Olivenblattextrakt (OLE) beeinträchtigte den Vasopressin-induzierten Aquaporin-2-Transport durch die Aktivierung des Calcium-Sensing-Rezeptors

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Vasopressin (AVP) erhöht die Wasserdurchlässigkeit imNieren-Sammelrohr durch die Regulierung des Handels mit Aquaporin-2 (AQP2). Mehrere Störungen, darunter Bluthochdruck und unangemessene Sekretion des antidiuretischen Hormons (SIADH), sind mit Anomalien der Wasserhomöostase verbunden. Es hat sich gezeigt, dass bestimmte Phytoverbindungen der menschlichen Gesundheit zuträglich sind. Hier wurden die Wirkungen des Olivenblattextrakts (OLE) anhand von In-vitro- und In-vivo-Modellen bewertet. Konfokale Studien zeigten, dass OLE die Vasopressin-induzierte AQP2-Translokation zur Plasmamembran in MCD4-Zellen und Ratten verhindertNieren. Die Inkubation mit OLE verringert den AVP-abhängigen Anstieg des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (Pf). Um die möglichen Effektoren von OLE aufzuklären, wurde intrazelluläres Calcium untersucht. OLE erhöht das intrazelluläre Calcium durch die Aktivierung des Calcium Sensing Receptor (CaSR).NPS2143 , ein selektiver CaSR-Inhibitor, hob die hemmende Wirkung von OLE auf die AVP-abhängige Wasserdurchlässigkeit auf. In-vivo-Experimente zeigten, dass die Behandlung mit OLE die Expression der CaSR-mRNA erhöht und die AQP2-mRNA verringert, parallel zu einem Anstieg der AQP2--gerichteten miRNA-137. Zusammengenommen deuten diese Befunde darauf hin, dass OLE die Wirkung von Vasopressin durch Stimulierung des CaSR antagonisiert, was darauf hinweist, dass dieser Extrakt nützlich sein kann, um Störungen abzuschwächen, die durch abnormale CaSR-Signalgebung gekennzeichnet sind und die renale Wasserreabsorption beeinflussen.

