Überblick über die Bestandteile von Phlorotanninen in Fucales, Teil 3

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern. Außerdem hat es eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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Eckole können aufgrund des Vorhandenseins von Dibenzodioxinstrukturen von den anderen Gruppen anhand ihrer deprotonierten Molekülionen unterschieden werden, die normalerweise 2 Da niedriger sind als andere PTs mit gleichen DPs für jedes in der Struktur vorhandene Dibenzodioxinmotiv (Abbildung). 5D). Zum Beispiel präsentiert Eckol ein [MH]− bei m/z 371, während Trifocal, Triphlorethol und Fucophlorethol alle [MH]− bei m/z 373 vorliegen. Beckons wiederum haben zwei Dibenzodioxinstrukturen in ihrem Rückgrat, weisen ein [MH]− bei m/z 741 auf, während ihre Hexameräquivalente [MH]− bei m/z 745 aufweisen. Das Gleiche gilt für Carmalole, bei denen es sich im Wesentlichen um Halls handelt, die Dibenzodioxinstrukturen enthalten [120]. Schließlich zeichnen sich einige PTs, die Furanringe enthalten, wie Fucofuroeckol und Phlorofucofuroeckol, durch ein dehydriertes-deprotoniertes Molekülion aus, d. h. einen [MH]−, der 18 Da niedriger ist als ihre nicht furanhaltigen Äquivalente mit gleichen DPs (z. B. unterscheiden sich Fucofuroeckol- und Phloroeckol-Strukturen nur durch das Vorhandensein/Fehlen des Furanrings und zeigen [MH]− bei m/z 496 bzw. 478) [120]. Tabelle 3 zeigt MS-Daten, die aus verschiedenen Studien gesammelt wurden, die sich auf die Identifizierung von PTs in Fucales konzentrierten.

Obwohl diese Grundlagen nützlich sein können, um eine vernünftige strukturelle Identifizierung von PTs mit niedrigem Molekulargewicht zu erreichen, ergeben sich große Schwierigkeiten, wenn es um Oligomere und Polymere mit hohem Molekulargewicht geht, da deren Isomerisierung exponentiell zunimmt und die vielfältigen Möglichkeiten für Phloroglucinol-Anordnungen und -Kombinationen kaum möglich sind aufgeklärt durch MS oder MS/MS. Dennoch kann MS in solchen Fällen immer noch wertvolle Informationen über den DP der in einer Phlorotannin-Mischung vorhandenen Verbindungen liefern. In dieser Hinsicht stellt die Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-MS (MALDI-TOF-MS) einen geeigneteren Ansatz für die Analyse größerer Oligomere dar, da sie Moleküle mit m/z oberhalb der Obergrenze von ESI erkennen kann. MS. Diese Technik wurde verwendet, um die Phlorotannin-Fraktion von Sargassum wightii zu untersuchen und so das Vorhandensein von Dimeren, Trimeren und Hexameren von Phloroglucinol zu bestätigen [125]. Hochauflösende MS (HRMS) ist ein alternativer Ansatz, der auch für die Analyse von PTs mit hohen Molekulargewichten verwendet werden kann und auf mehrfach geladenen Ionen und Änderungen im Plus-1 13C-Isotopenmuster beruht. Mit anderen Worten: Wenn eine Verbindung doppelt oder dreifach geladen ist, zeigt sie ein Plus-1 13C-Isotopenmuster mit m/z-Unterschieden von 0.5 bzw. 0.33 . Nach diesem Prinzip haben Steevensz et al. [78] konnten die PT-Zusammensetzung von P. canaliculata, F. spiralis, F. vesiculosus und A. nodosum im Hinblick auf DP profilieren und Verbindungen mit Molekulargewichten von bis zu 6000 Da nachweisen, die andernfalls den Massenbereich überschreiten würden von ESI-MS.

Obwohl Massenspektrometrie eine einfallsreiche Technik für die qualitative Analyse von PTs sein kann und sogar leistungsstark genug ist, um eine einigermaßen gute Charakterisierung von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu erreichen, gelingt es ihr insgesamt nicht, ausreichende Details über die Art und Bindungsposition der isomeren Formen von Verbindungen zu ermitteln mit höherem DPS. Wenn das Ziel darin besteht, die Strukturmerkmale von PTs vollständig aufzuklären, ist NMR daher die einzige wirksame Methode, die eine ausreichende Auflösung für eine solch tiefgreifende Analyse bieten kann.

5.2.3. NMR

Die NMR-Spektroskopie umfasst eine direkte und zerstörungsfreie Analyse, die nicht nur für den Zugriff auf den Inhalt von PTs, sondern auch für die vollständige Aufklärung der Strukturmerkmale von PTs nützlich sein kann. Wenn quantitative Daten beabsichtigt sind, werden 1H-NMR-Resonanzsignale aller in Algenextrakten enthaltenen phenolischen Verbindungen integriert und mit denen eines geeigneten internen Standards verglichen; Diese Verbindungen müssen stabil, chemisch inert, in hochreiner Form verfügbar und in denselben deuterierten Lösungsmitteln wie die Probe vollständig löslich sein. Insgesamt haben die Autoren unterschiedliche Ansätze und Methoden verwendet, um phenolische Verbindungen und/oder PTs mit dieser Technik zu quantifizieren, auch in aus Fucale gewonnenen Proben.

