Die optogenetische Hemmung medialer entorhinaler Cortex-Eingänge in den Hippocampus während eines kurzen Zeitraums direkt nach dem Lernen stört die kontextuelle Angstgedächtnisbildung

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Abstrakt

Die Bildung der zeitlichen AssoziationErinnerungund kontextspezifische AngstErinnerungEs wird angenommen, dass Eingaben des medialen entorhinalen Kortex (MEC) für die erforderlich sindHippocampusbei Lernveranstaltungen. Ob die MEC-Inputs jedoch auch während einer Nachlernphase an der Gedächtnisbildung beteiligt sind, wurde noch nicht direkt getestet. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, hemmten wir optogenetisch Axone und Terminals, die von bilateralen dorsalen MEC-exzitatorischen Neuronen im Rücken stammtenHippocampusfür 5 min direkt nach der kontextuellen Angstkonditionierung (CFC). Mäuse, die eNpHR3.0 exprimierten, zeigten im Vergleich zu Kontrollmäusen, die nur EGFP exprimierten, während des Abruftests im konditionierten Kontext 1 Tag nach dem Lernen signifikant weniger Einfrieren. Im Gegensatz dazu beeinflusste die gleiche optogenetische Hemmung von MEC-Inputs, die 30 min vor dem Wiedergewinnungstest durchgeführt wurde, das Einfrieren während des Wiedergewinnungstests nicht, was die Möglichkeit der unspezifischen schädlichen Wirkung der optischen Hemmung auf den Wiedergewinnungsprozess ausschließt. Diese Ergebnisse unterstützen, dass die kontextuelle Angstgedächtnisbildung MEC-Eingaben in den Hippocampus während einer Phase nach dem Lernen erfordert.

Schlüsselwörter: Medialer entorhinaler Kortex, Hippocampus, kontextuelle Angstkonditionierung

Min Soo Kang und Jin‑Hee Han

Das Hippocampus-entorhinale Cortex-System ist entscheidend für episodischeErinnerungFormation [1]. Es gibt Hinweise darauf, dass der Eingang von der medialen entorhinalen Kortexschicht III (MECIII) zumHippocampus, hauptsächlich für das Unterfeld CA1, ist entscheidend für das zeitliche assoziative Lernen wie die Angstkonditionierung, aber nicht für die kontextuelle und verzögerte Angstkonditionierung [2, 3]. Im Gegensatz dazu beeinträchtigt die optogenetische Hemmung der medialen entorhinalen Kortexschicht II (MECII)-Zellen, die in den Gyrus dentatus (DG) und CA3 projizieren, aber nicht die Zellen, die in CA1 projizieren, während CFC die Gedächtnisbildung beeinträchtigt [4]. Es wird angenommen, dass die Eingabe von MECII an DG oder CA3 für das kontextbezogene Lernen von Angst erforderlich ist. Nicht nur beim Lernen, sondern der MEC-Eingang zum Hippocampus ist auch an einzigartigen physiologischen Aktivitätsmustern beteiligt, die im Hippocampus während Ruhe und Schlaf beobachtet werden, wie zErinnerungKonsolidierungsprozess [5–10]. Daher MEC-Eingang zumHippocampuskann eine Rolle bei der Gedächtnisbildung während einer Phase nach dem Lernen spielen. Diese Möglichkeit wurde jedoch noch nicht getestet. Um zu testen, ob die MEC-Eingabe in den Hippocampus während der Nachlernphase notwendig ist, haben wir einen optogenetischen Ansatz gewählt, um die MEC-Eingabeaktivität in 129/C57Bl/6-Hybridmäusen zum Schweigen zu bringen [11, 12]. Um den MEC-Eingang zu manipulieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das Gene enthält, die für eNpHR3.0 kodieren, fusioniert mit dem fluoreszierenden Protein EYFP unter dem CaMKII-Promotor (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP), in die bilaterale Injektion injiziert MEC zielt auf Schicht II und III ab (0,5 µl pro Seite; AP: – 4,65 mm; ML: ± 3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (Abb. 1a). Als Kontrolle injizierten wir AAV ohne eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), das nur das fluoreszierende Protein exprimiert. Die AAV-Expression war auf die MEC-Schichten II und III beschränkt, die eine Projektion zum Hippocampus senden (Abb. 1b). Im Hippocampus wurden EYFP exprimierende axonale MEC-Projektionen in DG und CA3 nachgewiesen, die von MECII stammen, und auch in CA1, die von MECIII stammen (Abb. 1a). Drei Wochen nach der AAV-Injektionsoperation wurden die Mäuse erneut für eine optische Faserimplantationsoperation anästhesiert.

