSCs in der Lebensfähigkeit bei der Behandlung mit Ouabain, zum Beispiel waren sowohl Kontroll- als auch alternde DP-MSCs viel resistenter gegen Ouabain-Wirkung als WJ-MSCs (Abb. 4g und ergänzende Abb. S3b, c). Dennoch war Ouabain nicht in der Lage, bei beiden Arten von seneszenten hMSCs eine Senolyse zu induzieren (Abb. 4g und ergänzende Abb. S3). Zusammen zeigen die erhaltenen Daten, dass das Fehlen einer Ouabain-induzierten Analyse ein gemeinsames Merkmal für verschiedene Arten von hMSCs ist. MSCs. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Für mehrere Gruppenvergleiche bei a und d wurde eine einfache ANOVA angewendet, n=3, ns nicht signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet

Herzglykosid Bufalin kann seneszente END-MSCS nicht abtöten

Um das Fehlen einer senolytischen Wirkung von Herzglykosiden gegenüber hMSCs zu verifizieren, haben wir Bufalin angewendet, eine andere Verbindung mit der angegebenen senolytischen Aktivität, die zur Familie der Herzglykoside gehört [25]. Bufalin hatte in einem weiten Konzentrationsbereich (von 10-7 bis 10-5 M) fast keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Kontroll- und H2O2--behandelten seneszenten END-MSCs (Abb. 5a und Supplemental Abb. S4a).

Ähnlich wie bei der Ouabain-Behandlung war das Fehlen einer Analyse auf Bufalin unabhängig von Seneszenz-induzierenden Stimuli, da die Lebensfähigkeit von ESCs, die entweder als Reaktion auf oxidativen Stress oder auf Etoposid alterten, unbeeinflusst war (Abb. 5a, b, ergänzende Abb S4a, b). Die oben beschriebenen Ergebnisse bestätigen, dass sich Herzglykoside für die gezielte Todesinduktion bei seneszenten END-MSCs als unwirksam erwiesen haben. MSCs. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Für mehrere Gruppenvergleiche bei a und d wurde eine einfache ANOVA angewendet, n=3, ns nicht signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Herzglykosid Bufalin kann seneszente END-MSCS nicht abtöten

Um das Fehlen einer senolytischen Wirkung von Herzglykosiden gegenüber hMSCs zu verifizieren, haben wir Bufalin angewendet, eine andere Verbindung mit der angegebenen senolytischen Aktivität, die zur Familie der Herzglykoside gehört [25]. Bufalin hatte in einem weiten Konzentrationsbereich (von 10-7 bis 10-5 M) fast keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Kontroll- und H2O2--behandelten seneszenten END-MSCs (Abb. 5a und Supplemental Abb. S4a).

Ähnlich wie bei der Ouabain-Behandlung war das Fehlen einer Analyse auf Bufalin unabhängig von Seneszenz-induzierenden Stimuli, da die Lebensfähigkeit von ESCs, die entweder als Reaktion auf oxidativen Stress oder auf Etoposid alterten, unbeeinflusst war (Abb. 5a, b, ergänzende Abb S4a, b). Die oben beschriebenen Ergebnisse bestätigen, dass sich Herzglykoside für die gezielte Todesinduktion bei seneszenten END-MSCs als unwirksam erwiesen haben.

Abb. 2 Ouabain hat in einem weiten Konzentrationsbereich keine hämolytische Aktivität gegenüber HO2--behandelten seneszenten END-MSCs. Relative Zelllebensfähigkeit (Prozent) von Kontroll- und seneszenten END-MSCs in 3 Tagen nach Behandlung mit 1077,10~6,10-5 M Ouabain. b Apoptose-Induktion in END-MSCs nach 10-6 M Ouabain, bestimmt durch Annexin V/DAPI-Doppelfärbung. n=3 unabhängige Experimente. Alle Daten entsprechen dem Mittelwert ± SD. Die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test nach Welch bewertet:ns nicht signifikant,***S<>

Die beiden Herzglykoside Ouabain und Bufalin sind in der Lage, in seneszenten A549- und SK-Hep1-Zellen selektiv den Zelltod zu induzieren

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass unsere Ergebnisse nicht mit den kürzlich veröffentlichten Beweisen bezüglich der senolytischen Breitbandwirkung von Herzglykosiden übereinstimmen, entschieden wir uns, diese Wirkung unter Verwendung des in den relevanten Studien beschriebenen Zellmodells zu reproduzieren [25,26]. Daher führten wir eine Reihe von Experimenten unter Verwendung von Kontroll- und seneszenten A549-Lungenkarzinomzellen durch. Seneszenz in A549-Zellen wurde durch Etoposid-Behandlung induziert. Die Etoposid-induzierte Seneszenz von A549-Zellen ist ein häufig verwendetes und damit gut charakterisiertes Modell der therapieinduzierten Seneszenz [4]. Außerdem wurde gezeigt, dass Ouabain Etoposid-behandelte seneszente A549-Zellen selektiv abtötet[25]. Um die Seneszenz in A549 nachzuweisen, untersuchten wir die Proliferationsrate, die Zellgröße, die Akkumulation von Lipo-Fine, die SA- -Gal-Färbung und den Aktivierungsstatus des p53/p21/Rb-Wegs und das Expressionsniveau von HMGB1 (Fig. 6a-e).

