Parasiten, Infektionen und Impfung in synthetischen Minimalzellen

ABSTRAKT: Synthetische Minimalzellen bieten ein kontrollierbares und konstruierbares Modell für biologische Prozesse. Synthetische Zellen sind zwar viel einfacher als jede lebende natürliche Zelle, bieten aber eine Grundlage für die Untersuchung der chemischen Grundlagen wichtiger biologischer Prozesse. Hier zeigen wir ein synthetisches Zellsystem mit Wirtszellen, die mit Parasiten interagieren und Infektionen unterschiedlicher Schwere erleiden. Wir zeigen, wie der Wirt so manipuliert werden kann, dass er Infektionen widersteht, wir untersuchen die metabolischen Kosten der Resistenzübertragung und wir zeigen eine Impfung, die den Wirt gegen Krankheitserreger immunisiert. Unsere Arbeit erweitert den Werkzeugkasten des synthetischen Zell-Engineerings durch den Nachweis von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und Mechanismen für den Erwerb von Immunität. Damit kommen synthetische Zellsysteme der Bereitstellung eines umfassenden Modells des komplexen, natürlichen Lebens einen Schritt näher.

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EINFÜHRUNG

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Gebiet der synthetischen Biologie explosionsartig entwickelt und ermöglicht die Konstruktion synthetischer Zellen, die Aspekte des natürlichen biologischen Lebens ähneln und modellieren. Die Modellierung zellulärer Pfade und Verhaltensweisen in synthetischen Zellen bietet viele Vorteile gegenüber lebenden Zellen, wie z. B. eine einfachere und definiertere Reaktionsumgebung, vollständige Kontrolle über den proteomischen und chemischen Aufbau der Zelle, die Fähigkeit, störende biologische Pfade und Prozesse zu kompartimentieren und aufrechtzuerhalten wichtige biologische Systeme, die in In-vitro-Reaktionssystemen fehlen.1,2 Diese einzigartigen Vorteile synthetischer Zelltechnologien haben bereits die Simulation biologischer Bedingungen und Pfade in einem lebensechten In-vitro-Bioreaktor (synthetische Zelle) ermöglicht und zu einem besseren Verständnis geführt viele Forschungsbereiche, darunter molekulares Crowding,3 Lipid-Protein-Dynamik,4 minimaler Stoffwechsel5 und viele andere kritische Aspekte des biologischen Lebens.2 Diese lebensechten synthetischen Zellen mit ihren einzigartigen Vorzügen werden schnell zu besseren Modellen und bringen mehr Licht ins Dunkel das mysteriöse Innenleben des Zelllebens.6,7 Diese Durchbrüche beschränken sich nicht auf Prozesse einzelner Zellen; Auch technische Wechselwirkungen zwischen Liposomenpopulationen haben sich als leistungsstarke Technologie erwiesen. Beispielsweise wurde der Entwurf eines synthetischen Zellsystems entwickelt, das eine Räuber-Beute-Beziehung nachahmt und dabei Licht als Signal zwischen diesen synthetischen Zellpopulationen nutzt.8 Eine weitere komplexe Arbeit wurde entwickelt, die die Signalausbreitung durch eine synthetische Zelltröpfchenmatrix ermöglicht. Dadurch kann sich die Fluoreszenz räumlich in der Bevölkerung ausbreiten.9 Neben synthetischen Zell-Synthetik-Zell-Wechselwirkungen gab es in jüngster Zeit auch Fortschritte bei synthetischen Zell-Lebend-Zell-Schnittstellen. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass eine synthetische Zelle, die für die Verbindung mit einer neuralen Stammzelle konzipiert ist, in der Lage ist, die neuronale Differenzierung zu induzieren und als verallgemeinertes Chassis zu fungieren, das in der Lage ist, mit anderen Zelltypen zu kommunizieren.10 Es gab unzählige Fortschritte in der Entwicklung von Signalausbreitung und synthetischen Zellen als Schnittstellen, von denen viele in den folgenden Aufsätzen untersucht werden.11–13 Kurz gesagt, es gibt ganze Forschungsbereiche, die sich mit der Nachahmung der Wechselwirkungen von Zellpopulationen im Modellsystem synthetischer Zellen befassen. Dennoch gibt es keine Studie, die synthetische Zellen zur Modellierung von Infektionen, Parasitismus oder Impfungen verwendet. So wie synthetische Zellen üblicherweise zur vereinfachten und kontrollierten Modellierung komplexer biologischer Prozesse verwendet werden, besteht das Potenzial, diese komplexen Interaktionen zwischen Organismen modellieren zu können. Wie wichtig dies ist, zeigt sich in der bahnbrechenden Studie, die erfolgreich aktive Phagenpartikel innerhalb einer zellfreien Proteinexpressionsplattform produzierte.14 Unser Ziel ist es, dieses Konzept auf die Makroebene zu übertragen, indem wir synthetische Zellpopulationen entwerfen, die sich gegenseitig aktiv infizieren und kapern können das Genom einer Wirtszelle, genau wie lebende Viren und Parasiten. Die Möglichkeit, synthetische Zellen zur Modellierung dieses Krankheitsverhaltens einzusetzen und zu konstruieren, wird ein wertvolles Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft darstellen.

In dieser Arbeit stellen wir unser System zur Modellierung synthetischer Zellkrankheiten vor. Wir haben eine Wirtszelle entwickelt, die von der zweiten Population parasitärer synthetischer Zellen infiziert werden kann, und haben die Ressourcenkonkurrenz, die Genomentführung und die metabolische Umnutzung untersucht, die während einer solchen Infektion auftreten. Wir modellieren auch eine Methode, die die Rettung des Wirts nach einer Infektion ermöglicht, sowie ein Impfmittel, das es dem Wirt ermöglicht, der Infektion durch die krankheitsverursachenden synthetischen Zellen zu widerstehen. Kurz gesagt, wir präsentieren ein neuartiges Krankheits- und Infektionsmodell-Chassis für synthetische Zellen. Mit dieser Technologie können synthetische Zellen als rudimentäre Modelle für Krankheiten, Infektionen und Impfungen eingesetzt werden (Abbildung 1).

Abbildung 1. Parasiten-, Infektions- und Impfsystem in synthetischen Minimalzellen. (a) Der „Wirt“ ist eine synthetische Zelle, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert. Auf der Oberfläche der Außenmembran trägt der Wirt ssDNA-Tags. Die einzigen Proteine, die in einen gesunden Wirt übersetzt werden, sind die eigenen Proteine ​​des Wirts aus den Plasmiden, mit denen der Wirt erstellt wurde. (b) Der „Parasit“ ist ein Liposom, das mit Plasmid-DNA gefüllt ist, die ein Gen für das mCherry-Fluoreszenzprotein kodiert, und die Oberfläche des Parasiten-Liposoms ist mit einem ssDNA-Tag versehen (komplementär zum Tag auf der Wirtsoberfläche). Die „Infektion“ beginnt mit einer Verschmelzung der Wirts- und Parasiten-Liposomen, vermittelt durch die komplementären DNA-Tags auf ihrer Oberfläche. Nach der Infektion exprimiert der Wirt sowohl das ursprüngliche Wirtsgen (GFP) als auch das Parasitengen (mCherry). (c) Die „Infektion“ beginnt damit, dass „pathogene“ Liposomen, die ein Gen für das Restriktionsenzym MunI tragen, mit den Liposomen des Wirts fusionieren. Das Pathogen-Gen MunI wird vom Wirt exprimiert und das Restriktionsenzym MunI verdaut die Wirts-DNA. Dies führt dazu, dass das native Wirtsgenom verdaut wird, wodurch der Großteil der Wirtsproteinexpression von GFP auf das vom Krankheitserreger kodierte Protein MunI umgestellt wird. (d) Die „tödliche Infektion“ ist eine Fusion des Wirtsliposoms (mit dem GFP-Genom) mit dem Erregerliposom, das das für aHL, ein Membranprotein, kodierende Gen enthält. Nach der Infektion exprimiert der Wirt aHL, wodurch Membranporen entstehen, wodurch Nährstoffe aus dem Wirt austreten und der Stoffwechsel des Wirts effektiv zum Erliegen kommt. (e) „Immunisierung“ ist die Inkubation des Wirts mit ssDNA, die eine Sequenz enthält, die mit den Fusions-Tags auf der Oberfläche der Wirtsliposomen kompatibel ist. Die immunisierende DNA bildet einen Duplex mit Wirts-DNA-Tags und verhindert so die Hybridisierung anderer DNA-Oligos an diese Tags. Dies verhindert die Fusion etwaiger pathogener Liposomen mit dem Wirt. Hierbei handelt es sich um eine Proof-of-Concept-Zahl. Die Diagramme dienen der Veranschaulichung und stellen die relativen Proteinmengen dar, die vom Wirt und verschiedenen Krankheitserregern exprimiert werden. Die tatsächlichen Daten für jedes System finden Sie in den nachfolgenden Abbildungen.