Cistanchekann verbessernErinnerung

Optische Fasern wurden in den dorsalen Hippocampus (AP: – 2,0 mm; ML: ±1,3 mm; DV: – 1,5 mm) zur optischen Unterdrückung von dorsalen MEC-Eingaben mit einem 561--nm-Laser implantiert. Lichtleitfaserspitzen befanden sich direkt über der Lacunose-Molekülschicht des CA1-Stratums, und daher konnte der 561--nm-Laser sowohl MECII-Afferenzen in der DG-Molekülschicht/CA3-Stratum radiatum als auch MECIII-Afferenzen in der Lacunose-Molekülschicht des CA1-Stratums abdecken ( Zusätzliche Datei 1: Abb. S1). Während der einwöchigen Erholungsphase nach der Implantation durchliefen die Mäuse 3 Tage lang eine Fasergewöhnung. Sie wurden an ein lichtabgebendes optisches Patchkabel angeschlossen und für 5 min ohne Lichtabgabe in den Gewöhnungskäfig gestellt. Nach 3 Tagen Gewöhnung wurden EGFP- und eNpHR3.0-Mäuse auf CFC trainiert.

Mäuse betraten die Konditionierungskammer und erhielten 3 min später einen Fußschock ({{0}},5 mA, 2 s). Eine Minute nach dem Fußschock wurden die Mäuse sofort in den gewohnten Käfig überführt und erhielten 5 Minuten lang kontinuierliches 561--nm-Licht (5 mW an der Faserspitze) (Abb. 1b). Nach der Hemmung nach dem Lernen kehrten die Mäuse in ihre Heimatkäfige zurück. Um zu testen, ob das kontextuelle Gedächtnis richtig ausgebildet war, wurde das Langzeitgedächtnis (LTM) getestet. Mäuse betraten die Konditionierungskammer 24 h nach CFC erneut. Die Gefriergrade wurden als Index für LTM gemessen und 3 Minuten lang überwacht. Mäuse in der eNpHR3.0-Gruppe zeigten im Vergleich zu Mäusen in der EGFP-Kontrollgruppe (Abb. 1c) ein signifikant geringeres Einfrieren, was auf ein 24-h-LTM-Defizit durch Post-Learning-Hemmung von MEC-Eingaben in den Hippocampus hindeutet. Diese Verringerung des Gefrierens war nicht auf eine unspezifische nachteilige Wirkung des optischen Hemmungsprozesses zurückzuführen. Wenn die gleiche optische Hemmung 30 Minuten vor dem LTM-Test verabreicht wurde, gab es keinen signifikanten Unterschied beim Einfrieren zwischen den Gruppen (Abb. 1d, e).

Da die Mehrheit der afferenten MEC auf den Hippocampus abzielt, ist bekannt, dass MEC Projektionen an mediale präfrontale kortikale Bereiche wie den prälimbischen und infralimbischen Kortex sendet [13]. Da die AAV-Expression bei MEC zufällig war, ist es möglich, dass unsere optische Hemmung die MEC-Axone beeinflusste, die den Hippocampus passieren, falls vorhanden, um ihre Wirkung auf die kontextuelle Angstgedächtnisbildung zu erzeugen. Um diese Möglichkeit auszuschließen, haben wir MEC-Neuronen, die zum Hippocampus projizieren, retrograd markiert. Wir injizierten das CAV2-Cre-Virus in den Hippocampus, das retrograd von Neuronen aufgenommen wird, die durch Axonterminals zum Hippocampus projizieren (Abb. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP oder AAV-Ef1 -DIO-EYFP wurde in die MEC injiziert, sodass MEC-Neuronen, die CAV2-Cre aufgenommen haben, dies können Express eNpHR3.0-EYFP oder EYFP (Zusätzliche Datei 1: Abb. S2). Zehn, wir haben es geschafft, MEC-Einträge in den Hippocampus direkt nach CFC zu hemmen. Ähnlich wie bei den vorherigen Ergebnissen störte die optische Hemmung in diesem Zustand die Bildung von Kontextangstgedächtnissen (Abb. 1g, h). Somit stärken diese Daten unsere Schlussfolgerung, dass MEC-Eingaben in den Hippocampus für die kontextuelle Gedächtnisbildung während einer Nachlernphase entscheidend sind. Eine Einschränkung dieser Studie ist der Mangel an räumlicher Spezifität bei der verwendeten optischen Hemmung.

