Teil 1:Acteosid wirkt Interleukin-1 --induzierten katabolischen Prozessen durch die Modulation Mitogen-aktivierter Proteinkinasen und des zellulären NFκB-Signalwegs entgegen

Acteoside wirkt Interleukin-1 --induzierten katabolischen Prozessen durch die Modulation von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen und dem zellulären NFκB-Signalweg entgegen

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang, 1 Jeong-Yeon Seo, 1,2 Seung Sik Cho, 3 Younghee Yun, 4,5 Ye-yong Choi, 4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh, 6 Deuk-Sil Oh, 6 Hong-Sung Chun, 2 und Jae-Sung Kim 1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1 Institute of Dental Science, Chosun University, Gwangju 61452, Republik Korea

2Departments of Biomedical Science, Chosun University, Gwangju 61452, Republik Korea

3Department of Biomedicine, Health & Life Convergence Sciences, BK21 Four, College of Pharmacy, Mokpo National University,

Jeonnam 58554, Republik Korea

4Chung-Yeon Medical Institute, Gwangju 61949, Republik Korea

5Forschungs- und Entwicklungsinstitut, CY Pharma Co., Seoul 06224, Republik Korea

6Jeollanamdo Forest Resources Institute, Naju, Jeollanamdo, 58213, Republik Korea

Die Korrespondenz ist an Jae-Sung Kim zu richten; js_kim@chosun.ac.kr

Eingegangen am 2. Juli 2020; Überarbeitet am 15. Februar 2021; Angenommen am 6. März 2021; Veröffentlicht am 25. März 2021

Akademischer Herausgeber: Joël R. Drevet

Copyright © 2021 HyangI Lim et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der CreativeCommonsAttributionLicense vertrieben wird,

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Osteoarthritis (OA) ist die häufigste degenerative Gelenkerkrankung mit chronischen Gelenkschmerzen, die durch eine fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels an Synovialgelenken verursacht wird.Acteosid, ein Caffeoylphenylethanoidglykosid, hat verschiedene biologische Aktivitäten wie antimikrobielle, entzündungshemmende, krebshemmende, antioxidative, zytoprotektive und neuroprotektive Wirkung. Weiterhin kann die orale Verabreichung vonActeosidbei hoher Dosierung verursacht keine Genotoxizität. Ziel der vorliegenden Studie ist es daher, die antikatabole Wirkung von zu verifizierenActeosidgegen Arthrose und seinen antikatabolen Signalweg.Acteosidverringerte nicht die Lebensfähigkeit von Maus-Fibroblasten L929-Zellen, die als normale Zellen und primäre Ratten-Chondrozyten verwendet wurden.Acteosidwirkten dem IL-1 --induzierten Proteoglykanverlust in den Chondrozyten und im Gelenkknorpel entgegen, indem sie die Expression und Aktivierung knorpelabbauender Enzyme wie Matrix-Metalloproteinase- (MMP-) 13, MMP-1 und MMP{{ 6}}. Außerdem,Acteosidunterdrückten die Expression von Entzündungsmediatoren wie induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase, Cyclooxygenase -2, Stickstoffmonoxid und Prostaglandin E2 in den mit IL-1 behandelten primären Ratten-Chondrozyten. Anschließend wurde die Expression entzündungsfördernder Zytokine um verringertActeosidin den primären Chondrozyten der Ratte, die mit IL-1 behandelt wurden. Darüber hinaus unterdrückte Acteosid nicht nur die Phosphorylierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen in primären Ratten-Chondrozyten, die mit IL-1 behandelt wurden, sondern auch die Translokation von NFκB aus dem Zytosol in den Zellkern durch Unterdrückung seiner Phosphorylierung. Die orale Verabreichung von 5 und 10 mg/kg Acteosid schwächte die fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels im osteoarthritischen Mausmodell ab, die durch die Destabilisierung des medialen Meniskus erzeugt wurde. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass Acteosid ein vielversprechender potenzieller antikataboler Wirkstoff oder eine Ergänzung ist, um die fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels abzuschwächen oder zu verhindern.