RESULTATE UND DISKUSSION

In dieser Arbeit verwenden wir die Wörter: Wirt, Parasit, Infektion, tödlich, Impfstoff und Impfung, alle im Zusammenhang mit nicht lebenden, synthetischen Zellsystemen. Mit „tödlicher“ Infektion meinen wir einen deutlichen Rückgang der Translation in der Population synthetischer Zellen. Alle Experimente in dieser Arbeit wurden an synthetischen Zellen durchgeführt, die nicht leben, sich nicht selbst replizieren und sich nicht weiterentwickeln. Dabei handelt es sich um ein Modellsystem für natürliche biologische Eigenschaften und Prozesse.

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Die Infektion einer synthetischen Zelle mit einer parasitären synthetischen Zelle entführt Wirtsressourcen.

Um das Konzept eines synthetischen Zellsystems zu testen, das eine Infektion nachahmt, haben wir zunächst ein Modellsystem für einen Parasiten konstruiert. Wir haben das einfachste Konzept eines Parasiten verwendet, der sich in diesem nicht lebenden biochemischen System rekonstituieren kann: ein Parasit, der einige der Ressourcen des Wirts kapert. In diesem Fall wird der Stoffwechsel des Wirts durch die Expression des GFP-Proteins und der Parasit durch die Expression des mCherry-Proteins repräsentiert. Für dieses System nutzten wir das zuvor gezeigte Phänomen der linearen Proteinexpressionsausbeute in Abhängigkeit von der DNA-Templatkonzentration in TxTl.15,16 Zunächst machten wir uns daran, die optimale Gesamtplasmidkonzentration zu finden, der das Verhältnis von GFP und mCherry-DNA entspricht das Verhältnis der beobachteten Fluoreszenz dieser Proteine. Wir haben das GFP-Gen willkürlich als „Wirt“ und das mCherry-Gen als „Parasit“ zugeordnet. Diese Namen bedeuten in diesem speziellen Experiment nichts Besonderes, werden aber in späteren Experimenten mit synthetischen Zellen auf den Wirt und Parasiten hinweisen. Hier verwenden wir diese Namen, um die Zuordnung dieser Proof-of-Concept-Experimente zu nachfolgenden synthetischen Zellinfektionsexperimenten mit denselben Plasmiden zu erleichtern. Wir haben GFP- und mCherry-Plasmide gemischt, wobei beide Gene unter der Kontrolle des T7-Promotors bei unterschiedlichen Plasmidverhältnissen und einer Gesamtplasmidkonzentration in den Proben von 1, 5, 10 oder 15 nM standen (Abbildung 2b). Die Ergebnisse folgten der erwarteten nahezu linearen Beziehung zwischen der Plasmidkonzentration und der aufgezeichneten Fluoreszenzintensität, wobei die beste Übereinstimmung zwischen Fluoreszenz- und Plasmidkonzentrationsverhältnissen bei insgesamt 10 nM Plasmid beobachtet wurde. Die beobachtete Beziehung deutet darauf hin, dass die Plasmide, deren Proteine ​​in Größe und Aminosäurezusammensetzung ähnlich sind (Abbildung S1), um den gleichen Pool an TxTl-Ressourcen für ihre Expression konkurrieren. Eine Änderung der relativen Konzentration der beiden Plasmide führt zu Änderungen der Expressionseffizienz, die ungefähr proportional zum Verhältnis der Plasmide sind. Dies deutet darauf hin, dass es sich um ein gutes Modell zur Nachahmung einer Parasiteninfektion handelt: Das Parasitengenom (mCherry-Plasmid) konkurriert mit dem Wirtsgenom (GFP-Plasmid). Als nächstes entschieden wir uns, einen Fall zu testen, in dem eines der Plasmide unter der Kontrolle eines stärkeren Promotors stand und so ein Szenario mit voreingenommener Ressourcenzuteilung nachahmte. Um den Aspekt der Ressourcenkonkurrenz bei zukünftigen „Parasiten“-Infektionsexperimenten beizubehalten, behielten wir beide Gene unter demselben RNA-Polymerase-Promotor (der T7-RNA-Polymerase, T7-RNAP), variierten jedoch seine Stärke. Wir haben in TxTl einen starken T7-RNAP-Promotor T7Max verwendet, der eine deutlich höhere Transkriptionsausbeute zeigt, was zu entsprechend höheren Translationsausbeuten führt.17 Wir haben den Reaktionsaufbau getestet, der mit dem zuvor beschriebenen identisch ist: zwei Plasmide in unterschiedlichen Verhältnissen, getestet bei variierender Endsumme Plasmidkonzentrationen. Eines der Plasmide stand unter der Kontrolle des starken T7Max-Promotors, während das andere unter der Kontrolle des kanonischen T7-Promotors stand. In beiden Testfällen war die T7Max-Plasmidexpression stark genug, dass die Fluoreszenz des Proteins aus einem Gen unter T7Max mit der erhöhten Gesamtkonzentration des Plasmids nicht signifikant anstieg (Abbildung 2c,2d). Es schien keine Rolle zu spielen, ob T7Max GFP oder mCherry steuerte, beide Proteine ​​reagierten auf den stärkeren Promotor mit einem ähnlichen relativen Anstieg. Dies lieferte ein vielversprechendes Modell für die Infektion mit einem „stärkeren“ Parasiten (ein Parasit, der ein Gen unter T7Max in einen Wirt unter T7 trägt) und einen umgekehrten, stärkeren Wirt, der einem schwächeren Parasiten widersteht (ein Wirt mit einem Genom unter T7Max und einem Parasiten, der das T7-Gen trägt). Ermutigt durch diese Proof-of-Principle-Experimente gingen wir zu Experimenten mit synthetischen Zellen über.

