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Katharina Artinger', Alexander H. Kirsch', Agnes A. Mooslechner', Daniel J. Cooper23, Ida Aringer', Max Schuller', Corinna SchabhüttI', Konstantin A. Klötzer', Kerstin Schweighofer', Philipp Eller, Hideo Yagita', Anna L. Illert', Alexander R. Rosenkranz', Peter J. Lane2 und Kathrin Eller

Cistanche kann sehr gut bei der Nierenfunktion helfen

'Klinische Abteilung für Nephrologie, Abteilung für Innere Medizin, Medizinische Universität Graz, Graz, Österreich; Medical Research Council Centre for Immune Regulation, Institut für biomedizinische Forschung, Universität Birmingham, Birmingham, UK; Abteilung für globale und tropische Gesundheit, Menzies School of Health Research und Charles Darwin University, Darwin, Northern Territory, Australien; Intensivstation, Klinik für Innere Medizin, Medizinische Universität Graz, Graz Österreich: „Department of Immunology, School of Medicine Juntendo University, Tokyo, Japan; und Degree Department of Medicine l, Medical Center-Universität Freiburg, Medizinische Fakultät, Universität Freiburg, Freiburg, Deutschland

Die Co-Stimulation ist eine Voraussetzung für die pathogene Aktivität bei T-Zell-vermittelten Erkrankungen und es wurde gezeigt, dass sie eine Toleranz bei der organspezifischen Autoimmunität als therapeutisches Ziel erreicht. Hier haben wir die Beteiligung der Tumornekrosefaktor-Familienmitglieder CD30 und OX40 an Immunkomplex-vermittelten untersuchtNiere Erkrankung. In-vitro-Stimulations- und Proliferationsstudien wurden mit CD4-Plus-Zellen von Wildtyp- und CD30/OX40-Double-Knock-out-Mäusen (CD30OX40) durchgeführt. In-vivo-Studien wurden durch Induktion einer nephrotoxischen Serumnephritis in Wildtyp-, CD30OX40-, CD30'-, OX40-Grad-, rekonstituierten Rag1- und C57B1/6J-Mäusen durchgeführt, die mit CD30L-aOX40L-Antikörpern behandelt wurden. CD30, OX40 und ihre Liganden wurden bei nephrotoxischer Serumnephritis auf verschiedenen Leukozyten hochreguliert. CD30OX40-Mäuse, aber nicht CD30/oder OX40-Mäuse waren vor nephrotoxischer Serumnephritis geschützt. Ein ähnlicher Schutz wurde in Rag1-Mäusen gefunden, denen CD4 plus T-Zellen von CD30OX40'-Mäusen injiziert wurden, im Vergleich zu Rag1"-Mäusen, denen CD4T-Zellen von Wildtypmäusen injiziert wurden. Darüber hinaus zeigten CD4 plus T-Zellen, denen CD30OX40 fehlt, eine verringerte Expression von CCR6 in vivo. CD30OX40*-Zellen voll fähig waren

Differenzierung in krankheitsvermittelnde T-Helferzell-Untergruppen, zeigten jedoch signifikant verringerte Proliferationsniveaus in vivo und in vitro im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Die Blockierung von Antikörpern gegen CD30L und OX40L verbesserte die nephrotoxische Serumnephritis, ohne die Populationen von Paneffektor- oder Gedächtnis-T-Zellen zu beeinträchtigen. Somit weisen unsere Ergebnisse auf eine Krankheitspromotion über CD30- und OX40-Signalgebung aufgrund der Erleichterung einer übertriebenen T-Zell-Proliferation und Migration von T-Helfer-17-Zellen bei nephrotoxischer Serumnephritis hin. Daher könnte die Co-Stimulationsblockade, die auf die CD30- und X40-Signalwege abzielt, eine neue therapeutische Strategie bei Autoimmunerkrankungen darstellenNierenerkrankung.

Übersetzungserklärung

Dieser Artikel beschreibt die Anwendbarkeit von CD30- und OX40-Signalwegen als zukünftige therapeutische Ziele bei Immunkomplex-vermittelten glomerulären Erkrankungen unter Verwendung des Mausmodells der nephrotoxischen Serumnephritis. Die kombinierte Blockade der kostimulatorischen CD30- und OX40-Wege ist ein Weg, um eine periphere Toleranz bei Autoimmunität zu erreichen, indem die pathogene Hyperproliferation in sekundären lymphatischen Organen und die Migration von pathogenen T-Helferzellen zu den 17 Zellen reduziert wirdNiere. Da traditionelle Behandlungsoptionen mit schweren Nebenwirkungen einhergingen, würde eine kombinierte CD30- und OX40-Blockade im Vergleich zu traditionellen immunsuppressiven Therapien möglicherweise zu weniger lebensbedrohlichen Infektionen führen.