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1. Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist die häufigste degenerative Gelenkerkrankung mit chronischen Gelenkschmerzen, die durch eine fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels an Synovialgelenken verursacht wird [1].

Aufgrund der gestiegenen Lebenserwartung wird die Prävalenz von OA mit Mobilitätsverlust und chronischen Gelenkschmerzen, die durch eine fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels an den Synovialgelenken verursacht werden, auf 18 Prozent bei Frauen nach der Menopause und 9,6 Prozent bei Männern geschätzt [2 ]. Obwohl die weltweite Prävalenz von OA jährlich zunimmt, ist die pathophysiologische Ätiologie von OA noch unbekannt. Sie kann durch sehr komplexe und multifaktorielle Risikofaktoren wie Alterung, Geschlecht, genetische Vererbung, traumatische Gelenkverletzung und schwere mechanische Gelenkbelastung verursacht werden. Weiterhin sind die neuropathologischen Zusammenhänge zwischen fortschreitender Degeneration des Gelenkknorpels und der Entstehung chronischer Gelenkschmerzen unbekannt [3]. Daher ist das Ziel der klinischen Behandlung von Patienten mit OA die Aufrechterhaltung der Körpermobilität und der mechanischen Gelenkfunktion durch Linderung chronischer Gelenkschmerzen unter Verwendung pharmakologischer und nichtpharmakologischer Ansätze und Gelenkersatzoperationen. Die Nachfrage nach der Entwicklung einer wirksamen Intervention oder Supplementierung mit langfristiger biologischer Sicherheit zur Verhinderung oder Abschwächung von OA zur Aufrechterhaltung der Lebensqualität durch Aufrechterhaltung der mechanischen Gelenkfunktion in der älteren Bevölkerung nimmt zu.

Wie in Abbildung 1 gezeigt,Acteosid(CAS-Nr. 61276-17-3; C29H36O15) ist ein Caffeoylphenylethanoid-Glycosid, das aus mehreren Kräuterpflanzen wie Verbascum-Chloriden [4], Buddleja globosa [5] und Plantago australis [6] isoliert wird. Acteoide hat verschiedene biologische Aktivitäten wie antimikrobielle [5], entzündungshemmende [7], krebshemmende [8], antioxidative [9], zytoprotektive [9] und neuroprotektive Wirkung [10]. Weiterhin kann die orale Verabreichung vonActeosidbei hoher Dosierung verursacht keine Genotoxizität[11].

Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Acteosid mit entzündungshemmender biologischer Sicherheit antikatabole Wirkungen hat, die mit dem Schutz des Gelenkknorpels vor fortschreitender Degeneration des Gelenkknorpels durch Unterdrückung katabolischer Faktoren wie entzündungsfördernder Zytokine, Entzündungsmediatoren und knorpelabbauender Enzyme in Synovialgelenken verbunden sind . Daher war das Ziel dieser Studie, die zu untersuchenAkteosid-induzierte antikatabole Wirkungen und ihren zellulären Signalweg sowohl in vitro unter Verwendung von primären Chondrozyten, die aus dem Gelenkknorpel des Rattenkniegelenks isoliert wurden, als auch in vivo unter Verwendung eines OA-Tiermodells, das durch chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus im Kniegelenk von Mäusen erzeugt wurde.

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2. Methoden

2.1. Zellkultur.

Primäre Chondrozyten von Ratten wurden gemäß dem von der Institution genehmigten Protokoll (CIA-CUC2019-A0027) aus dem Gelenkknorpel von Kniegelenken von Ratten (5- Tage alt; Sprague-Dawley) isoliert Animal Care and Use Committee der Chosun University, Gwangju, Republik Korea. Isolierte primäre Ratten-Chondrozyten wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, USA), Antibiotika (50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin) und 50 ug/ml Ascorbinsäure. Die normale Maus-Fibroblasten-L-929-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Gemäß den Anweisungen von ATCC wurden L-929-Zellen in Eagle's Minimum Essential Medium mit 10 Prozent FBS kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5 Prozent CO2 gezüchtet.