Somit ist unklar, in welchem ​​Ausmaß und wo genau innerhalb des hippocampalen Kreislaufs die weitverbreiteten MEC-Inputs mit der optischen Hemmung in unserem Zustand unterdrückt wurden. Eine präzise Hemmung von MEC-Eingaben, die auf ein bestimmtes Unterfeld wie CA1 oder DG des Hippocampus abzielen, könnte notwendig sein, um den Mechanismus aufzuklären, durch den MEC-Eingaben zur Bildung von kontextbezogenem Angstgedächtnis in der zukünftigen Studie beitragen. Obwohl wir die Wirkung der optischen Hemmung von MEC-Eingaben in den Hippocampus zu verschiedenen Zeitpunkten nach kontextueller Angstkonditionierung in dieser Studie nicht getestet haben, berichten frühere Studien über eine zeitabhängige Rolle von Gehirnaktivitäten nach dem Lernen für die Konsolidierung von Hippocampus-abhängigen Erinnerungen wie kontextuelle Angstkonditionierung. Beispielsweise wurde in einer früheren Studie mithilfe einer optogenetischen Strategie die Induktion von Slow-Wave-Sleep (SWS) zu verschiedenen Zeitpunkten nach verschiedenen Lernaufgaben künstlich manipuliert, und es stellte sich heraus, dass es ein kritisches Zeitfenster (innerhalb von 30 Minuten) gibt, in dem SWS induziert wird durch Licht kann Hippocampus-abhängige Erinnerungen verbessern [14].

Abb.1 Hemmung der MEC-Eingabe in den Hippocampus unmittelbar nach dem Verdienen beeinträchtigt die langfristige kontextbezogene Angstgedächtnisbildung. a Schematische Darstellung der bilateralen AAVinjektion und der Implantationsstelle der Optikhülse (eft). Repräsentative conkocalmikroscopk-Bilder, die die EGFP- und eNpHR0-EYFP-Expression im MEC (oben) und im Hippocampus (unten) zeigen. Das Sternchen zeigt die ungefähre Position der Glasfaserspitze an. b Verhaltensschema. Histogramm, das das Einfrierniveau während des Tests zeigtNpHR30 um （3589主 3,21 Prozent, n=】1】 zeigte im Vergleich zur EGFP-Kontrollgruppe (53,13 ± 265 Prozent, n=12) signifikant weniger frierendes Juwel LTM-Test.**S<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005: Studenten t-Test. ist nicht signifikant, f CAV- und AAV-Initiierungsstrategie oder retrograde Markierung von MEC-Neuonen, die sich zum Hippocampus ausbreiten (f) Schematische Darstellung der bilateralen CW-Injektion, AW-Injektion und des Verhaltensschemas der Implantationsstelle der optischen Ferrule (rechts). h Histogramm, das das Gefrierniveau während des Tests zeigt. Die eNpHR3.0-Gruppe (33,71 ± 4,06 Prozent, n=11) ​​zeigte im LIM-Test ein signifikant niedrigeres Gefrierniveau im Vergleich zur EYFP-Kontrollgruppe (50,13 ± 3,18 Prozent, n=12). .**p<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Interessanterweise zeigte eine andere Studie an Ratten, dass selektive elektrolytische Läsionen der direkten entorhinalen Projektion (temporoammonisch, TA) in den Hippocampusbereich CA1 24 h, aber nicht 3 Wochen nach dem Morris-Wasserlabyrinth-Training die Bildung des räumlichen Gedächtnisses an einer entfernten Stelle störten Zeit, was darauf hindeutet, dass die MEC-Hippocampus-Interaktion über den TA-Eingangsweg während dieses Zeitraums für die Systemkonsolidierung erforderlich ist [15]. Angesichts dieser Befunde ist es sehr wahrscheinlich, dass MEC-Eingaben in den Hippocampus eine zeitabhängige Rolle bei der Bildung von kürzlichen und fernen kontextuellen Angsterinnerungen spielen.

In unserer Studie ist interessant, dass eine so kurze Zeitspanne (5 Minuten) der optogenetischen Hemmung nach dem Training ausreichte, um die Bildung des Kontextgedächtnisses zu beeinträchtigen. Eine Interpretation ist, dass unsere Ergebnisse möglicherweise einen Teilblock von Konsolidierungsereignissen widerspiegeln, die für eine normale Gedächtnisbildung erforderlich sind. In Übereinstimmung mit dieser Darstellung war das Gedächtnis in unserem Zustand teilweise beeinträchtigt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass während dieses kurzen Zeitpunkts, der für die Bildung des kontextuellen Angstgedächtnisses erforderlich ist, ein kritisches Ereignis auftritt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass der MEC-Eingang entscheidend für das Auslösen von Wellen oder Zacken im Hippocampus sein kann, die mit einer Wiederholung zuvor erlebter Ereignisse korrelieren [7, 9, 10, 16], und die optogenetische Hemmung des MEC-Eingangs könnte solche Aktivitätsmuster stören. Alternativ könnte eine kurze Hemmung des MEC-Inputs den nachfolgenden Slow-Wave-Schlaf beeinflusst haben, der auch ein entscheidendes Zeitfenster in Bezug auf die Hippocampus-abhängige Gedächtniskonsolidierung hat [14].

Verweise

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