Kostimulatorische Signalübertragung ist eine Voraussetzung für T-Zell-Aktivierung, -Differenzierung, -Effektorfunktion und -Überleben. Die Blockierung der Kostimulation wurde als Strategie identifiziert, um eine Immuntoleranz zu erreichen. Neben der Ig-Superfamilie, einschließlich CD28 und B7, sind die kostimulatorischsten Moleküle Mitglieder der evolutionär alten und hochkonservierten Tumornekrosefaktor(TNF)-Superfamilie." CD30 und OX40 sind entzündungsfördernde Mitglieder der TNF-Superfamilie, die nicht nur gemeinsame Signalwege teilen, sondern auch wirken auch funktionell synergistisch.TNF-Rezeptor-assoziierte Faktoren interagieren mit intrazellulären Rezeptorregionenund fördern in beiden Fällen das Zellüberleben über Nu-Dear-Faktor-KB-Signalisierung.CD30 und OX40 sowie ihre Liganden CD30L und OX40L können auf T und exprimiertwerden B-Zellen und auf einer Vielzahl antigenpräsentierender Zellen.

CD30 spielt eine entscheidende entzündungsfördernde Rolle bei murinem Autoimmundiabetes, Colitis und Enzephalomyelitis.-1 Untersuchungen von experimentellen Modellen haben pathogene Rollen für OX40 bei Autoimmun-Uveitis, Arthritis und allergischen Entzündungen ergeben,12-1 während ein kürzlich veröffentlichter Bericht schlugen den OX40/OX40L-Weg vor, um vor sichelförmiger Glomerulonephritis durch Stimulierung der regulatorischen T-Zell-Proliferation zu schützen. Beide Moleküle wurden jedoch unabhängig voneinander mit der Pathogenese des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in Verbindung gebracht. Lösliches CD30 ist ein Marker für die Krankheitsaktivität bei SLEl6,17 a und ein OX40L-Haplotyp ist mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung der Krankheit verbunden.8 Darüber hinaus exprimieren T-Helferzellen 17(Th17)-Zellen erhöhte OX40-Spiegel bei SLE-Patienten und Die OX40-Expression ist auf perivaskulären Leukozyten bei Lupusnephritis nachweisbar.

Wirksame therapeutische Optionen zur Behandlung der Glomerulonephritis sind mit einer erhöhten Morbidität und einem hohen Risiko für Nebenwirkungen verbunden1; daher ist eine gezieltere Therapie erforderlich. Ein wachsender Ansatz bei der Bekämpfung von Immunantworten ist die Induktion von Toleranz.] Therapeutische Optionen zum Erreichen peripherer Toleranz umfassen klonale Deletion, Ignoranz, Immunregulation und schließlich Energie, die sich bereits als wertvolle immunsuppressive Strategie erwiesen hat, wenn zytotoxische T-Lymphozyten- assoziiertes Protein 4-lg-Fusionsproteine ​​wurden eingeführt.

Die OX40L-Blockade befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung; das kombinierte Targeting von CD30 und OX40 wurde jedoch bisher nicht umfassend untersucht. Die CD4--abhängige Autoimmunität hängt entscheidend von der Interaktion beider Rezeptor-Liganden-Paare ab, was durch die Notwendigkeit einer kombinierten Aufhebung der CD30- und OX40-Signalgebung demonstriert wird, um Forkhead-Box-P3(FoxP3)-defiziente Mäuse davor zu schützen, früh letal zu werden Autoimmunerkrankung. Nephrotoxische Serumnephritis (NTS) ist ein murines Modell der Immunkomplex-Glomerulonephritis, von dem gezeigt wurde, dass es strikt von T-Zellen abhängig ist, einschließlich T-Helferzellen 1 (Th1) und Th17-Zellen. Die Antigenpräsentation findet in diesem Modell primär in sekundären lymphatischen Organen statt, aber auch lokal innerhalb derNiere. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Aktivierung der CD30- und OX40-Kostimulationswege vermutlich NTS fördert.