2.2. Zelllebensfähigkeitsassay.

Der Dimethyl-Thiazolyl-Diphenyl-Tetrazolium-Salz (MTT)-Assay wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit von Zellen der Maus-Fibroblasten-Zelllinie L929, die als normale Zelle verwendet wurden, und primärer Ratten-Chondrozyten, die mit Acteosid behandelt wurden, zu bewerten. Kurz gesagt, L929-Zellen und primäre Ratten-Chondrozyten wurden bei einer Zelldichte von 8 × 10 5 Zellen/ml in Kulturplatten für 24 h kultiviert und dann mit 2,5, 5, 10, 25, 50 und 100 μM behandeltActeosidfür 24h. Nach der Behandlung mit MTT-Lösung wurden sowohl L929-Zellen als auch Chondrozyten weitere 4 h kultiviert. Nach der Inkubation wurden die gebildeten MTT-Kristalle vollständig in Dimethylsulfoxid suspendiert und die Extinktion bei 570 nm unter Verwendung eines Spektrometers (Epoch-Mikroplatten-Spektrophotometer, BioTek®, Winooski, VT, USA) gemessen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen.

2.3. Zell-lebend/tot-Assay.

Das Zellüberleben wurde unter Verwendung des Cell Live/Dead-Assay-Kits (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) durchgeführt, das aus grünem Calcein-AM zur Markierung lebender Zellen (mit grüner Fluoreszenz) und Ethidium-Homodimer -1 zur Markierung toter Zellen besteht Zellen (mit roter Fluoreszenz). Kurz gesagt wurden sowohl L929-Zellen als auch primäre Ratten-Chondrozyten bei einer Zelldichte von 8 × 10 5 Zellen/ml auf Kammerobjektträgern (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™-System; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) für 24 h kultiviert und dann mit behandelt 50 und 100 μM Acteosid für 24 h. Nach der Kultivierung wurde ein Zellüberlebensassay gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Danach wurden gefärbte Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY) abgebildet.

2.4. Dimethylmethylenblau (DMMB)-Assay.

Der DMMB-Assay wurde durchgeführt, um die Veränderung des Proteoglykangehalts in primären Ratten-Chondrozyten zu bewerten, die 21 Tage lang in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-1 mit Acteosid behandelt wurden. Um die Eigenschaften primärer Ratten-Chondrozyten für 21 Tage aufrechtzuerhalten, wurden primäre Ratten-Chondrozyten (2 × 10 6 Zellen) in 1 ml 1,2-prozentigem Alginat suspendiert und dann eingekapselt, indem die Zell/Alginat-Suspension in eine Lösung von 105 mM CaCl 2 getropft wurde. Die in Alginat eingekapselten primären Ratten-Chondrozyten wurden 24 h in DMEM/F12 (mit 10 % FBS, 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin und 50 ug/ml Ascorbinsäure) kultiviert und dann für 24 h in DMEM/F12 mit 1 % adaptiert Mini-Insulin-Transferrin-Selen (Mini-ITS) und 50 ug/ml Ascorbinsäure. Anschließend wurden die Chondrozyten mit 50 oder 100 μM behandeltActeosidin An- oder Abwesenheit von 1 ng/ml IL-1 für 21 Tage. Am Tag 21 wurden die primären Chondrozyten der Ratte zur Bestimmung des Proteoglykangehalts unter Verwendung des DMMB-Assays gesammelt, wie zuvor beschrieben [12]. Um den Proteoglykangehalt pro Zelle zu quantifizieren und die Proliferation von primären Rattenchondrozyten zu bewerten, wurden die Zellzahlen außerdem durch einen DNA-Assay unter Verwendung von PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL -1 für 7 Tage. Am Ende der Kultivierungsperiode wurden die Proben gesammelt und für die histologische Analyse 72 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert.