Die „Infektion“ ist in allen Fällen die Verschmelzung einer synthetischen Wirts- und Parasitenzelle. Die Fusion wird durch DNA-Tags auf der Oberfläche der Liposome erleichtert, wobei das zuvor beschriebene DNA-induzierbare Fusionssystem verwendet wird.18 Kurz gesagt, die synthetischen Zellen wurden mit Escherichia coli TxTl in einer Membran aus POPC und Cholesterin erzeugt und die äußere Packungsbeilage wurde dekoriert mit einzelsträngiger DNA, die durch Cholesterinmodifikation an der Membran verankert ist. Wenn ein Liposomenpaar mit komplementären Tags aufeinander trifft, hybridisieren die DNA-Tags, bringen die Membranen zusammen und initiieren die Membranfusion, der die Lumenvermischung folgt. In unseren Experimenten ist die synthetische Wirtszelle das Liposom, das TxTl mit T7-RNAP zusätzlich zum Genom eines Plasmid-kodierten GFP enthält. Die Überwachung der GFP-Fluoreszenz dient als Indikator für die „Gesundheit“ des Wirtsstoffwechsels. Der eindringende Parasit enthält ein Genom in Form eines Plasmids, das für mCherry, das vollständige Translationssystem, kodiert, aber keine T7-RNA-Polymerase. Dadurch wird sichergestellt, dass alle beobachteten Veränderungen im Stoffwechsel des Wirts auf die vom Parasiten eingebrachten Gene zurückzuführen sind und nicht auf die Fusion der Liposomen des Parasiten und des Wirts, wodurch das Zytoplasma des Wirts verdünnt wird. Die Parasiteninfektionsexperimente wurden mit der Wirtsmembran durchgeführt, die mit Marina Blue DHPE, einem blauen Membranlipidfarbstoff, markiert war. Dies ermöglichte es uns, die beobachtete Fluoreszenz des Wirts- und Parasitengens auf die blaue Fluoreszenz zu normalisieren und die Ergebnisse auf die Gesamtmenge der in der Probe vorhandenen Wirtsmembranfluoreszenz zu normalisieren. Dies erklärt die Verdünnungen des Gesamtvolumens der Probe nach der Zugabe von Parasitenliposomen. Die Parasitenmembranen waren nicht fluoreszierend markiert. Alle Experimente wurden von einer Kontrollprobe begleitet, in der nur eine Population im Wirt vorhanden war, jedoch mit mCherry-Plasmid, um die theoretisch maximal möglichen mCherry-Expressionsniveaus zu zeigen, wenn es das einzige Gen in der Population wäre. In der ersten Reihe von Experimenten haben wir Wirt und Parasit mit Genen gemischt, die beide unter der Kontrolle des regulären T7-Promotors stehenDaher waren sowohl die Wirts- als auch die Parasitengene gleichermaßen „stark“. Wir vermischten den Wirt mit dem Parasiten, sodass der Parasit 25, 50 oder 75 % der gesamten Liposomenpopulation ausmachte. In allen Fällen nahm die GFP-Fluoreszenz des Wirts in Gegenwart des Parasiten ab, was zu einem entsprechenden Anstieg der mCherry-Fluoreszenz des Parasiten führte (Abbildung 2e). Proben, die nur den Parasiten und keinen Wirt enthielten, erzeugten erwartungsgemäß keine Fluoreszenz beider Farben. In allen Fällen ist die DNA-vermittelte Liposomenfusion nicht zu 100 % effizient;18,19 Daher waren die relative Abnahme der Wirtsfluoreszenz und die Zunahme der Parasitenfluoreszenz nicht so groß wie der erwartete theoretische Wert basierend auf dem Verhältnis von Wirt zu Parasit. Mit anderen Worten: Die Infektion war nicht zu 100 % wirksam. Diese zufällige Eigenschaft des DNA-induzierten Fusionssystems war in diesem Fall ein vorteilhaftes Merkmal des Systems. Wie bei einer natürlichen Infektion betraf die durch synthetische Zellfusion vermittelte Infektion nicht alle Wirte und nicht alle Parasiten fanden einen Wirt. Als nächstes untersuchten wir zwei Fälle, in denen Wirt und Parasit hinsichtlich der Stärke ihrer Genome nicht gleichmäßig aufeinander abgestimmt waren. In einem Fall stand das Wirtsgenom unter der Kontrolle des T7-Promotors, während das Parasitengenom unter dem T7Max-Promotor stand (Abbildung 2f), und im umgekehrten Szenario befand sich das Wirtsgenom unter T7Max und das Parasitengenom unter dem T7-Promotor (Abbildung 2g). Im Fall des schwächeren Wirts, der von einem stärkeren Parasiten angegriffen wurde, war der relative Anstieg der parasitären mCherry-Fluoreszenz und die entsprechende Abnahme der GFP-Fluoreszenz des Wirts viel stärker als im vorherigen Fall eines gleichmäßig übereinstimmenden Wirts und Parasiten. Wenn der Wirt stärker war als der Parasit, war erwartungsgemäß das Gegenteil der Fall: Die mCherry-Fluoreszenzniveaus waren niedriger und die relative Abnahme der GFP-Fluoreszenz war geringer als im gleichmäßig übereinstimmenden Fall. Dies lässt sich am besten durch den Vergleich eines einzelnen Datenpunkts unter denselben Infektionsbedingungen veranschaulichen: bei einem Parasitenanteil von 75 %. Gleichmäßig aufeinander abgestimmte Wirts- und Parasitenpopulationen führen zu einer Parasitenfluoreszenz, die etwas größer ist als die des Wirts. Wenn der Parasit stärker ist, ist die Fluoreszenz des Parasiten deutlich höher als die des Wirts. Und wenn der Wirt stärker ist, ist die Fluoreszenz des Parasiten etwas geringer als die des Wirts. Diese hervorgehobenen Datenpunkte sind in Abbildung 2e-g mit einem gelben Stern markiert. Wir führten das Kontrollexperiment eines Wirts durch, der mit einem „asymptomatischen“ Parasiten infiziert war, einem Parasiten, der ein Plasmid mit dem T7-Promotor, aber ohne proteinkodierende Sequenz trug (wir entfernten die mCherry-Kassette aus dem Plasmid) (Abbildung 2h). Die GFP-Fluoreszenz des Wirts nimmt bei höheren Parasitenkonzentrationen minimal ab, was darauf hindeutet, dass ein kleiner Teil der Wirtsressourcen für die Transkription der kurzen nichtkodierenden RNA aus dem Parasitenplasmid aufgewendet wird. Diese Daten bestätigen auch, dass die Hauptstoffwechselbelastung des Wirts durch die Parasiteninfektion in der Nutzung translatorischer und nicht transkriptioneller Ressourcen liegt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, dass die Translation die variablere und limitierendere Ressource in zellfreien Systemen ist.20 Insgesamt liefern diese Experimente ein Modell für eine Infektion mit einem Parasiten, der die Stoffwechselressourcen des Wirts kapert und synthetische Zellverhalten nachahmt Aspekte einer natürlichen Wirt-Parasit-Beziehung.

Abbildung 2. Eine Parasiteninfektion kapert die Ressourcen des Wirts. (a) Das synthetische Wirtszellliposom enthält ein zellfreies Translationssystem und ein für GFP kodierendes Plasmid. Die Oberfläche des Wirts ist mit ssDNA-Tags verziert. Das Parasitenliposom enthält ein für mCherry kodierendes Plasmid mit einem Translationssystem, aber ohne RNA-Polymerase (der Parasit kann also mCherry nicht exprimieren). Die Oberfläche des Parasiten ist mit ssDNA-Tags verziert, die zu den Tags auf der Oberfläche des Wirts komplementär sind. Die DNA-Tags erleichtern die Fusion der Wirts- und Parasitenliposomen und der Wirt exprimiert sowohl sein eigenes genomisches GFP als auch das mCherry enthaltende Parasitengenom. (b−d) Grundsatzbeweis für die Wirts- (GFP) und Parasitengenome (mCherry), die um die gleichen synthetischen Zellressourcen konkurrieren. Diese Experimente werden in TxTl-Lösung durchgeführt, nicht in Liposomen. Zwei Plasmide, die für GFP und mCherry kodieren, wurden in dem Verhältnis gemischt, das durch die Plasmidsymbole auf der linken Seite der Wärmekarte angegeben ist, wobei die Gesamt-DNA-Konzentration der Probe in der Zeile über der Wärmekarte angegeben ist. Die Fluoreszenz wurde in grünen (GFP) und roten (mCherry) Kanälen gemessen. Jedes Plasmid wurde in zwei Varianten mit unterschiedlich starken Promotoren getestet: mit T7 und mit dem stärkeren T7Max-Promotor. Individuelle Daten für alle Wärmekarten sind in den Abbildungen S2–S4 dargestellt. Repräsentative individuelle Zeitverläufe für die Proteinexpression des T7-Wirts und Parasiten sind in den Abbildungen S5–S7 und für den T7Max-Parasiten in den Abbildungen S8–S10 dargestellt. (e−g) Infektion des Wirts mit dem Parasiten. In jedem Experiment werden Wirtsliposomen mit Parasitenliposomen gemischt. Die Fusion des Parasiten mit dem Wirt liefert parasitäre mCherry-DNA, die zusammen mit der GFP-DNA des Wirts exprimiert wird. Es wurden verschiedene Verhältnisse von Wirt zu Parasit getestet, wie durch die Symbole unter den Balkendiagrammen angezeigt. Das Wirtsgenom unter dem T7-Promotor wurde mit einem Parasiten infiziert, dessen Genom unter dem T7-Promotor-Panel (e) lag, und mit einem Parasiten, dessen Genom unter dem T7Max-Promotor-Panel (f) lag. Der Wirt wurde ebenfalls mit einem T7Max-Genom hergestellt und infiziert mit dem Parasiten mit einem T7-Genom-Panel (g). Repräsentative individuelle Zeitverläufe für die Proteinexpression sind in Abbildung S11 dargestellt. Ähnliche Experimente bei höheren und niedrigeren Gesamtlipidkonzentrationen sind in Abbildung S12 dargestellt. Größenausschluss-Reinigungsspuren, die die Vesikelstabilität nach der Fusion zeigen, sind in Abbildung S13 dargestellt. (h) Infektion mit inkompatiblem Parasiten: Der Parasit trägt den T7-Promotor, aber nichtkodierende DNA. Fehlerbalken zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte in Panels (e-h) werden auf die blaue Fluoreszenz eines Membranfarbstoffs normiert, um die Ergebnisse auf die Konzentration der Wirtszellen zu normieren. Bei allen Probenserien mit der Bezeichnung „Wirt GFP infiziert“ handelt es sich um Experimente, bei denen Wirt und Parasit komplementäre DNA-Tags auf der Oberfläche hatten, was die Fusion der Liposomen ermöglichte, was als Infektion bezeichnet wird. Die mit „Wirt GFP gesund“ gekennzeichneten Serien zeigen Proben, bei denen Wirt und Parasit in den gezeigten Verhältnissen gemischt waren, aber keine komplementären Fusionsmarkierungen enthielten, was eine Infektion unmöglich machte. Die Raute in den Feldern (e−h) weist auf einen bestimmten Infektionszustand hin, der die Unterschiede in der Wirts- und Parasitenexpressionsstärke in den Feldern (e−g) und die Vorteile der Wirtsimmunität in Feld (h) am besten veranschaulicht. Ein direkter Vergleich der durch den Stern gekennzeichneten Wirts- und Parasitenwerte ist in Abbildung S14 dargestellt. Daten für eine Infektion mit einem Parasiten ohne Plasmid sind in Abbildung S15 dargestellt.