Olivenbaumblätter werden häufig als traditionelle Heilmittel zur Heilung verschiedener Krankheiten verwendet, insbesondere in den Mittelmeerländern. Blätter werden in der menschlichen Ernährung üblicherweise als Extrakt oder Pulver zur Zubereitung von Aufgüssen oder Kräutertees verzehrt. Die Analyse der chemischen Charakterisierung ergab, dass Olivenbaumblätter mehrere bioaktive Verbindungen enthalten, die bei bestimmten Erkrankungen wie metabolischem Syndrom, Dyslipidämie und Bluthochdruck positive Wirkungen ausüben können. Es wurde festgestellt, dass zahlreiche Polyphenole wie Oleuropein, Hydroxytyrosol und Tyrosol in einem Extrakt aus grünen Olivenblättern (OLE)5 angereichert sind, und es ist bekannt, dass sie an der Prävention bestimmter Krankheiten beteiligt sind, die durch oxidativen Stress gekennzeichnet sind. Daher hat in den letzten Jahren das Interesse an der Untersuchung der potenziell vorteilhaften Wirkungen von Olivenblattextrakt unter Wissenschaftlern in verschiedenen Forschungsbereichen zugenommen. Typ Ca2 plus Kanäle. Interessanterweise wurde festgestellt, dass OLE blutdrucksenkende Wirkungen auf die genetische Hypertonie bei spontan hypertensiven Ratten (SHR) ausübt, die mit der Verbesserung der Gefäßfunktion in Verbindung stehen*. Übermäßige Wasserresorption spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von erhöhtem Blutdruck. Bei Bluthochdruckpatienten, die mit Olivenblattextrakt behandelt wurden, wurde eine signifikante Verringerung mehrerer Entzündungsfaktoren in Verbindung mit einer Senkung des Blutdrucks festgestellt. Außerdem ist eine übermäßige Wasserretention charakteristisch für mehrere Erkrankungen wie Leberzirrhose, Herzinsuffizienz und unangemessene Sekretion des antidiuretischen Hormons (SIADH). Die Homöostase des Körperwassers wird streng durch das antidiuretische Hormon Vasopressin (AVP) kontrolliert, das im dehydrierten Zustand freigesetzt wird. AVP bindet seinen verwandten V2R-Rezeptor, der an der basolateralen Membran lokalisiert istNieren-Hauptzellen, wodurch der cAMP-Signalweg aktiviert wird, der zur Translokation der Aquaporin-2(AQP2)-tragenden Vesikel aus einem intrazellulären Pool zur apikalen Plasmamembran führt, wo die Wasserrückresorption stattfindet. Auf molekularer Ebene können mehrere Faktoren den renalen Wasserhaushalt modulieren. Ein erhöhter Gehalt an luminalem Calcium reguliert den kurzfristigen Vasopressin-abhängigen AOP2-Transport durch die Aktivierung des Calcium-Sensing-Rezeptors (CaSR) herunter1,12. Andererseits induzierte die CaSR-Aktivierung in bedingt immortalisierten proximalen tubulären Epithelzellen der Niere, die aus menschlichem Urin isoliert wurden, einen signifikanten Anstieg des zytosolischen Calciums und reduzierte signifikant den Anstieg von cAMP, der durch Forskolin (FK), einen direkten Aktivator von Adenylat-Cvclase3, hervorgerufen wurde , in MCD4-Zellen des Sammelrohrs der Niere, die stabil den Wasserkanal AOP2 exprimieren, schwächte die Stimulation des CaSR den cAMP-abhängigen Anstieg der AQP2-Phosphorylierung an Serin 256 ab, der ein zentrales Ereignis in der durch Vasopressin aktivierten Signaltransduktionskaskade ist und die schließlich die Wasserdurchlässigkeit erhöhte4 ,15 Außerdem inNiereScheiben aus der inneren Medulla der Mausniere führte die Aktivierung des CaSR mit dem Calcimimetikum NPS-R568 zu einem signifikanten Anstieg der AQP2--gerichteten miRNA-137, was ein enges Zusammenspiel zwischen dem CaSR-Signalweg und AQP bestätigt{ {4}}abhängige Wasserdurchlässigkeit17. In der vorliegenden Studie wurden die Wirkungen des Olivenblattextrakts, der aus der lokalen Coratina-Sorte gewonnen wurde, auf die Vasopressin-induzierte AQP2-Funktion in MCD4-Zellen des Sammelrohrs der Niere, die AOP2 stabil exprimieren, und in dDAVP bewertet behandelte Ratten, denen der Extrakt injiziert wurde. Wir liefern Beweise dafür, dass die OLE-Behandlung der Vasopressin-Reaktion in den Nierenzellen entgegenwirkt, was teilweise ihre diuretische Wirkung erklären könnte. Interessanterweise scheint dieser Effekt mit der OLE-induzierten Aktivierung des CaSR zusammenzuhängen, einem Rezeptor, von dem bekannt ist, dass er eine negative Wechselwirkung mit dem Vasopressin-Rezeptor hat12.

Erfahren Sie mehr über die Auswirkungen von Cistanche auf die Niere

Ergebnisse

Auswirkungen von OLE auf die Vasopressin-induzierte AQP2-Funktion in MCD4-Zellen. Um die mögliche Beteiligung von OLE an der Vasopressin-abhängigen AQP2-Funktion zu untersuchen,Nieren-Sammelrohr-MCD4-Zellen, die stabil den Vasopressinrezeptor 2 (V2R) und humanes AQP2 exprimieren, wurden als experimentelles Modell verwendet18. Konfokale Studien (Fig. 1A) zeigten, dass im Vergleich zu dDAVP-behandelten Zellen, bei denen die AQP2-Färbung an der apikalen Plasmamembran lokalisiert war, die Behandlung mit OLE die durch Stimulation mit dDAVP induzierte Membranlokalisierung von AOP2 verhinderte. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen beeinträchtigte die OLE-Behandlung den dDAVP-induzierten Anstieg der zeitlichen osmotischen Reaktion (in Abb. 1B als 1/t angegeben) (OLE/dDAVP=88,70 ± 1,86 Prozent). n=292 Zellen vs. dDAVP=206.8±5,49 Prozent, n=186 Zellen;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="">Zellen vs. OLE/dDAVP=88.70±1,86 Prozent ,n=292 Zellen;p<0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Wirkungen von OLE auf die Nieren von Ratten, denen OLE injiziert wurde.