METHODEN Tiere

CD30OX407-Doppel-Knockout-Mäuse mit CD30- und OX40-Mangel wurden wie zuvor beschrieben erzeugt.' CD30OX40-- und CD30OX40 plus /Wurfgeschwister-Kontrollen sowie CD30~ und OX40~ wurden im eigenen Haus gezüchtet. CD30√-Mäuse wurden auch von Dr. Alert, Freiburg, Deutschland, bereitgestellt. C57BL/6J-Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) erhalten. Ragland B6.Thyl.1-Mäuse wurden von Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Alle Mäuse hatten einen C57BL/6J-Hintergrund.

NTS-Modell

NTS wurde wie zuvor beschrieben induziert. Kurz gesagt wurden Mäuse mit 2 mg/ml Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), gelöst in unvollständigem Freund-Adjuvans (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mit getrocknetem, nicht lebensfähigem Mycobacterium tuberculosis H37a (Difco Laboratories, Detroit, MI) 3 Tage vor der Verabreichung von nephrotoxischem Kaninchen-Anti-Maus-Serum. Die Auswertung erfolgte, wie angegeben, nach 4 oder 14 Tagen nach der Injektion des NTS-Serums.

Zellübertragung in Rag1-/Mäusen

Lappen1--Mäusen wurden 1,5 × 10 Grad CD4 plus T-Zellen aus der Milz von entweder Wildtyp(WT)- oder CD30OX40---Mäusen oder CD90.1-WT-Zellen und CD90.2-Knockout-Zellen injiziert adoptiv im Verhältnis 1:1 übertragen. Einen Tag nach dem adoptiven Transfer wurde NTS induziert und nach 4 oder 14 Tagen ausgewertet. CD4 plus T-Zellen wurden aus Milzen unter Verwendung des Maus-CD4 plus-Zellisolationskits (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) isoliert.

Experimente mit blockierenden Antikörpern

Nephritische C57BL/6-Mäuse wurden mit blockierenden Antikörpern gegen Maus-OX40L(Klon RM134L) und CD30L(Klon RM153) behandelt, entweder in Kombination oder allein, beginnend am Tag der Immunisierung oder 3 Tage danach NTInduktion. Den Mäusen wurden dreimal pro Woche entweder 0,5 mg x-OX40L- und/oder 0,5 mg a-CD30L-monoklonale Antikörper oder 1 mg Kontroll-IgG (Sigma-Aldrich) ip injiziert.

Albumin-, Kreatinin- und Zytokin-Überstandsmessung im Urin

Ein Doppelsandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Abcam, Cambridge, MA) wurde zur Bestimmung der Albuminausscheidung im Urin verwendet, wie zuvor berichtet (Nachweisbereich, 0,781-200 ng/ml). Urin-Kreatinin wurde photometrisch unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Pikrinsäure-basierten Kits (Sigma-Aldrich) bestimmt. Der Cytokin-Nachweis in den Überständen wurde wie in den ergänzenden Methoden angegeben durchgeführt.

Bewertung der autologen Antikörperantwort

Die Platten wurden über Nacht mit 100 ug/ml Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) inkubiert. Danach wurde Serum in seriellen Verdopplungsverdünnungen zum Nachweis von zirkulierendem Maus-Anti-Kaninchen-Ig inkubiert. Unter Verwendung von mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) wurde Maus-Anti-Kaninchen-IgG nachgewiesen.

Blutharnstoffstickstoff

Blutharnstoffstickstoff

(BUN)-Spiegel im Serum wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen kolorimetrischen BUN-Nachweiskits (Invitrogen) erhalten.

Bewertung der Histopathologie und Immunpathologie

Auswertung von Perjodsäure-Schiff (PAS)-gefärbtNiereAbschnitten wurde wie zuvor beschrieben1,2 und in den ergänzenden Methoden durchgeführt.

Eine 3--Schichten-Immunperoxidase-Färbetechnik wurde zur Bewertung von gewebeinfiltrierenden Zellen verwendet (Ergänzungsmethoden).

Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie

Gefrorene Gewebeproben wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (Supplementary Methods) gefärbt und auf einem LSM510 meta (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) ausgewertet.