Eine Infektion einer synthetischen Zelle kann das Wirtsgenom zerstören.

Der oben beschriebene Parasit exprimierte ein genomkodierendes mCherry unter Nutzung der Ressourcen des Wirts, aber der Wirt behielt einen Teil seines Stoffwechsels bei und exprimierte trotz der Infektion weiterhin GFP. Als nächstes beschlossen wir, ein System zu untersuchen, bei dem die Infektion zu einer vollständigen Übernahme des Wirtsstoffwechsels durch den Parasiten über die Zerstörung des Wirtsgenoms führt (Abbildung 3a). Um ein solches Szenario zu konstruieren, untersuchten wir einen Restriktionsenzymverdau eines Plasmids in TxTl. In den Proof-of-Principle-Experimenten wurde ein MunI-Restriktionsenzym in TxTl ohne Liposomen exprimiert. Das MunI-Plasmid wurde in unterschiedlichen Verhältnissen mit GFP-Plasmid gemischt. Wenn das GFP-Plasmid keine MunI-Restriktionsstellen enthält, kann der relativ geringe Rückgang der beobachteten GFP-Fluoreszenz durch die zuvor beschriebene Konkurrenz zwischen den beiden Plasmiden um TxTl-Ressourcen erklärt werden. Wenn das GFP-Plasmid über eine MunI-Restriktionsstelle verfügt, nimmt die GFP-Fluoreszenz deutlich ab, und die Abnahme verhält sich proportional zu einer zunehmenden Menge des MunI-kodierenden Plasmids (Abbildung 3b). Die MunI-Expression wurde über Western Blot überwacht und proportional zur Plasmidkonzentration skaliert (Abbildung 3c).

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Ermutigt durch diese Ergebnisse haben wir ein Infektionsexperiment mit synthetischen Zellen durchgeführt. Der Wirt trug das GFP-Plasmid und der Krankheitserreger trug das MunI-Plasmid. Die Konzentration der GFP- und MunI-Plasmide wurde auf 2 mM eingestellt, deutlich unter der Konzentration der Plasmidsättigung für TxTl.21 Wir wollten unter der Gesamtplasmidkonzentration bleiben, bei der die Expression von Wirt und Parasit hoch genug wäre, um direkt um begrenzte Ressourcen zu konkurrieren ( (wie im oben beschriebenen Fall eines einfachen Parasiten), stattdessen soll hauptsächlich die Wirkung des Parasitenenzyms gemessen werden, das das Wirtsgenom aktiv zerstört. Wie in den zuvor beschriebenen Parasitenexperimenten enthielt der Wirt bakterielles TxTl und T7-RNA-Polymerase, der Krankheitserreger trug nur Zellextrakt ohne T7-RNA-Polymerase und sowohl der Wirt als auch der Krankheitserreger waren mit komplementären DNA-Fusionsmarkierungen markiert. Die Wirtsmembran wurde mit Marina Blue DHPE markiert, um die Fluoreszenzergebnisse auf die Konzentration der Wirtsliposomen zu normalisieren. Wirt und Erreger waren in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt, wobei der Erreger 25, 50 oder 75 % der Gesamtpopulation ausmachte. Die Fluoreszenz des „infizierten“ Wirts, bei dem Wirt und Krankheitserreger komplementäre Fusionsmarkierungen enthielten, nahm mit zunehmender Menge des Krankheitserregers ab. Die GFP-Fluoreszenz des „gesunden“ Wirts, bei dem der Erreger keine komplementären Fusions-Tags enthielt, nahm in Gegenwart jeglicher Menge des Erregers nicht ab. Proben, die nur den Erreger enthielten, führten zu keiner messbaren Fluoreszenz (Abbildung 3d). Die Expression des pathogenen MunI-Proteins wurde mittels Western-Blot-Analyse quantifiziert, wobei die Daten für die Probenserie des infizierten Wirts gezeigt wurden (Abbildung 3e). Als nächstes untersuchten wir die Infektion im Fall eines Wirts, der gegen den Erreger immun war: Das GFP-Plasmid des Wirts hatte keine MunI-Restriktionsstelle (Abbildung 3f). Die Fluoreszenz des Wirts nach der Infektion nahm ab, war aber bei weitem nicht so signifikant wie im früheren Fall eines Wirts mit einer MunI-Stelle im Genom. Das MunI-Erregerprotein wurde in vergleichbaren Mengen wie in früheren Infektionsexperimenten exprimiert (Abbildung 3g), sodass die Stoffwechselbelastung des Wirts ähnlich war. Die Abnahme der Fluoreszenz des infizierten Wirts in diesen Experimenten wird dadurch verursacht, dass einige der Wirtsressourcen durch den MunI exprimierenden Pathogen gekapert werden. Da die Gesamtplasmidkonzentration jedoch viel niedriger ist als in den früheren Experimenten mit einfachen Pathogenen, ist die Abnahme der Fluoreszenz des Wirts weniger signifikant. Dieses Experiment bestätigt auch, dass die Abnahme der Fluoreszenz des Wirts mit einer MunI-Stelle (Abbildung 3d) durch die in Abbildung S22 dargestellten Zeitverläufe der Proteinexpression verursacht wurde. (g) Die Expression von MunI wurde mittels Western-Blot-Analyse während des Experiments für die in der Serie „GFP-infiziert“ in Panel (f) gezeigten Proben verfolgt. Fehlerbalken auf allen Feldern zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte in den Feldern (d, f) werden auf die blaue Fluoreszenz des verwendeten Membranfarbstoffs normalisiert, um die Ergebnisse auf die Konzentration der Wirtszellen zu normalisieren. Die Fluoreszenz in Panel (b) wird für jede Probenserie auf 0 mM MunI-Plasmid normalisiert. Die Rautensymbole in den Feldern (d, f) heben einen bestimmten Zustand hervor und veranschaulichen am besten die Unterschiede in den Reaktionen auf die Infektion eines Wirts, der für das Erregerfeld (d) anfällig und gegen das Erregerfeld (f) immun ist. Bei allen Probenserien mit der Bezeichnung „GFP-infiziert“ handelt es sich um Experimente, bei denen Wirt und Krankheitserreger komplementäre DNA-Tags auf der Oberfläche hatten, was die Fusion der Liposomen ermöglichte, was als Infektion bezeichnet wird. Die mit „GFP gesund“ gekennzeichnete Serie zeigt Proben, bei denen Wirt und Krankheitserreger in den angegebenen Verhältnissen gemischt waren, aber keine komplementären Fusionsmarkierungen enthielten, was eine Infektion unmöglich machte.