Um die Wirkungen von OLE weiter zu untersuchen, wurden In-vivo-Studien durchgeführt. Insbesondere wurde Ratten drei Tage lang einmal täglich OLE (25 0 mg/kg/Tag) injiziert. Alternativ wurden Ratten 3 Tage lang mit OLE und 30 min lang mit dDAVP behandelt. Die Auswertung von CaSR-mRNA, die aus dem Sammelrohr der Niere von Ratten isoliert und für die Echtzeit-PCR verarbeitet wurde (Abb. 6), zeigte einen signifikanten Anstieg der CaSR-mRNA in OLE(OLE=1.87±0,29, n{{ 10}} Ratten vs. CTR=1.02±0.17, n=5 Ratten; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="" the="">Niere, Western-Blotting-Analyse und konfokale Studien wurden durchgeführt (Abb. 9). Bei Ratten, denen OLE/dDAVP injiziert wurde, war die Phosphorylierung von AQP2 an Serin 256 im Vergleich zu Nierengeweben von mit dDAVP behandelten Tieren (OLE/dDAVP=0) signifikant reduziert. 77±0.16, n=5 Ratten vs. dDAVP=2.16±0.25,n=5 Ratten; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskussion

Calcium ist ein wichtiger intrazellulärer Botenstoff, der eine Fülle von Zellfunktionen moduliert2. Abnormale Kalziumsignale können zu mehreren Krankheiten führen, darunter Herzinsuffizienz, Krebs und Bluthochdruck23. Die spezifische Kontrolle der Expression und Aktivität von Proteinen, die mehrere intrazelluläre Calciumsignale steuern, hat sich bei zahlreichen Erkrankungen als erfolgreich erwiesen und ist daher attraktiv für die Arzneimittelentwicklung. Diese Studie liefert neue Einblicke in den Wirkungsmechanismus von OLE, indem sie seine Fähigkeit zeigt, die intrazelluläre Kalziumsignalisierung durch die Stimulation des CaSR zu modulieren, das an der Feinabstimmung des Vasopressin-induzierten AQP2-Transports und der Expression beteiligt ist. Unter physiologischen Bedingungen spielt AQP2 eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Homöostase des Körperwassers25. Die Stimulation der intrazellulären Maschinerie, die zur Lokalisierung von AQP2 an der apikalen Plasmamembran führt, führt zu einer abnormalen Wasserretention und daraus resultierender Hyponatriämie, wie beim Syndrom der inadäquaten Sekretion des antidiuretischen Hormons (SIADH), Leberzirrhose und dekompensierter Herzinsuffizienz. Bei einer Maus Modell von SIADH, assoziiert mit polyzystischer Nierenerkrankung 1 Haploinsuffizienz, war der basale intrazelluläre Calciumspiegel im Vergleich zu dem in den Sammelrohren von Wildtyp-Mäusen gemessenen Spiegel signifikant reduziert. Niedriges intrazelluläres Calcium regulierte die Aktivität bestimmter Enzyme einschließlich der Proteinphosphatase PP2A herunter, was zu einer Hochregulierung der AOP2-Phosphorylierung an Serin 2561 führte. Im Gegensatz dazu. Die Aktivierung des CaSR mit dem Calcimimetikum NPS-R568 erhöhte die intrazelluläre Calciumkonzentration und senkte den cAMP-Spiegel in PKD1-defizienten Zellen. Wichtig ist, dass zytosolisches Kalzium die Kalzium-hemmbare adenylierte Cyclase3 herunterregulieren kann, wodurch der intrazelluläre cAMP-Spiegel fein abgestimmt wird. In MCD4-Zellen verringerte die Stimulation des CaSR mit NPS-R568 tatsächlich AQP2-pS256 durch die Hemmung des Adenylats Cyclase4. In dieser Studie verhinderte die Behandlung mit OLE den Vasopressin-abhängigen Anstieg von cAMP und AOP2-pS256, möglicherweise sekundär zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration. Bemerkenswerterweise wirkte die Exposition gegenüber einer externen cAMP-Quelle unter Verwendung von durchlässigem 8-Br-cAMP der inhibitorischen Wirkung von OLE auf den V2R-Signalweg signifikant entgegen.