2.6. Histologische Analyse.

Eine histologische Analyse mit Safranin-O und Fast-Green-Färbung wurde durchgeführt, um den Proteoglykanverlust im Gelenkknorpel zu verifizieren, der mit 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL -1 für 7 Tage behandelt wurde. Kurz fixierte Gelenkknorpelproben wurden in Ethylendiamintetraessigsäure entkalkt und anschließend in Paraffin eingebettet. Danach wurden die präparierten Paraffinblöcke, die Gelenkknorpel enthielten, seriell auf 5 μm Dicke geschnitten und auf Objektträger gelegt. Anschließend wurde eine Safranin-O- und Fast-Green-Färbung durchgeführt, um den Proteoglykanverlust in der Grundsubstanz des Gelenkknorpels zu beurteilen. Zusätzlich wurde eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung durchgeführt, um die allgemeine Morphologie des Gelenkknorpels zu beobachten.

2.7. Western-Blotting.

Western Blotting wurde durchgeführt, um die Expression von katabolischen Faktoren zu untersuchen, einschließlich MMP-13, MMP-1, MMP-3, induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS) und Cyclooxygenase-2 (COX -2) und die Veränderung zellulärer Signalmoleküle wie Mitogen-aktivierte Proteinkinasen und Kernfaktor-kappa B (NFκB). Kurz gesagt, primäre Chondrozyten von Ratten wurden 24 Stunden lang mit 50 oder 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL -1 behandelt. Danach wurden primäre Chondrozyten der Ratte durch Zentrifugation geerntet und unter Verwendung von Lysepuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers lysiert. Um die Kerntranslokation von NFκB zu verifizieren, wurden außerdem primäre Chondrozyten der Ratte mit 50 oder 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL -1 für 24 Stunden behandelt. Danach wurden zytosolische und nukleare Fraktionen unter Verwendung von NE-PER™ Nuklear- und zytoplasmatischen Extraktionsreagenzien (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Konzentration des aus primären Ratten-Chondrozyten extrahierten Gesamtproteins wurde unter Verwendung eines Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kits (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Zusätzlich wurde das konditionierte Medium gesammelt, um die Konzentrationen von knorpelabbauenden Enzymen, die von Chondrozyten ausgeschieden wurden, nachzuweisen. Gleiche Mengen an Protein und konditioniertem Medium wurden einer Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und dann auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Danach wurde Western Blotting unter Verwendung gezielter Primärantikörper gegen MMP{-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, Phospho-ERK1/2, gesamt, durchgeführt -ERK1/2, Phospho-p38, Gesamt-p38, Phospho-JNK, Gesamt-JNK, Phospho-NFκB, Gesamt-NFκB, -Aktin und Lamin B. Immunreaktive Banden wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenzsystems (Thermo Scientific, Rockford , IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und dann abgebildet durch ein Microchemi-Gerät (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel).

2.8. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR).

Primäre Rattenchondrozyten wurden mit 50 oder 100 μM behandeltActeosidin Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 für 24 Stunden. Danach wurde Gesamt-RNA aus den primären Chondrozyten der Ratte unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Gesamt-RNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) gemessen. Um cDNA zu synthetisieren, wurde 1 μg RNA unter Verwendung eines ThermoScript-Reverse-Transkription-PCR-Systems (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. qPCR von cDNA wurde unter Verwendung von 2 × TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Republik Korea) und spezifischen Primern auf einem TaKaRa PCR Thermal Cycler Device (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) durchgeführt. Danach wurden die PCR-Produkte auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um die Expressionsniveaus von Zielgenen zu bestimmen. Als endogene Kontrolle wurde Glyceraldehyd-3--phosphatdehydrogenase (GAPDH) verwendet. Zusätzlich wurde für die qRT-PCR cDNA unter Verwendung eines Eco™ Real-Time PCR-Systems (illumine Inc., San Diego, CA, USA) amplifiziert. -Actin wurde als endogene Kontrolle verwendet. Die Sequenzen der in der qPCR und qRT-PCR verwendeten Primer sind in den Tabellen 1 bzw. 2 zusammengefasst.