Abbildung 3. Eine Infektion zerstört das Wirtsgenom und kapert Wirtsressourcen. (a) Die Wirtszellen enthalten ein für GFP kodierendes Plasmid mit zwei MunI-Restriktionsstellen; Der Erreger enthält ein Plasmid, das für das MunI-Restriktionsenzym kodiert. Nach der Fusion von Wirt und Pathogen exprimiert das TxTl des Wirts das Restriktionsenzym MunI, das dann das Wirtsgenom verdaut. (b) Die Proof-of-Principle-Experimente für die Infektion: GFP-Plasmid wurde mit und ohne MunI-Restriktionsstellen hergestellt. Das GFP-Plasmid wurde mit dem MunI-Plasmid gemischt und die GFP-Expression aufgezeichnet. Diese Experimente wurden in TxTl-Lösung ohne Liposomen durchgeführt. Der Grundsatzbeweis für das Infektionsexperiment, bei dem das MunI-Enzym extern hinzugefügt wurde, anstatt es in TxTl zu exprimieren, ist in den Abbildungen S16 und S17 dargestellt. Repräsentative Zeitverläufe der Proteinexpression sind in Abbildung S18 dargestellt. (c) Die MunI-Expression wurde durch Western-Blot-Analyse überwacht; Die Intensität der MunI-Bande wurde in denselben Proben wie die in Tafel (b) gezeigten Fluoreszenzergebnisse für die Serie „MunI-Stelle fehlt“ quantifiziert. Ein repräsentativer Western Blot des MunI-Restriktionsenzyms ist in Abbildung S19 dargestellt. (d) GFP-Fluoreszenz des Wirts gemischt mit Pathogen-Liposomen im unter der Datengrafik gezeigten Verhältnis. Das Wirts-GFP-Plasmid verfügt über zwei MunI-Restriktionsstellen. Repräsentative Zeitverläufe der Proteinexpression sind in Abbildung S20 dargestellt. Daten für Infektionsexperimente mit inkompatiblen Fusions-Tags sind in Abbildung S21 dargestellt. (e) Die Expression von MunI wurde mittels Western-Blot-Analyse während des Experiments für die in der Reihe „GFP-infiziert“ in Panel (d) gezeigten Proben verfolgt. (f) GFP-Fluoreszenz des Wirts gemischt mit Pathogen-Liposomen im unter der Datengrafik gezeigten Verhältnis. Das Wirts-GFP verfügt über keine MunI-Restriktionsstellen, was ihm Immunität gegen das Pathogenprotein verleiht. Repräsentative Zeitverläufe der Proteinexpression sind in Abbildung S22 dargestellt. (g) Die Expression von MunI wurde mittels Western-Blot-Analyse während des Experiments für die in der Serie „GFP-infiziert“ in Panel (f) gezeigten Proben verfolgt. Fehlerbalken auf allen Feldern zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte in den Feldern (d, f) werden auf die blaue Fluoreszenz des verwendeten Membranfarbstoffs normalisiert, um die Ergebnisse auf die Konzentration der Wirtszellen zu normalisieren. Die Fluoreszenz in Panel (b) wird für jede Probenserie auf 0 mM MunI-Plasmid normalisiert. Die Rautensymbole in den Feldern (d, f) heben einen bestimmten Zustand hervor und veranschaulichen am besten die Unterschiede in den Reaktionen auf die Infektion eines Wirts, der für das Erregerfeld (d) anfällig und gegen das Erregerfeld (f) immun ist. Bei allen Probenserien mit der Bezeichnung „GFP-infiziert“ handelt es sich um Experimente, bei denen Wirt und Krankheitserreger komplementäre DNA-Tags auf der Oberfläche hatten, was die Fusion der Liposomen ermöglichte, was als Infektion bezeichnet wird. Die mit „GFP gesund“ gekennzeichnete Serie zeigt Proben, bei denen Wirt und Krankheitserreger in den angegebenen Verhältnissen gemischt waren, aber keine komplementären Fusionsmarkierungen enthielten, was eine Infektion unmöglich machte.

Die Infektion einer synthetischen Zelle kann „tödlich“ sein und die Ressourcen der Wirtszelle erschöpfen, und solche Infektionen können „behandelt“ werden, um die Funktion wiederherzustellen.

Die oben genannten Experimente mit Parasiten und Krankheitserregern zeigten, dass synthetische Zellen als Modell für eine Infektion verwendet werden können, bei der ein Krankheitserreger die Ressourcen des Wirts kapert. Als nächstes beschlossen wir, ein Szenario zu untersuchen, in dem die Infektion dazu führt, dass der Stoffwechsel des Wirts nach der Expression des pathogenen Proteins nicht mehr funktioniert. In diesem Fall ist der Erreger vergleichbar mit einer Infektion mit einem Bakterium, das ein tödliches Toxin exprimiert, abzüglich des Replikationsaspekts des Wirts oder Parasiten, da sich diese synthetischen Zellen nicht replizieren (Abbildung 4a). Um dieses System zu konstruieren, haben wir uns für Hämolysin (aHL) entschieden, ein natürliches Toxin und Membranprotein, das in der synthetischen Zelltechnik weit verbreitet ist, um unspezifische Membranporen zu erzeugen.22,23 Wir verstehen die Ironie dieser Wahl, da aHL natürlicherweise von Staphylococcus aureus als exprimiert wird Das Protein wurde später genutzt, um den Membrantransport zu steuern und den synthetischen Zellstoffwechsel zu verlängern.24 Hier greifen wir wieder auf die Verwendung von aHL aufgrund seiner natürlichen Rolle als schädliches Toxin zurück, das bei einer Infektion entsteht. Ein weiteres bemerkenswertes Beispiel im Zusammenhang mit der Technik synthetischer Zellen für die Nutzung der Toxizität von aHL zur Auslösung des natürlichen Zelltods ist die Anwendung synthetischer Zellen als Krebstherapietechnologie.25 Als Beweis für das Prinzip haben wir festgestellt, dass eine hohe Konzentration von aHL in synthetischen Zellvesikeln exprimiert wird führt zum Austritt von Zellinhalt und zu einer deutlichen Abnahme der GFP-Expression innerhalb der Zelle. Dieser Effekt kann umgekehrt werden, wenn die Außenseite der Liposome alle für TxTl notwendigen kleinen Moleküle enthält (Abbildung 4b). In unserem Wirt-Pathogen-Modellsystem enthält der Wirt ein GFP-kodierendes Plasmid und der Krankheitserreger ein aHL-kodierendes Plasmid. Der Aufbau aller Infektionsexperimente ähnelt den oben beschriebenen Parasiten- und Krankheitserreger-Szenarien, wobei der Krankheitserreger kein T7-RNAP trägt und sowohl der Wirt als auch der Krankheitserreger mit DNA-Fusionsmarkierungen versehen sind. Interessanterweise beobachteten wir, dass bei niedrigeren Erregerkonzentrationen (der Erreger macht 25 oder 50 % der Gesamtpopulation aus) die Fluoreszenz des Wirts nur geringfügig abnimmt. Eine Erhöhung der Erregerkonzentration auf 75 % führt jedoch zu einer deutlichen Abnahme der GFP-Fluoreszenz des Wirts (Abbildung 4c). Wir spekulieren, dass dieses Ergebnis durch das relativ langsame Austreten von Nährstoffen aus synthetischen Zellen bei einer niedrigeren aHL-Konzentration verursacht werden könnte. Die GFP-Fluoreszenz wurde erst nach 12-stündiger Inkubation gemessen und GFP ist ein sehr stabiles Protein. Daher ist es möglich, dass bei niedrigeren aHL-Konzentrationen (geringere Menge an Krankheitserregern) der durch aHL verursachte Austritt von Nährstoffen langsam genug war, dass die Wirtszellen erhebliche Mengen an GFP ansammelten, bevor die Auswirkungen des durch aHL verursachten Austritts lähmend wurden der Stoffwechsel. Um die Ergebnisse des einfachen Wettbewerbs um Ressourcen zwischen dem Wirts- und dem Parasitengenom zu entkoppeln, führten wir „Infektion mit Rettung“-Experimente durch, bei denen der äußere Puffer alle kleinen Moleküle enthielt, aus denen die TxTl-Energie-, Aminosäure- und Salzmischungen bestehen. Dies wurde ähnlich wie die in Abbildung 4b getestete Bedingung „Nährstoffe draußen“ aufgebaut. Die Abnahme der Wirtsfluoreszenz in diesen Experimenten war ähnlich wie bei den früheren „Infektion ohne Rettung“-Proben mit 25 und 50 % Erregerkonzentrationen. Die Abnahme der Wirtsfluoreszenz bei 75 % des Erregers war deutlich geringer als die Abnahme, die bei Proben ohne Rettung beobachtet wurde (Abbildung 4d). Der große Unterschied in den Ergebnissen für das Experiment mit 75 % des Parasiten, wobei die Datenpunkte in Abbildung 4 (c, d) mit einem Stern hervorgehoben sind, scheint unsere Hypothese zu stützen, dass höhere aHL-Konzentrationen zu Beginn der Reaktion Schaden anrichten. Bei einer niedrigeren Pathogenkonzentration ist der Austritt langsam genug, dass sich das GFP des Wirts ansammelt (sowohl mit als auch ohne Ersatznährstoffe), sodass die beobachtete GFP-Fluoreszenz nach der Infektion hauptsächlich aufgrund der Konkurrenz um Ressourcen abnimmt. Bei höheren Pathogenkonzentrationen nimmt die GFP-Fluoreszenz in Proben mit externen Nährstoffen hauptsächlich aufgrund der Ressourcenkonkurrenz ab. Diese Experimente zeigen, dass wir synthetische Zellen zur Modellierung einer Infektion konstruieren können, was zu zwei unterschiedlichen Ergebnissen führt: dem metabolischen Nachteil der Infektion selbst (vermindertes GFP aufgrund der Ressourcenkonkurrenz) und einer „tödlicheren“ Infektion, die aus der Aufhebung der Proteinexpression des Wirts resultiert. Ermutigt durch diese Beobachtung beschlossen wir, ein System zu untersuchen, in dem synthetische Zellen einer pathogenen Infektion aktiv widerstehen können, und die metabolischen Nachteile einer solchen Reaktion zu untersuchen.