Ein erhöhter Gehalt an zytosolischem Calcium kann zu Zelltod und Apoptose führen. Ein anhaltender Anstieg des intrazellulären Calciums von 250 nM auf mehr als 600 nM förderte jedoch das neuronale Überleben4. Bei MCD4-Zellen zeigt die Behandlung mit OLE bei 0,1 mg/ml keine Wirkung eine zytotoxische Wirkung. Bei dieser Konzentration erhöhte OLE (0,1 mg/ml) leicht den intrazellulären Calciumspiegel. Die Calcium-Bildgebung zeigte, dass die akute Stimulation mit OLE einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Calciums durch die Aktivierung des CaSR verursachte, das aufgehoben wurde, wenn die Zellen mit dem selektiven CaSR-Antagonisten NPS2143 vorinkubiert wurden. In renalen proximalen Tubuluszellen eine allosterische Aktivierung des CaSR mit I-Ornithin reduzierte die ROS-Produktion und regulierte dadurch den mitochondrialen oxidativen Stress herunter, der die Zellapoptose verursachte356. Darüber hinaus zeigte unsere vorherige Studie, dass die Expression der Gain-of-Function-Varianten des CaSR die ROS-Freisetzung und die S-Glutathionylierung von AQP237 reduzierte. Die Inkubation mit OLE verringerte die ROS-Erzeugung in MCD4-Zellen35, was seine antioxidative Fähigkeit zeigt. Trotzdem ist derzeit unklar, ob OLE die AOP2-S-Glutathionylierung beeinflusst. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass OLE oder Oleuropein, der Hauptbestandteil von OLE, möglicherweise eine schützende Rolle spielt, indem es den Zelltod hemmt.39 Bei Ratten, die OLE erhielten, wurden jedoch dosisabhängige Wirkungen beschrieben. Günstige Reaktionen wurden bei Dosen von 250 und 500 mg/kg erzielt. Im Gegensatz dazu kann die Behandlung mit OLE bei höheren Konzentrationen möglicherweise aufgrund der prooxidativen Wirkung mehrerer Phytoverbindungen schädliche Wirkungen haben. In dieser Studie wurde Ratten drei Tage lang OLE in einer Dosis von 250 mg/kg injiziert, was eine Hochregulierung von CaSR zeigte. Das Expressionsniveau des CaSR wird durch bestimmte Verbindungen, die als allosterische Aktivatoren des Rezeptors wirken, erhöht. Calcimimetika verringerten in der Tat die Gefäßverkalkungen, indem sie die Biosynthese des CaSR in humanen glatten Gefäßmuskelzellen steigerten0. Bei diesem Wettbewerb kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass bestimmte Verbindungen in OLE als allosterische Modulatoren des CaSR fungieren können. Andererseits kann die Stimulation mit Vasopressin zur Freisetzung von IL-6 führen, was zur Erhöhung des Expressionsniveaus von CaSR42 beitragen kann.

In der Niere ist die Stimulation der CaSR-Signalgebung mit einer Herunterregulierung der AQP2-Expression verbunden, möglicherweise durch die miR-137-Generation. miRNAs sind entscheidende posttranskriptionelle Modulatoren. Mehrere Vasopressin-abhängige miRNAs, die auf die AQP2-Expression abzielen, wurden ebenfalls beschrieben43. Die Transfektion mit miR-32 und miR-137 reduzierte das Expressionsniveau von AOP2 in mpkCCDc14-Zellen signifikant. Interessanterweise kann OLE Entzündungssignale dämpfen und Schutzwirkungen ausüben, indem es das Expressionsniveau mehrerer miRNAs moduliert.“ Insbesondere in Glioblastoma-multiforme-Zellen förderte OLE die Expression verschiedener miRNA, einschließlich miR-13745, das an der Herunterregulierung von beteiligt ist den Akt/mTOR-Signalweg 46. Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit Oleuropein die Akt/mTOR-Signalgebung durch die Aktivierung von Calcium-induzierter CAMK und AMPK verhindert. Die Aktivierung von CaSR mit NPS-R568 aktiviert AMPK und reduziert die mTOR-Aktivität in humanen proximalen tubulären Zellen3. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen erhöht die Inkubation mit OLE das zytosolische Calcium, reguliert die PKA-Aktivität herunter und reduziert die Zystengröße in einem 3D-Zellkulturmodell48. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass OLE bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein kann, die durch eine Dysregulation der intrazellulären Calciumdynamik im Zusammenhang mit der Herunterregulierung der CaSR-Signalübertragung gekennzeichnet sind.