In 2009 haben Parys et al. beschrieben zum ersten Mal die Verwendung quantitativer 1H-NMR (NMR) zur Bestimmung der Variabilität des Phlorotanningehalts von A. nodosum im Laufe des Jahres. In ihrer Arbeit wurde Trimesinsäure als interner Standard verwendet (2,0 mg Trimesinsäure in 0,8 ml deuteriertem Methanol und 0,2 ml Deuteriumoxid) und eine Kalibrierungskurve wurde mit Phloroglucinol erstellt. Obwohl durch qHNMR im Vergleich zu denen, die mit der kolorimetrischen FC-Methode ermittelt wurden, ein höherer PT-Gehalt festgestellt wurde, folgten beide Methoden demselben saisonalen Schwankungstrend [126]. Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zum kolorimetrischen Assay, der nicht spezifisch für PTs oder gar für Phenolverbindungen ist, die Integration der Resonanzsignale von 1H-NMR-Spektren im qHNMR mit denen des internen Standards verglichen wird. Aufgrund dieser grundsätzlichen Unterschiede ist ein direkter Vergleich zwischen beiden Methoden nicht möglich [127,128].

Mit einem besonderen Ansatz verwendeten Stiger-Pouvreau und Mitarbeiter hochauflösendes Magic Angle Spinning (HR-MAS), um PTs in der Braunalge Cystoseira tamariscifolia zu quantifizieren. In dieser Studie wurde Festkörper-NMR verwendet, um Phloroglucinol (Monomer) in vivo nachzuweisen, und 1H-qNMR wurde verwendet, um die Monomerquantifizierung abzuschätzen (unter Verwendung von Trimethylsilylpropionat-d4 (TSP) als interner Standard). Das Phloroglucinol-Singulett bei δ 6,02 ppm, integriert in drei Protonen, bestätigte seine Anwesenheit in der Probe. Die Genauigkeit dieser Methode wurde unter Verwendung einer Standardlösung von Phloroglucinol bewertet und die Ergebnisse wurden durch Vergleich mit denen des FC-Assays validiert. Letztendlich behaupteten die Autoren, dass es sich bei der vorgestellten Methodik um eine innovative und schnelle Methode zur Quantifizierung von Phloroglucinol handele, die auf alle Algenarten angewendet werden könne. Die einzige Einschränkung der qNMR-Methode liegt in der Notwendigkeit, dass mindestens eines der Spektrensignale (Singulett, Dublett usw.) eindeutig einer und nur einer Verbindung zugeordnet werden muss [129].

Zu Beginn des Jahres 2010 demonstrierten dieselben Autoren bereits das Potenzial der In-vivo-1H-HR-MAS-NMR in Verbindung mit Massenspektrometrie (LC/ESI-MSn), um das globale chemische Profil von fünf Arten der Gattung Cystoseira zu beobachten, die entlang der Küsten vorkommen der Bretagne in Frankreich: C. baccata, C. foeniculacea, C. humilis, C. nodi caulis und C. tamariscifolia [130]. Der

Das Hauptziel ihrer Arbeit bestand darin, Cystoseira-Exemplare zu identifizieren und ihre Taxonomie zu diskutieren. Die Ergebnisse bewiesen die Effizienz des vorgestellten Ansatzes zur Unterscheidung hauptsächlich von C. nodicaulis und C. tamariscifolia, da ihre Spektren das Vorhandensein charakteristischer Signale zeigten und ihre eindeutige Identifizierung ermöglichten. Im Fall eines Singuletts bei 2,91 ppm für das erste und für das letztere charakterisierte ein Peak bei genau 6,00 ppm die Art und deutete auf das mögliche Vorkommen eines einfachen Phlorotannins hin. Foeniculacea und C. humilis waren im Allgemeinen durch das Auftreten von zwei Dubletts gleicher Intensität bei 7,90 und 7,36 ppm gekennzeichnet. Die absolute Unterscheidung der beiden Signale blieb jedoch unmöglich. Die Ähnlichkeit der In-vivo-NMR-Signale gepaart mit der geringen intraspezifischen chemischen Diversität beider Arten rechtfertigte diese Ergebnisse. Im Fall von C. baccata schließlich ermöglichten viele Signale trotz der größten chemischen Vielfalt eine ständige Unterscheidung von den anderen Arten.

Im Jahr 2020 zeigten Walsh und Mitarbeiter [131] das antimikrobielle Potenzial von zwei gereinigten Phlorotannin-Extrakten aus A. nodosum und F. serratus, zwei Gezeiten-Braunalgen. In dieser Arbeit ermöglichte die 1H- und 13C-NMR-Analyse nicht nur eine quantitative und qualitative Abschätzung der gesamten Phenolverbindungen, sondern auch den Zugang zu Unterschieden im Verknüpfungsprofil zwischen gereinigten Phenolextrakten beider Spezies. Beim FC-Assay wurde bei A. nodosum ein deutlich höherer Gehalt an Gesamtphenolverbindungen gefunden als bei F. serratus, und die Ergebnisse wurden durch den FC-Assay validiert. Darüber hinaus zeigten die mit dem qNMR- und FC-Assay erzielten Ergebnisse, dass es Unterschiede zwischen den monatlich gesammelten Proben und zwischen beiden Methoden gibt.