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Synthetische Zellen können mit einer von Bakterien inspirierten Strategie Infektionen abwehren.

Inspiriert von der bekannten Funktion von Restriktionsendonukleasen, Bakterien vor fremder DNA zu schützen, versuchten wir, diese Strategie in synthetischen Zellen anzuwenden. Wir haben das in Abbildung 2 dargestellte Parasitensystem erweitert: Zusätzlich zu GFP haben wir dem Wirt MunI-haltiges Plasmid hinzugefügt. Der Parasit enthielt wie in früheren Experimenten mCherry. Das mCherry-Plasmid enthält eine MunI-Restriktionsstelle (Abbildung 5a). Zunächst führten wir Proof-of-Principle-Experimente durch, um die metabolische Belastung durch die Expression von MunI auf dem Wirt zu bewerten. In diesen nicht eingekapselten TxTl-Experimenten überwachten wir die Expression von GFP und die Expression von mCherry, jeweils gemischt mit einer zunehmenden Menge an MunI- oder EcorI-Plasmid. Alle Gene standen unter der Kontrolle desselben T7-Promotors. Das GFP-Gen hatte eine EcorI-, aber keine MunI-Restriktionsstelle, und das mCherry-Gen hatte eine MunI-, aber keine EcorI-Restriktionsstelle. Wenn das Restriktionsenzymplasmid mit einem fluoreszierenden Proteinplasmid ohne Erkennungsstelle für dieses Restriktionsenzym gemischt wurde, nahm die Expression des fluoreszierenden Proteins proportional zum Anstieg des Restriktionsenzymplasmids ab, was auf eine Konkurrenz zwischen den beiden Plasmiden um TxTl-Ressourcen hinweist, wie bereits für GFP gezeigt und mCherry in Abbildung 2. Diese nichtschneidenden Paare waren GFP mit MunI (Abbildung 5b) und mCherry mit EcorI (Abbildung 5e). Wenn ein fluoreszierendes Protein mit einem Restriktionsenzym gepaart wurde, das in der Lage war, das Gen für dieses fluoreszierende Protein zu schneiden, sank die Fluoreszenz bei höheren Restriktionsenzym-Plasmidkonzentrationen deutlich auf nahezu Hintergrundwerte. Diese Schnittpaare waren GFP mit EcorI (Abbildung 5c) und mCherry mit MunI (Abbildung 5d). Dies deutete auf einen Rückgang der Fluoreszenz hin, der deutlich über den einfachen Wettbewerb um Ressourcen hinausgeht und dem in Abbildung 3 dargestellten Infektionsszenario ähnelt. Die MunI-Expression in Gegenwart von GFP verringert die GFP-Expression. Wenn wir GFP als Stellvertreter für den „Grundstoffwechsel“ des Wirts verwenden, kann MunI als metabolische Belastung des Wirts angesehen werden.

Abbildung 4. Der Wirt ist anfällig für eine „tödliche“ Infektion, aber der Wirt kann gerettet werden. (a) Der Wirt enthält GFP-Plasmid und der Krankheitserreger enthält Plasmid, das den Hämolysin (aHL)-Membrankanal kodiert. Nach der Infektion exprimiert der Wirt aHL, wodurch Poren in der Membran entstehen, wodurch Nährstoffe austreten und die Stoffwechselaktivität des Wirts abnimmt. (b) Grundsatzbeweis für einen Wirt, der aHL exprimiert (keine Infektion, Wirt wurde sowohl mit 5 nM GFP als auch der angegebenen Menge an aHL-Plasmid erzeugt). Der Wirt wurde in einem Puffer mit oder ohne Nährstoffe inkubiert (alle Komponenten der Energie-, Salz- und Aminosäuremischung, die zur Herstellung des zellfreien Translationssystems des Wirts verwendet wurde). Die optimale Reservenährstoffkonzentration wurde experimentell ermittelt, die Daten sind in Abbildung S23 dargestellt. (c) Infektion des Wirts mit dem Krankheitserreger, mit unterschiedlichen Mengen an Krankheitserreger pro Wirtszelle. Das Austreten kleiner Moleküle aus den „gesunden“ und „infizierten“ Zellen wurde direkt mit einem Farbstoff für kleine Moleküle gemessen. Die Daten sind in den Abbildungen S24 und S25 dargestellt. (d) Experimente, die diesen ähneln, sind in Tafel (c) dargestellt, aber der Außenpuffer enthält kleine Molekülnährstoffe, die den in Tafel (b) gezeigten „Nährstoffen außerhalb“ der Versuchsbedingungen ähneln. Fehlerbalken auf allen Feldern zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte in den Panels (b-d) werden auf die blaue Fluoreszenz des Membranfarbstoffs normalisiert, der zur Normalisierung des Signals auf die Konzentration der Wirtszellen verwendet wird. Die Rautensymbole in den Feldern (c, d) heben einen bestimmten Zustand hervor und veranschaulichen am besten die Unterschiede in der Reaktion auf die Infektion zwischen einem Wirt ohne äußere Nährstoffe (Feld (c)) und einem Wirt, der aufgrund des Vorhandenseins äußerer Nährstoffe immun gegen den Krankheitserreger ist (Feld (d). Für die Felder (c, d) ist die Serie „GFP-infiziert“ der Wirt, der mit dem Pathogen fusioniert ist, der das aHL-Protein trägt, und „GFP gesund“ ist der Wirt, der mit dem Pathogen fusioniert ist, der kein Plasmid trägt.