Olivenblattextrakt besteht aus mehreren bioaktiven Komponenten, darunter Polyphenole, Fasern und Mineralien49. Derzeit ist nicht klar, ob eine Verbindung oder eine synergetische Kombination von Phytoverbindungen in OLE bei der Modulation intrazellulärer Reaktionen von Vorteil sein kann. Der in dieser Studie verwendete Extrakt wurde als möglicher Lebensmittelzusatzstoff verwendet, und es ist daher wichtig, die physiologische Wirkung des Extrakts selbst zu definieren, wenn man bedenkt, dass mehrere Phenole, einschließlich Hydroxytyrosol, von der Niere gefiltert und im Urin wiedergefunden werden können50. Weitere Studien werden die Wirksamkeit spezifischer Komponenten liefern, die die intrazelluläre Kalziumsignalisierung durch das CaSR aktiv regulieren können. Zusammenfassend liefert diese Studie Beweise dafür, dass OLE als ein neuartiges potenzielles Adjuvans angesehen werden kann, das nützlich ist, um Störungen zu mildern, die durch eine Verringerung der CaSR-Expression sowie durch Signalisierung und Beeinflussung der renalen Wasserdurchlässigkeit gekennzeichnet sind.

Materialen und Methoden

Chemikalien und Antikörper.Alle Chemikalien und Antibiotika wurden von Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bezogen. Calcein-AM, Fura-2-AM, Zellkulturmedien, fötales Rinderserum (FBS) und Super Signal West Pico Chemilumineszenz-Substrate wurden von Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bezogen. Aquaporin{ {2}}(AQP2) wurde unter Verwendung spezifischer Antikörper (C-Schwanz-Ab) nachgewiesen, die gegen ein synthetisches Peptid erzeugt wurden, das den letzten 15 C-terminalen Aminosäuren von menschlichem AQP2 entspricht!. AQP2-pS256-Antikörper wurden freundlicherweise von Prof. Peter Deen zur Verfügung gestellt. Sekundäre Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-gekoppelte Antikörper wurden von Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bezogen. Ein an Alexa-488 gekoppelter sekundärer Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper wurde von Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) erworben.

Herstellung von phenolreichen Extrakten und chemische Charakterisierung.Die Herstellung eines phenolreichen Extrakts aus Olivenblättern wurde wie von Ranieri et al.35 beschrieben durchgeführt. Nach dem Mahlen mit einem Mixer (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA) wurde ddH2O-Wasser zugegeben (Verhältnis 1/2 0, w/y) und dann dreimal Ultraschall unterzogen (CEIA, Viciomaggio, Italien). , für jeweils 30 min bei 35 ± 5 Grad. Schließlich wurden die Extrakte durch Filterpapier filtriert, lyophilisiert und bei -20 Grad C gelagert. Die erhaltenen Extrakte wurden mit Nylonfiltern von 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) filtriert und zur chemischen Charakterisierung verwendet. Der Gesamtphenolgehalt, die antioxidative Aktivität und die Identifizierung einzelner phenolischer Verbindungen wurden gemäß Difonzo et al. durchgeführt. Die OLE zeigte einen Gehalt an Polyphenolen, bestimmt von Folin-Ciocalteu, gleich 195 mg. Gallussäureäquivalente (GAE) und eine antioxidative Aktivität, bestimmt durch ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäurediammoniumsalz), was 750 μmol TE (Trolox-Äquivalente) entspricht g!.