2.9. Gelatine Zymographie.

Gelatine-Zymographie wurde durchgeführt, um die Aktivierung von MMPs in primären Chondrozyten der Ratte zu beurteilen. Kurz gesagt, primäre Ratten-Chondrozyten wurden 24 Stunden lang mit 50 oder 100μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 behandelt. Danach wurde ein gleiches Volumen an konditioniertem Medium auf einem 10-prozentigen Polyacrylamidgel, das mit 0,2 Prozent (1 mg/ml) Schweinehautgelatine copolymerisiert war, einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in Zymogramm-Renaturierungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl und 0,05 % Brij-35) bei 37 Grad für 72 Stunden inkubiert. Nach der Renaturierung von MMPs wurde das Gel mit 0,1 Prozent Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt. Gelatinolytische Banden wurden als klare Banden auf einem gleichmäßig hellblau gefärbten Hintergrund sichtbar und dann unter Verwendung einer Digitalkamera abgebildet.

2.10. Messung von Stickoxid (NO).

Primäre Ratten-Chondrozyten wurden mit 50 oder 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 für 24 Stunden behandelt. Danach wurden 50 ul des konditionierten Mediums mit jeweils 50 ul Sulfanilamid und N-1--Naphthylethylendiamindihydrochlorid umgesetzt. Die Extinktion wurde dann bei einer Wellenlänge von 540 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA) gemessen.

2.11. Prostaglandin E2 (PGE2)-Assay.

Primäre Rattenchondrozyten wurden mit 50 oder 100 μM behandeltActeosidin Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 für 24 Stunden. Danach wurde die PGE2-Konzentration unter Verwendung eines PGE2-Parameter-Assay-Kits (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

2.12. Zytokin-Array.

Primäre Ratten-Chondrozyten wurden mit 50 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 für 24 Stunden behandelt. Danach wurden Gesamtproteine ​​extrahiert und wie zuvor beschrieben quantifiziert [13]. Als nächstes wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) ein Zytokin-Array durchgeführt, um die Veränderung der Zytokinproduktion zu untersuchen.

2.13. Kerntranslokationsassay.

Primäre Rattenchondrozyten wurden mit 50 und 100 ug/ml behandeltActeosidin Gegenwart von 10ng/ml IL-1 . Nach 30 Minuten wurden primäre Ratten-Chondrozyten mit 1 % Paraformaldehyd fixiert, in 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und ausgiebig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Unspezifische Signale wurden mit normalem Ziegenserum blockiert. Nach mehrfachem Waschen wurden die Chondrozyten mit Kaninchen-anti-NFκB-Antikörpern inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) über Nacht bei 4 Grad. Danach wurden gefärbte Zellen unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopsystems (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) in der Gwangju-Niederlassung des Korea Basic Science Institute (Gwangju, Republik Korea) abgebildet.

2.14. Generation osteoarthritischer Tiere.

Um osteoarthritische Tiere zu erzeugen, wurde der mediale Meniskus (DMM) in den Kniegelenken von BALB/c-Mäusen (durchschnittliches Körpergewicht 19:3±0:5g) gemäß den IACUC-Richtlinien (CIACUC{{4}) chirurgisch destabilisiert. }A0029). Die OA-induzierten Tiere wurden oral mit jeweils 5 und 10 mg/kg Acteosid, aufgelöst in 5 % Ethanol (experimentelle Gruppe; n =5) oder Vehikel (5 % Ethanol) (DMM-Gruppe; n =5) behandelt anderen Tag für 8 Wochen. Am Ende der Kulturperiode wurden die Kniegelenke präpariert und unter Verwendung von 5 % Paraformaldehyd für 7 Tage fixiert, um histologische Bewertungen durchzuführen. Nach Safranin-O- und Fast-Green-Färbung wurden abgebildete Gelenkknorpelgewebe gemäß dem Mankin-Grad untersucht [14, 15].