Wir fahren mit den Infektionsexperimenten fort und mischen den Wirt (mit GFP- und MunI-Plasmiden) mit einem Parasiten (mit mCherry-Plasmid). Wie zuvor haben wir Szenarien mit einer zunehmenden Menge an Parasiten in der Population untersucht (Abbildung 5f). Die Positivkontrolle nur eines Wirts, der mCherry exprimiert (mit EcorI anstelle von MunI, um die Stoffwechsellast auszugleichen) erstellte einen Maßstab für die theoretische maximale Menge an Pathogenprotein, die im Wirt exprimiert werden kann (Abbildung 5f). Mit zunehmender Parasitenmenge nahm die GFP-Fluoreszenz des Wirts ab, aber die Abnahme der Fluoreszenz des infizierten Wirts war deutlich geringer als die Abnahme der GFP-Expression, die in früheren Experimenten mit demselben Parasiten beobachtet wurde. Die GFP- und Parasiten-mCherry-Fluoreszenz dieses infizierten Wirts, der MunI exprimiert (Datenpunkt in Abbildung 5f mit einem Stern gekennzeichnet), kann direkt mit ähnlichen Infektionswirten ohne MunI (Datenpunkt in Abbildung 2e mit einem Stern gekennzeichnet) verglichen werden. Im Wirt, der MunI exprimiert, war das GFP des Wirts im gesunden Zustand zu Beginn mit einem absolut niedrigeren Niveau (da einige Ressourcen auf die Expression von MunI umgeleitet werden), aber nach der Infektion ist der Fluoreszenzabfall des Wirts viel weniger signifikant und der Wirt produziert viel weniger Parasiten-mCherry-Protein als im Fall, dass der Wirt kein MunI ausdrückt. Dieses Experiment zeigt den Vorteil, dass der Wirt einige Ressourcen für die Abwehr von Parasiten aufwendet. Dieses System könnte als ein sehr einfaches biochemisches Modell für Organismen angesehen werden, die Proteine ​​exprimieren, um sich gegen zukünftige Infektionen oder sogar schädliche Umweltfaktoren zu verteidigen. Der Wirt ist ursprünglich weniger robust (wenn wir die GFP-Expression als Maßstab für die Gesundheit des Wirts nehmen), aber im Falle einer Infektion machen sich die zusätzlichen Ressourcen, die der Wirt für die Expression von Abwehrproteinen aufgewendet hat, bezahlt und bieten Schutz vor dem infizierenden Parasiten. Daher haben wir in dieser einfachen, nicht lebenden synthetischen Zelle ein Beispiel für ein grundlegendes biologisches Wettrüsten rekonstruiert.

Abbildung 5. Wirtszellen verteidigen sich gegen Infektionen. (a) Die Wirtszellen enthalten zwei Plasmide: eines kodiert GFP (ohne MunI-Restriktionsstelle) und das andere kodiert das MunI-Restriktionsenzym (das „Parasitenresistenz“-Gen). Der Parasit enthält mCherry-Plasmid in einem System, das den in Abbildung 2 gezeigten Experimenten ähnelt. Die Infektion wird durch Fusion über DNA-Tags auf der Oberfläche des Wirts und des Parasiten vermittelt. Nach der Infektion wird das vom Parasiten eingeführte mCherry-Plasmid durch das MunI-Restriktionsenzym des Wirts verdaut. (b−e) Messung der metabolischen Kosten für die Ausprägung der Parasitenresistenz. Die Experimente finden in einem TxTl-Massensystem statt, das nicht in Vesikeln eingekapselt ist. In jedem Experiment wurde das fluoreszierende Proteinplasmid (GFP oder mCherry) mit dem Restriktionsenzymplasmid (MunI oder EcorI) in dem auf der x-Achse angegebenen Verhältnis für eine Gesamtplasmidkonzentration von 10 mM gemischt. GFP hat eine EcorI-Restriktionsstelle, aber keine MunI-Schnittstelle, und mCherry hat eine MunI-, aber keine EcorI-Restriktionsstelle. Die Trendlinie ist ein visueller Leitfaden, aber keine Datenanpassung. Fehlerbalken zeigen SEM, n=3 an. Kontrollexperimente mit gereinigten Restriktionsenzymen, anstatt sie aus einem Plasmid zu exprimieren, sind in Abbildung S26 dargestellt. Die Stabilität von Liposomen mit einer erhöhten Menge an Parasitenplasmid wurde ebenfalls gemessen, die Daten sind in Abbildung S27 dargestellt. (f) Infektion des Wirts mit einer zunehmenden Menge an Parasiten. „Wirts-GFP gesund“ ist die Expression von GFP aus Wirtszellen, die mit dem Parasiten ohne Plasmid fusioniert sind. „Wirt GFP infiziert“ ist der Wirt, der mit dem Parasiten fusioniert ist, der mCherry trägt. Bei der roten Fluoreszenz handelt es sich um mCherry-Fluoreszenz des mit dem Wirt fusionierten Parasiten (nur Daten des infizierten Wirts sind verfügbar. Die gesunden Wirtsproben trugen kein mCherry-Plasmid). Fehlerbalken auf allen Feldern zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte werden auf die blaue Fluoreszenz des verwendeten Membranfarbstoffs normiert, um die Ergebnisse auf die Konzentration der Wirtszellen zu normalisieren. Das Rautensymbol zeigt die Expression des Parasitenproteins unter bestimmten Infektionsbedingungen an und ist direkt vergleichbar mit dem in Abbildung 2e mit einem Stern hervorgehobenen Datenpunkt, einem Experiment unter denselben Bedingungen, aber mit einem Wirt, dem das MunI-Resistenzgen fehlt.

Abbildung 6. Impfung schützt vor Infektionen. (a) Der Wirt enthält GFP-Plasmid. Der Krankheitserreger in diesen Experimenten ist eines der drei in dieser Arbeit dargestellten Infektionsschemata: ein Parasit (wie in Abbildung 2 dargestellt), ein Krankheitserreger, bei dem das MunI-Restriktionsenzym das GFP-Genom des Wirts verdaut (wie in Abbildung 3 dargestellt), oder ein Krankheitserreger Der Transport des Membrankanals aHL führt dazu, dass Nährstoffe aus dem Wirt austreten (wie in Abbildung 4 dargestellt). In jedem Fall enthalten Wirt und Krankheitserreger komplementäre DNA-Fusions-Tags. Vor der Einführung des Pathogens wird der Wirt „geimpft“: mit überschüssigen ssDNA-Oligos inkubiert, die zu den Fusions-DNA-Tags auf der Oberfläche des Wirts komplementär sind (Tags, die mit denen auf dem Pathogen identisch sind, abzüglich der Cholesterineinheit, die zur Verankerung des Tags an der Membran des Wirts verwendet wird). der Erreger). Durch die Inokulation werden die Fusionsmarkierungen auf der Oberfläche des Wirts doppelsträngig und machen so eine Fusion mit dem Krankheitserreger unmöglich. (b) Der Grundsatznachweis für das Impfschema. Die Population von Liposomen, die GFP unter der Kontrolle des T7-RNA-Promotors, aber ohne T7-RNA-Polymerase tragen, wird mit Liposomen fusioniert, die T7-RNA-Polymerase enthalten. Das GFP-Protein kann nur exprimiert werden, wenn die beiden Populationen fusionieren. Einer oder beide der Mischungspartner wurden durch Inkubation mit einem DNA-Tag „geimpft“, der mit den Fusions-Tags auf der Oberfläche des Liposoms kompatibel war, wodurch die Fusions-Tags doppelsträngig und somit mit der Fusion inkompatibel wurden. Ein repräsentativer Zeitverlauf für die Proteinexpression ist in Abbildung S28 dargestellt. Kontrollexperimente ohne Fusions-Tags sind in Abbildung S29 dargestellt, Kontrollen mit inkompatiblen Fusions-Tags sind in Abbildung S30 dargestellt. Die Impf-Oligokonzentration wurde experimentell ermittelt, die Daten sind in Abbildung S31 dargestellt. (c) Parasiteninfektionsexperimente. Ein Wirt, der GFP trägt, wurde mit einem Parasiten, der mCherry trägt, fusioniert, wie in Abbildung 2 beschrieben. Der Wirt und der Parasit wurden mit einem unterschiedlichen Verhältnis von Wirt zu Parasit gemischt; Wirtszellen wurden entweder beimpft (mit doppelsträngigen DNA-Fusionsmarkierungen, die nicht mit der Fusion kompatibel sind) oder nicht beimpft (und daher anfällig für die Fusion mit dem Parasiten). mCherry-Fluoreszenz wird nur für Proben mit nicht inokuliertem Wirt gemeldet, da in den inokulierten Wirtsproben keine messbare mCherry-Fluoreszenz auftrat. Eine umgekehrte Inokulation wurde getestet, indem der Parasit anstelle des Wirts inokuliert wurde. Die Daten sind in Abbildung S32 dargestellt. (d) Infektionsexperimente mit dem Wirtsgenom, das für den das MunI-Restriktionsenzym tragenden Krankheitserreger anfällig ist, wie in Abbildung 3 beschrieben. Die infizierte Datenreihe stellt einen Wirt ohne Inokulation dar, und die inokulierte Datenreihe stellt Proben dar, bei denen der Wirt mit Inokulationsoligos inkubiert wurde. daher nicht anfällig für eine Fusion mit dem Erreger. (e) Infektionsexperimente mit dem Erreger, der das aHL-Gen trägt, führen dazu, dass aHL-Kanäle nach der Infektion Nährstoffe aus den Wirtszellen austreten lassen, wie in Abbildung 4 beschrieben. Die infizierte Datenreihe stellt den Wirt ohne Impfung dar und die inokulierte Datenreihe stellt Proben mit dar Wirt, der mit Inokulations-Oligos inkubiert wurde und daher nicht anfällig für eine Fusion mit dem Pathogen ist. Fehlerbalken auf allen Feldern zeigen SEM, n=3 an. Die Fluoreszenzwerte in den Feldern (c-e) werden auf die blaue Fluoreszenz des Membranfarbstoffs normalisiert, der verwendet wird, um die Ergebnisse auf die Konzentration der Wirtszellen zu normalisieren. Bei einigen in dieser Abbildung gezeigten Daten handelt es sich um Experimente mit einem Aufbau, der mit den in früheren Abbildungen gezeigten Experimenten identisch ist (wie in jeder Bildunterschrift angegeben). Diese Experimente wurden für diese Figur wiederholt, um Daten mit derselben TxTl-Charge zum direkten Vergleich der Ergebnisse zu erstellen und so die Variabilität der TxTl-Präparate von Charge zu Charge zu eliminieren.