Zellkultur und Behandlungen.MCD4-Zellen des kortikalen Sammelrohrs der Maus, die stabil menschliches AQP2 und das chimäre V2R-Rluc exprimieren, wurden als experimentelles Modell verwendet18. Die Zellen wurden in einem 1:1-Gemisch aus Dalbec-cos-modifiziertem Eagle-Medium und F-12, ergänzt mit 5 Prozent (y/y) fötalem Rinderserum, gezüchtet. 1 Prozent (y/y)L-Glutamin und 1 Prozent Penicillin/Streptomycin, 5 μM Dexamethason, 400 ug/ml G418 (für AQP2-Resistenz) und 1 ug/ml Puromycin (für V2R-Rluc-Resistenz) , in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 Prozent CO, bei 37 Grad. MCD4-Zellen wurden unter Grundbedingungen (CTR) belassen oder langfristig mit OLE bei 0,1 mg/ml O/N, dDAVP bei 100 nM für 30 min behandelt oder mit OLE und dDAVP oder NPS2143 bei 1 μM O/N co-behandelt Alternativ wurden die Zellen 8-Br-cAMP bei 500 μM für 45 min ausgesetzt, Kurzzeitexperimente wurden mit OLE bei 1 mg/ml für 5 min und NPS2143 bei 10 μM für 15 min durchgeführt. Experimente wurden 3-5 unabhängige Male unter Verwendung von Zellen aus verschiedenen Passagen durchgeführt.

Tiermodell und Behandlungen.Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den dänischen nationalen Richtlinien für die Pflege und Handhabung von Versuchstieren und den veröffentlichten Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institute of Clinical Medicine genehmigt. Universität Aarhus gemäß den vom dänischen Justizministerium ausgestellten Lizenzen für die Verwendung von Versuchstieren (Genehmigungsnummer 2015-15-0201-00658). Die Studien wurden an erwachsenen männlichen Wistar-Ratten mit einem Ausgangsgewicht von 200-225 g durchgeführt. Die Tiere wurden mit einer Standardnagerdiät (Altromin, Lage, Deutschland) gehalten und hatten freien Zugang zu Leitungswasser. Während der Experimente wurden die Ratten in Zweiergruppen pro Käfig gehalten, mit einem 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus, einer Temperatur von 21 ± 2 Grad C und einer Luftfeuchtigkeit von 55 ± 2 Prozent.

Fünf Ratten wurden mit einer subkutanen Injektion von 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Dänemark) in 200 ul Kochsalzlösung/Tier behandelt, und fünf mit Vehikel behandelte Ratten dienten als Kontrollen. Nach 30 min wurden die Ratten getötet und die Nieren wie unten beschrieben verarbeitet.

Zellen und IMCD-Lysate.Die Zellen wurden auf {0}}-mm-Schalen gezüchtet und in einem Puffer resuspendiert, der 22 0 mM Mannit, 7 0 mM Saccharose, 0,5 M EGTA pH 8,0 enthielt ,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 in der

Anwesenheit von Proteasen (1 mM PMSF, 2 mg/ml Leupeptin und 2 mg/ml Pepstatin A) und Phosphatasen (1 0 mM NaF und 1 mM Natriumorthovanadat)-Inhibitoren. Alternativ wurden Nierenschnitte von ungefähr 0,5 mm präpariert und für 10 min in einem Puffer äquilibriert, der 118 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM Glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 und 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Die Nierenpapille wurde mit einer Schere im gleichen Puffer in Gegenwart von Proteasen (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptin und 2 mg/ml Pepstatin A) und Phosphatasen (10 mM NaF und 1 mM Natrium) zerkleinert Orthovanadat)-Inhibitoren. Nach Beschallung (60 kHz für 5 s) wurden die Lysate bei 12,000×g für 10 min zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und für Immunoblot-Studien verwendet'8.

Konfokale Mikroskopie.Konfokale Studien wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt1. Kurz gesagt wurden Zellen auf Zellkultur-PET-Einsätzen gezüchtet und wie oben beschrieben behandelt. Alternativ wurden Nierenschnitte, die von Kontroll-, OLE-, dDAVP- und OLE-mit-dDAVP-behandelten Ratten erhalten wurden, Immunfluoreszenzexperimenten wie zuvor beschrieben unterzogen. Bilder wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Schweiz) erhalten.

Gelelektrophorese und Immunoblot. Proteine ​​wurden auf 12 % fleckenfreien Polyacrylamidgelen (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) unter reduzierenden Bedingungen wie zuvor beschrieben =5,52 getrennt. Kurz gesagt, Proteinbanden wurden auf Immobilon-P-Membranen (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) übertragen und unter Verwendung von Anti-AQP2(Pre-C-tail Ab)- und Anti-AQP2-pS256-Antikörpern immungeblottet. Immunreaktive Signale wurden unter Verwendung von Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates mit Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) erhalten. Die Banden wurden unter Verwendung der Stain-Free-Technologie (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Die Densitometrieanalyse wurde unter Verwendung von ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) durchgeführt und unter Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) analysiert.