2.15. Statistische Analyse.

Die Versuchsdaten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse verglichen, gefolgt von Post-hoc-Mehrfachvergleichen (Tukey-Test) unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 25 (IBM Corp.). Alle Daten, außer der Tierstudie, wurden erhalten aus drei unabhängigen Experimenten.

ActeosidinZistanche

3. Ergebnisse

3.1. Acteosid hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von L929-Zellen und primären Ratten-Chondrozyten.

Die als normale Zellen verwendete Maus-Fibroblasten-Zellinie L929 wurde mit 2,5, 5, 10, 25, 50 und 100 &mgr;M Acteosid für 24 h behandelt. Danach wurde der MTT-Assay durchgeführt, um die Cytotoxizität von Acteosid auf L929-Zellen zu bewerten. Wie in 2(a) gezeigt, wurden die relativen Lebensfähigkeiten von L929-Zellen mit 94:8 ± 8 Prozent, 93:6 ± 7 Prozent, 100 ± 5 Prozent, 103:9 ± 5 Prozent, 126:1 ± 8 Prozent bestimmt und 122:7 ± 4 Prozent bei 2,5, 5, 10, 25, 50 bzw. 100 μM Acteosid, verglichen mit der Kontrolle (100:02 ± 3 Prozent). Um die Zytotoxizität von Acteosid auf primäre Ratten-Chondrozyten zu verifizieren, wurde der MTT-Test wie in Fig. 2(b) gezeigt durchgeführt. Die Lebensfähigkeiten von primären Rattenchondrozyten, die mit 2,5, 5, 10, 25, 50 und 100 μM Acteosid behandelt wurden, wurden mit 114 ± 4 Prozent, 117:8 ± 6 Prozent, 123:9 ± 5 Prozent, 132:6 ± 4 Prozent bestimmt. 153:1 ± 7 Prozent bzw. 142:1 ± 6 Prozent, verglichen mit der Kontrolle (100:4 ± 5 ​​Prozent). Um die Wirkung von Acteosid auf die Lebensfähigkeit sowohl von L929-Zellen als auch von primären Ratten-Chondrozyten zu bestätigen, wurde außerdem ein Cell-Live/Dead-Assay durchgeführt, wie in Abbildung 2(c) gezeigt. Die Anzahl der als rote Fluoreszenz gefärbten toten Zellen stieg weder bei L929-Zellen noch bei primären Chondrozyten der Ratte, die 24 Stunden lang mit 50 und 100 μM Acteosid behandelt wurden. Diese Daten zeigten durchweg, dass die definierte Dosierung vonActeosidbeeinflusste die Lebensfähigkeit von L929-Zellen und primären Chondrozyten der Ratte nicht. Daher wurden 50 μM Acteosid und 100 μM Acteosid, die sowohl in L929-Zellen als auch in primären Ratten-Chondrozyten nicht toxische Dosen sind, verwendet, um seine antikatabolischen Wirkungen in vitro-Studien mit primären Ratten-Chondrozyten zu verifizieren.