Die Inokulation synthetischer Zellen verhindert eine Infektion.

Im oben beschriebenen Beispiel haben wir gezeigt, dass der Wirt sich gegen den Einfluss des Genoms eines Krankheitserregers wehrt, indem er ein zusätzliches Protein exprimiert. Als nächstes haben wir gefragt, ob es möglich ist, ein Szenario zu modellieren, in dem ein zuvor anfälliger Wirt durch einen Eingriff überhaupt erst immun gegen eine Infektion wird. Wir nannten es ein Impfmodell. Obwohl dies keine perfekte Analogie ist, haben wir uns auf den Aspekt konzentriert, dass die synthetische Wirtszelle keine Ressourcen für die Erzeugung von Immunität aufwendet. In unserem Immunisierungsmodell haben wir eine Behandlung entwickelt, die die synthetische Wirtszelle, die anfällig für Infektionen ist, in Zellen umwandelt, die nicht mit einem Krankheitserreger verschmelzen können. Das in diesem Artikel verwendete synthetische Zellfusionssystem basiert auf einzelsträngigen DNA-Tags, um die Liposomenmembranfusion zu induzieren. Um die Fusion mit einem Krankheitserreger zu verhindern, inkubierten wir die Zellen mit DNA-Oligonukleotiden, die zum Fusionsoligo auf der Oberfläche der Zellen komplementär waren (Abbildung 6a). Zunächst mussten wir bestätigen, dass die Impfung durch Inkubation mit komplementärem Oligo die Fusion aufhebt. In den Proof-of-Principle-Experimenten wurden zwei Populationen von Liposomen hergestellt: Eine Population hatte TxTl mit einem GFP-kodierenden Plasmid unter der Kontrolle des T7-Promotors und die andere Population hatte TxTl und T7-RNA-Polymerase, aber kein Plasmid. Nach der Fusion dieser beiden Populationen vermischte sich das GFP-Plasmid mit T7-RNA-Polymerase und induzierte die GFP-Expression. Wenn die beiden Populationen einzelsträngige und komplementäre Fusionsmarkierungen aufwiesen, kam es zu einer Fusion und es wurde GFP-Fluoreszenz nachgewiesen. Wenn eine oder beide Populationen mit einem zum Fusions-Tag komplementären Oligonukleotid inkubiert wurden, fand keine Liposomenfusion statt und GFP wurde nicht exprimiert (Abbildung 6b). Nachdem wir das Impfsystem etabliert hatten, führten wir die Impfung ein, um die synthetischen Wirtszellen in drei der zuvor in dieser Arbeit beschriebenen Infektionsszenarien zu schützen. Zunächst verwendeten wir das in Abbildung 2 beschriebene Parasitenszenario. Die Wirtszellen, die ein GFP-Genom enthielten, wurden mit einem Oligo geimpft, das zum Fusions-Tag auf der Oberfläche des Wirts komplementär war, und der Wirt wurde mit dem mCherry-Parasiten gemischt. Wir haben den Wirt mit dem Parasiten in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt. Unter allen Infektionsbedingungen war die Fluoreszenz des Parasiten mCherry nicht nachweisbar, wenn der Wirt geimpft war und die GFP-Fluoreszenz des inokulierten Wirts nicht abnahm. Die Kontrollexperimente mit dem nicht inokulierten Wirt zeigten erwartungsgemäß eine Abnahme der GFP-Expression des Wirts und einen Anstieg des Parasiten-mCherry-Signals (Abbildung 6c). Als nächstes wandten wir das Impfsystem auf einen Wirt an, der mit einem Krankheitserreger infiziert war, der ein genomkodierendes MunI-Restriktionsenzym trug, das in der Lage war, das GFP-Genom des Wirts zu verdauen, wie in den in Abbildung 3 gezeigten Experimenten. Der inokulierte Wirt zeigte keine Abnahme in der GFP-Fluoreszenz nach dem Mischen mit zunehmenden Mengen des Pathogens, während der nicht inokulierte Wirt infiziert war und die GFP-Fluoreszenz des Wirts proportional zur zunehmenden Menge des Pathogens abnahm (Abbildung 6d). Auch gegen den aHL-Erreger war die Impfung wirksam. Die inokulierten Wirte zeigten beim Mischen mit dem Pathogen keinen Rückgang der Fluoreszenz, während die GFP-Fluoreszenz des nicht inokulierten Wirts mit der Infektion deutlich abnahm (Abbildung 6e). In allen Fällen reichte dieses einfache Inokulationsverfahren, bei dem der Wirt mit einem DNA-Oligo komplementär zum Fusions-Oligo auf der Oberfläche des Wirts inkubiert wurde, aus, um die Fähigkeit der pathogenen synthetischen Zellen, die Wirtszellen zu infizieren, zu beseitigen. Daher haben wir ein einfaches physikalisch-chemisches Interventionsmodell demonstriert, das Wirtszellen vor Infektionen schützt.

Vorteile von Cistanche für Männer: Stärkung des Immunsystems

SCHLUSSFOLGERUNGEN

In diesem Artikel demonstrieren wir Methoden zur Verwendung synthetischer Minimalzellen zur Modellierung parasitärer und pathogener Infektionen. Die Motivation hinter unserer Arbeit war zweifach. Wir wollten komplexes, lebensähnliches Verhalten in synthetische Zellen einbauen und so das Ziel erreichen, synthetische Zellen zu entwickeln, die natürlichen lebenden Zellen ähnlicher sind. Wir wollten auch die Vorteile des einfachen und kontrollierbaren synthetischen Zellsystems nutzen, um die grundlegenden Eigenschaften von Infektions-, Impf- und Resistenzprozessen zu modellieren. Während sich synthetische Zellen nicht weiterentwickeln oder selbst replizieren, ermöglicht dieses System die Untersuchung der Infektionsdynamik in einem einfachen und leicht zu analysierenden Modell. Wir hoffen, dass die hier beschriebenen Infektionsprinzipien dazu beitragen, praktische und anwendbare Modelle für verschiedene Krankheitserreger und die Infektionsminderung zu erstellen. Die Untersuchung dieses vereinfachten synthetischen Zellsystems verdeutlichte die grundlegenden Wechselwirkungen zwischen dem Parasiten und dem Krankheitserreger. Obwohl synthetische Zellen (noch) nicht am Leben sind und nicht die Fähigkeit zur darwinistischen Evolution besitzen, ermöglicht uns dieses System die Beobachtung von Interaktionen zwischen Krankheitserregern und Wirten, ohne dass wir eine natürliche Immunität entwickeln oder die Virulenz des Krankheitserregers verändern können. Während die hier vorgestellte Wirtsinfektionsdynamik synthetische Zellen auf Bakterienbasis nutzt, ist dieses System nicht grundsätzlich auf bakterielles TxTl beschränkt. Man könnte sich sogar vorstellen, das hier vorgestellte System zur Modellierung der Infektionsdynamik in Populationen zu verwenden, die natürlichen Ökosystemen ähneln, und dabei die Einfachheit synthetischer Zellen zu nutzen, um die Interaktionen zwischen verschiedenen Mitgliedern großer Populationen vollständig zu kontrollieren und zu untersuchen.

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