Wasserdurchlässigkeitstest.Die osmotische Wasserdurchlässigkeit wurde wie zuvor beschrieben gemessen43. Kurz gesagt, MCD4-Zellen wurden auf 40--mm-Glasdeckgläsern gezüchtet. Nach den Behandlungen wurden die Zellen mit 10 μM membrandurchlässigem Calcein-AM für 45 Minuten bei 37 Grad, 5 % CO, in DMEM/F-12 beladen. Die Deckgläser wurden in einer Perfusionskammer (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA) montiert. Die Messungen wurden unter Verwendung eines inversen TE2000-S-Mikroskops (Nikon Eclipse-Mikroskop, Tokio, Japan) durchgeführt, das für Einzelzell-Fluoreszenzmessungen ausgestattet war und Bildanalyse. Die mit Calcein-AM beladenen Proben wurden bei 490 nm angeregt. Fluoreszenzmessungen nach isosmotischen (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 1 mM CaCl, 10 mM Hepessulfonsäure, 5 mM Glucose, pH 7,4) oder hyperosmotischen (isosmotische Lösung mit 135 mM Mannit) Lösungen . wurden unter Verwendung der Metafluor-Software (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada) durchgeführt. Zeitverlaufs-Fluoreszenzdaten nach dem Perfundieren von Zellen mit iso- und hyperosmotischen Lösungen wurden aufgezeichnet. Der Zeitverlauf der Zellschrumpfung wurde als Zeitkonstante (Ki, ausgedrückt als 1/r, Sek.) gemessen, ein Parameter, der mit der Wasserdurchlässigkeit korreliert, erhalten durch Anpassen von Daten mit einer Exponentialfunktion, die unter Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego) analysiert wurde , CA, USA).

Messungen des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers.Um intrazelluläre cAMP-Änderungen zu bewerten, wurde die Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer(FRET)-Technologie angewendet. Für FRET-Experimente wurden Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das den H96-Sensor codiert, der das cAMP-bindende Konsensusmotiv von EPAC1 enthält, das wie zuvor gezeigt zwischen dem Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP) und cp173Venus-Venus eingebettet ist32.33.54. Das Plasmid, das die H96-Sonde codiert, war ein Geschenk von Dr.K. Jalink. Die Visualisierung von ECFP- und/oder EYFP-exprimierenden Zellen und der Nachweis von FRET wurde unter Verwendung eines invertierten TE2000-S-Mikroskops (Nikon Eclipse-Mikroskop, Tokio, Japan) durchgeführt. Jedes Bild wurde wie zuvor gezeigt korrigiert und analysiert55.

Intrazelluläre Calciummessungen. Intrazelluläre Calciummessungen wurden wie zuvor gezeigt durchgeführt56. Kurz gesagt, MCD4-Zellen wurden mit 4 μM Fura-2 AM für 15 min bei 37 Grad in DMEM/F-12 beladen. Ringer-Lösung wurde verwendet, um Zellen während des Experiments zu perfundieren, enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Bei Fluoreszenzmessungen wurden die Deckgläser mit überladenen Zellen in einer Perfusionskammer (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS. Butler, USA) montiert. Die Messungen wurden unter Verwendung eines inversen TE2000-S-Mikroskops (Nikon Eclipse-Mikroskop, Tokio, Japan) durchgeführt. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei 340 und 380 nm wurde aufgetragen und als Fluoreszenzänderung berechnet. Insbesondere wurde die Stimulation mit OLE (1 mg/ml) oder NPS2143 (10 μM) in demselben Zelltyp mit denen verglichen, die nach Stimulation mit einer maximalen Dosis des Calcium-vermittelten Agonisten ATP (100 μM) erhalten wurden, der als verwendet wurde interne Kontrolle (100 Prozent).