3.2. Acteosid wirkt IL-1 --induziertem Proteoglykanverlust in primären Ratten-Chondrozyten entgegen.

In Alginatkügelchen eingebettete primäre Ratten-Chondrozyten wurden 21 Tage lang mit 50 und 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 ng/ml IL- 1 behandelt. Danach wurde ein DMMB-Assay durchgeführt, um die Veränderung des Proteoglykangehalts zu bewerten, wie in 3(a) gezeigt. Die relativen Proteoglykangehalte wurden als 88:3 ± 18:1 Prozent und 86: 8 ± 16:3 Prozent in den primären Ratten-Chondrozyten bestimmt, die mit 50 bzw. 100 μM Acteosid behandelt wurden, verglichen mit der Kontrolle (103:8 ± 32:3 Prozent). Obwohl der relative Proteoglykangehalt durch Acteosid verringert wurde, waren diese Ergebnisse nicht signifikant. Der relative Proteoglykangehalt verringerte sich jedoch signifikant um 37:1 ± 14:7 Prozent in den primären Rattenchondrozyten, die mit 1 ng/ml IL -1 behandelt wurden, aber 50 und 100 μM Acteosid reduzierten den Proteoglykangehalt signifikant um 57 ± 12:4 Prozent bzw. 64 ± 14:5 Prozent in Gegenwart von 1 ng/ml IL-1 . Um anschließend zu verifizieren, ob Acteosid den IL-1 --induzierten Proteoglykanverlust unterdrückt, wurde aus Rattenkniegelenken präparierter Gelenkknorpel mit 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL-1 für 7 Tage behandelt. Danach wurden histologische Bewertungen unter Verwendung von H&E-Färbung und Safranin-O und Fast-Green-Färbung durchgeführt, wie in Abbildung 3(b) gezeigt. Die morphologische Veränderung wurde bei der H&E-Färbung nicht beobachtet; Safranin-O- und Fast-Green-Färbung zeigten jedoch, dass sich das rot gefärbte Proteoglykan in den mit 100 μM Acteosid behandelten Gelenkknorpeln im Vergleich zur Kontrolle nicht veränderte. Allerdings wurde durch 10 ng/ml LIL-1 im Gelenkknorpel ein schwerer Proteoglykanverlust induziert, und 100 μM Acteosid unterdrückten den Proteoglykanverlust im mit 10 ng/ml IL- 1 behandelten Gelenkknorpel signifikant. Insgesamt zeigen diese Daten übereinstimmend, dass Acteosid eine antikatabole Wirkung hat, die die Degeneration des Gelenkknorpels verzögert, indem es dem IL-1 --induzierten Proteoglykanverlust entgegenwirkt.

ActeosidinZistanchegute Wirkung haben aufAntioxidans

3.3. Acteosid hat eine antikatabole Wirkung, die die MMP-Expression und -Aktivierung in primären Ratten-Chondrozyten unterdrückt, die mit IL -1 behandelt wurden.

Um zu untersuchen, ob der Acteosid-induzierte antikatabole Effekt mit der Unterdrückung der MMP-Expression und -Aktivierung verbunden ist, wurden primäre Ratten-Chondrozyten mit 50 und 100 μM Acteosid in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml IL -1 für 24 Stunden behandelt. Danach wurden die Veränderungen in MMPs untersucht. Wie in Abbildung 4(a) gezeigt, war die Expression knorpelabbauender Enzyme wie MMP-13, MMP-1 und MMP-3 in den konditionierten Medien der Primärratte signifikant erhöht Chondrozyten, die mit 10 ng/ml IL-1 behandelt wurden, wurde um verringertActeosiddosisabhängig. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse sowohl der qPCR (Abbildung 4(b)) als auch der qRT-PCR (Abbildung 4(c)), dass IL-1 die mRNA-Spiegel von MMPs wie MMP-13, MMP{ {6}} und MMP-3 in den primären Chondrozyten der Ratte. Sie nahmen jedoch in den primären Chondrozyten der Ratte, die mit 50 und 100 μM Acteosid behandelt wurden, dosisabhängig ab. Darüber hinaus unterdrückten 50 und 100 μM Acteosid wirksam die Aktivierung von MMPs in den primären Chondrozyten der Ratte, die mit 10 ng/ml IL-1 behandelt wurden (Abbildung 4(d)). Zusammengenommen weisen diese Daten übereinstimmend darauf hin, dass Acteosid eine antikatabole Wirkung hat, die die Expression und Aktivierung knorpelabbauender Enzyme unterdrückt.