Um die hämolytische Aktivität von Ouabain gegenüber seneszenten Krebszellen zu verifizieren, schätzten wir zunächst die dosisabhängige Zelllebensfähigkeit. In Übereinstimmung mit unseren oben beschriebenen Ergebnissen konnten wir innerhalb von 24 Stunden nach der Ouabain-Anwendung keinen signifikanten Rückgang der Anzahl lebensfähiger Kontroll- oder seneszenter A549-Zellen feststellen (ergänzende Abb. S5a). 3 Tage nach der Behandlung verringerte Ouabain jedoch die Lebensfähigkeit alternder A549-Zellen dosisabhängig signifikant, während die Anzahl der A549-Kontrollzellen in viel geringerem Maße abnahm (Abb. 7a und ergänzende Abb. S5a). Ungefähr 90 % der Kontrollzellen behielten nämlich ihre Lebensfähigkeit bei 10- Mouabain im Vergleich zu 50 % der seneszenten A549-Zellen, die mit der gleichen Dosis behandelt wurden (Fig. 7a). Darüber hinaus waren alternde A549-Zellen anfälliger für den durch Bufalin induzierten Zelltod als ihre Kontrollgegenstücke (Abb. 7b) (Abb. 5b und ergänzende Abb. S5b).

Den veröffentlichten Daten zufolge löste Ouabain Caspase-3--abhängige Apoptose in seneszenten A549-Zellen aus [26]. Tatsächlich zeigten wir einen signifikanten Anstieg der doppelt positiven und/oder PI-Fraktion in seneszenten Krebszellen, die mit 10-6 M Ouabain behandelt wurden (Abb. 7c). Darüber hinaus beobachteten wir unter Verwendung eines Fluoreszenzassays die Aktivierung von Caspase -3 in Ouabain-behandelten seneszenten A549-Zellen (Fig. 7d). Zusammengenommen stimmen diese Ergebnisse vollständig mit den von anderen Autoren beschriebenen Daten überein und bestätigen die hämolytische Aktivität von Ouabain gegenüber A549.

Außerdem verwendeten wir Doxorubicin anstelle von Etoposid, um bei A549 eine Seneszenz zu verursachen (Abb. 8a-e). Wie erwartet zeigten sowohl der mit Doxorubicin behandelte seneszente A549 als auch der mit Etoposid behandelte eine höhere Empfindlichkeit sowohl gegenüber Ouabain als auch gegenüber Bufalin im Vergleich zu ihren Kontrollgegenstücken (Abb. 8g und ergänzende Abb. S6). Letzteres bestätigt, dass senolytische Wirkungen von Herzglykosiden unabhängig von seneszenzinduzierenden Stimuli sind. Somit wirken Herzglykoside tatsächlich senolytisch

Abb. 3 Ouabain ist nicht in der Lage, bei mit Etoposid behandelten seneszenten END-MSCs eine Senolyse zu induzieren. Validierung des episodeninduzierten Seneszenzmodells für END-MSCs: a Proliferationsfähigkeit, b Zellgröße, c Autofluoreszenzniveaus und d SA- -Gal-Aktivität, e Phosphorylierungsniveau von Rb und Expressionsniveaus von p21- und HMGBI-Proteinen. f Relative Zelllebensfähigkeit (Prozent) von Kontroll- und seneszenten Zellen nach Behandlung mit 10-6 Ouabain. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Für mehrere Gruppen wurden Vergleiche bei einer einfachen ANOVA durchgeführt,n=3, ns nicht signifikant,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Schließlich entschieden wir uns, Analyseexperimente an mit Etoposid behandelten Leberkrebszellen SK-Help zu reproduzieren, einem weiteren Zellmodell mit nachgewiesener senolytischer Wirkung von Herzglykosiden nach Guerrero et al. Studie [25] (Abb.9a-e). Mit Etoposid behandeltes alterndes SK-Help zeigte eine höhere Empfindlichkeit gegenüber beiden Wirkstoffen im Vergleich zu ihren Kontrollgegenstücken, was die hämolytische Wirkung von Herzglykosiden auf diesen Zelltyp beweist (Abb. 9f und ergänzende Abb. S7).

Zusammen belegen diese Daten, dass die Selektivität der durch Herzglykoside induzierten Hämolyse mehr von der Zellbeschaffenheit als vom konkreten Alterungsauslöser abhängt.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x