Der intrazelluläre Calciumspiegel wurde im Steady-State gemessen und wie von Grynkiewicz57 beschrieben kalibriert. OLE und NPS2143 wurden langfristig bei 0,1 mg/ml bzw. 1 uM verwendet, und jede Probe wurde durch die Zugabe von 5 μM Ionomycin in Anwesenheit von 1 mM EGTA (Rm.) gefolgt von 5 kalibriert μM Ionomycin in 5 mM CaCl, (RMA).

Echtzeit-PCR-Analyse von AQP2- und CaSR-mRNA bei Kontroll- und behandelten Ratten.Echtzeit-PCR-Experimente wurden durchgeführt, um die relative Expression von mRNA im Sammelkanal der inneren Medulla (IMCD) zu messen, die aus Kontroll- und behandelten Rattennierenpapillen isoliert wurde. Nierenscheiben von etwa 0,5 mm wurden hergestellt und für 10 min in einem Puffer äquilibriert, der 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM Glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 enthielt mM MgSO4 und 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Die Nierenpapille wurde unter einem Stereomikroskop isoliert. Proben von Kontroll- und behandelten Ratten wurden dann mit einer Schere direkt in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zerkleinert. Reverse Transkription wurde mit 2,5 ug Gesamt-RNA unter Verwendung von SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. USA), gemäß den Empfehlungen des Herstellers (25 °C für 10 min; 42 °C für 60 min; 85 °C für 5 min). Die Echtzeit-PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung des TagMan Fast Advanced Master Mix mit CaSR-, AOP2- und GAPDH-Assays (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) im StepOne-Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt ), wobei die Temperaturwechselbedingungen wie vom Hersteller angegeben eingestellt wurden (95 °C für 20 s; 40 Zyklen alternativ bei 95 °C für 1 s und 60 °C für 20 s). Die Ergebnisse wurden als 2- ausgedrückt. Werte (relative Quantifizierung) mit △ACt=(Ct Ziel-Ct GAPDH) behandelt-(Ct Ziel-Ct GAPDH)Sham1.

miRNA-137-Evaluierung bei Kontroll- und behandelten Ratten.Der miRNA{{0}}-Gehalt im Sammelrohr der inneren Medulla der Kontrolle und der behandelten Ratte wurde mit TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), die eine hochempfindliche und spezifische Benachrichtigung über reife miRNA mittels quantitativer PCR ermöglichte. Nierenscheiben von etwa 0,5 mm wurden hergestellt und für 10 min in einem Puffer äquilibriert, der 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM Glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2 , 1,8 mM MgSO 4 und 1,8 mM enthielt KH2PO4(pH7,4). Die Nierenpapille wurde unter einem Stereomikroskop isoliert. Proben von Kontroll- und behandelten Ratten wurden dann mit einer Schere direkt in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zerkleinert, um Gesamt-RNA zu extrahieren. TaqMan Advanced miRNA cDNA-Synthesekit （Katalog-Nr.²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA） wurde verwendet, um eine cDNA-Synthese gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll zu erhalten (Poly(A)-Tailing-Reaktion; Ligationsreaktion; reverse Transkriptionsreaktion; miR-Amp-Reaktion). Die synthetische RNA(UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) mit 59--Phosphor wurde von Thermo Fisher Scientific synthetisiert und verwendet, um eine Kalibrierungskurve zur Interpolation von miRNA-Probenwerten zu erstellen und eine genaue Bewertung (in Nanogramm) des miR-137-Gehalts zu erhalten Proben16, unter Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Statistische Analyse.Alle Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Die statistische Analyse wurde durch einfache ANOVA gefolgt von Newman-Keuls-Mehrfachvergleichstest mit *p durchgeführt<0.05 considered="" statistically="" different="">

Erklärungen, ethische Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme.Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den dänischen nationalen Richtlinien für die Pflege und Handhabung von Versuchstieren und den veröffentlichten Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Die Ethikkommission für Tierhaltung des Instituts für klinische Medizin der Universität Aarhus genehmigte die Studienprotokolle gemäß den vom dänischen Justizministerium ausgestellten Genehmigungen für die Verwendung von Versuchstieren (Genehmigungsnummer 2015-15-0201-00658). Die Autoren bestätigen, dass alle Methoden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt wurden. Darüber hinaus bestätigen die Autoren, dass die Studie in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Leitlinien durchgeführt wurde.

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