Zur Aufklärung der PT-Struktur verwendeten Glombitza und seine Gruppe erstmals in den 70er Jahren die 1H- und 13C-NMR-Analyse, als sie Phloroglucinol in verschiedenen Braunalgenarten identifizierten. Die Komplexität der mit diesen Derivaten verbundenen Spektren ermöglichte nur die Identifizierung kleinerer polyphenolischer Strukturen. So wurde 1974 erstmals die chemische Struktur von Bifuhalol und Diphlorethol aus einem 80-prozentigen Ethanolextrakt von C. tamariscifolia aufgeklärt [132].

Dennoch wurden seitdem mehr als hundert PT-Strukturen mittels NMR aufgeklärt [133]. Zu diesem Zweck werden die Extrakte üblicherweise einem Vorbehandlungsschritt mit Hexan oder Petrolether unterzogen, um große PTs auszufällen. Um die Instabilität von PTs zu verhindern, die NMR-Analyse zu erleichtern und die Polarität dieser Verbindungen zu ändern, werden sie außerdem oft mit Essigsäureanhydrid und Pyridin acetyliert, was ihre Reinigung durch Normalphasen-Silica-Chromatographie ermöglicht [119]. In den 1H-NMR-Spektren dieses Verbindungstyps müssen zwei Aspekte beachtet werden: Die Resonanz aromatischer Protonen erscheint zwischen δ 6.0 und 7,5 ppm und die Acetylgruppen erscheinen als Singulett-Peaks zwischen δ 2 und 3 ppm . Dies ist ein nützliches Hilfsmittel, um die Anzahl der freien Hydroxygruppen in den ursprünglichen ungeschützten Phenolen zu bestimmen. Die zwei Arten von aromatischen Ringsystemen, die auftreten können, sind in Abbildung 6 dargestellt. Die unterschiedliche chemische Umgebung der beiden Arten von Protonen (Ha und Hb) verändert die Vielfalt der beobachteten Signale im 1H-NMR sowie deren Integration.

Zusammen mit der 1H-NMR-Spektroskopie wurden 13C- und HSQC- sowie HMBC-NMR-Spektren verwendet, um die Strukturen gereinigter PTs, auch in Fucales, aufzuklären. Der heteronukleare Korrelations-NMR-spektroskopische Ansatz ist nützlich, um die Klasse von PTs aus einer Probenmatrix zu identifizieren (Monomer, Kraftstoff, Chlorethyl, Voll, Fucophloroethol usw.) [134]. Die charakteristischen 13C-NMR-Signale von PTs sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Kohlenstoffresonanzen einer bestimmten Art von Kohlenstoffen, die bei charakteristischen chemischen Verschiebungen auftreten, ermöglichen zusammen mit ihrer Intensität die Zuordnung einiger Signale zu bestimmten Klassen von PTs, insbesondere den Phloretholen und Hallen .

Im Jahr 1997 stellten Glombitza et al. [135] beschrieben die Isolierung und Charakterisierung von 33 PTs aus der Braunalge Cystophora torulosa. Es wurden verschiedene PT-Klassen identifiziert, darunter Phlorethole und Halls sowie Fucophlorethole und Hydroxyfucophlorethole (Beispiele in Abbildung 7). Darüber hinaus wurden in Bezug auf Letzteres sieben neue Hydroxyfucophlorethole mit zusätzlichen Hydroxylgruppen identifiziert und charakterisiert (NMR und MS). Wie bereits erwähnt, beschrieben die Autoren ihre Isolierung als Acetate, um eine Oxidation zu verhindern und die Lipophilie der isolierten PT-Derivate zu erhöhen [82].

Koch et al. haben auch die Anwendung von 1H- und 13C-NMR zur Charakterisierung größerer Fuhalolacetate in B. bifurcate demonstriert [136]. HSQC- und HMBC (2D)-NMR-spektroskopische Techniken wurden von Cérantola et al. verwendet. um das Vorhandensein von Fucol- und Fucophlorethol-Strukturen in den Extrakten von Fucus spiralis anzuzeigen [137]. Der gleiche Ansatz wurde bei Halidrys siliquosa angewendet, die in der Bretagne häufig vorkommt. Die Verwendung von 1D- und 2D-NMR- und MS-Analysen ermöglichte die Identifizierung von vier Phenolderivaten: Trifuhalole und Tetrafuhalole sowie erstmals Diphlorethole und Triphlorethole [125]. Tabelle 5 fasst die oben genannten Studien zusammen, in denen 1H- und 13C-NMR zur Aufklärung der Struktur von PTs beitrugen, die aus Algen der Gattung Fucales extrahiert wurden.

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