Abbildung 1| CD30, OX40, CD30-Ligand (CD30L) und OX40-Ligand (OX40L) werden unterschiedlich auf Milzleukozyten bei nephrotoxischer Serumnephritis (NTS) exprimiert. Expression von CD30, OX40, CD30L und OX40L auf CD4 plus T-Zellen in gesunden und nephritischen C57Bl/6J-Mäusen nach 12 Stunden, 24 Stunden, 72 Stunden, 7 Tagen und 14 Tagen NTS (n =5 Mäuse/ Gruppe). Die Expression der jeweiligen Rezeptoren und Liganden wurde auf (a) CD4 plus T-Zellen, (b) CD8T-Zellen, (c) B-Zellen, (d) CD11cdendritischen Zellen, (e) CD11bLv6G plus SSChi-Neutrophilen, (f）CD11btLy6GCD115) bewertet plus Ly6C plus klassische Monozyten und (g) CD11btLy6G-CD115 plus Ly6C nicht-klassische Monozyten.Alle Daten zeigen Median- und Interquartilbereiche.Statistische Signifikanz wird im Vergleich zu gesunden Mäusen bereitgestellt.*P<><><0.001,><>

Durchflusszytometrie

Die Lyse der roten Blutkörperchen unter Verwendung der 1× RBC Lysis Buffer Solution (eBioscience) wurde mit Blutproben durchgeführt, bevor eine Einzelzellsuspension aus Blut, Milz und Lymphknoten unter Verwendung von 70-um-Zellsieben gewonnen wurde. Zellisolation ausNierenwurde unter Verwendung von Percoll-Dichtegradientenzentrifugation nach Aufschluss von fein zerkleinertem Hackfleisch durchgeführtNierenin Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit Collagenase D und DNAse I, bei 37 Grad, wie zuvor beschrieben.

Durchflusszytometrie-Färbungen und -Auswertungen wurden wie in den ergänzenden Methoden beschrieben durchgeführt.

CD4 plus T-Zell-Proliferationsassay

CD4-plus-T-Zellen wurden mit Celltrace Violet (CellTrace Violet Cell Proliferation Kit; Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers inkubiert und bei 2,5 × 10/ml zur Inkubation mit entweder 5 ug/ml Concanavalin-A (Sigma-Aldrich) oder 5 ug/ml Phytohämagglutinin (Sigma-Aldrich). Nach 7 Tagen wurde Durchflusszytometrie verwendet, um die Intensität von Celltrace Violet in diesen Zellen zu bewerten.

Splenozytenstimulation

Splenozyten von nephritischen Mäusen, die mit Isotyp-Antikörpern oder xCD30LxOX40L-Antikörpern behandelt wurden, wurden nach 14 Tagen NTS geerntet. Splenozyten wurden mit 2 × 10 %/ml in mit Kaninchen-IgG vorbeschichtete Vertiefungen ausgesät und vor der Durchflusszytometrie 24 Stunden lang restimuliert. Splenozyten von nephritischen WT- und CD30OX40-Mäusen (Tag 14) wurden mit 2 × 1097 ml ausgesät und mit xCD3 (5 ug/ml) und xCD28 (1 ug/ml) (beide von eBioscience) für 3 Tage stimuliert, bevor der Zellkulturüberstand bewertet wurde .

CD4 plus T-Zell-Polarisationsexperimente

CD4 plus CD62L plus T-Zellen wurden aus Milzen unter Verwendung des CD4 plus CD62L plus Isolationskit II (Miltenyi Biotec) isoliert und wie in den ergänzenden Methoden angegeben stimuliert.

Reverse Transkription Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion Gesamt-RNA wurde aus Lymphknoten extrahiert undNierenunter Verwendung von TRI Reagenz (Sigma-Aldrich) und anschließend wurde cDNA unter Verwendung von Superscript II Transcription Kit (Invitrogen) und Zufallsprimern (Invitrogen) für die reverse Transkription von 2 &mgr;g Gesamt-RNA synthetisiert. Die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion wurde doppelt auf einem CFX96 Real-Time System (BioRad, Hercules, CA) durchgeführt. TaqMan-Gen

Abbildung 2| CD30OX40--Mäuse sind vor nephrotoxischer Serumnephritis (NTS) geschützt. CD30OX40-/-Mäuse, CD30-Single-Knockout-Mäuse und OX40-Single-Knockout-Mäuse sowie Wildtyp (WT)-Kontrollen (n =5-6-Mäuse pro Gruppe) wurden 14 Tage NTS unterzogen , (a) Albuminurie und (b) Serum-Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Spiegel wurden ausgewertet. (ce) Repräsentative Periodsäure-Schiff (PAS)-gefärbtNieren, sowie PAS-Scores, (f) Halbmond-Score, (g) intralaminare Thromben-Score, (h) tubuläre Gipsbildung und (i) akute tubuläre Verletzungs-Score, sind gezeigt. () Niereninfiltrierende CD68 plus T-Zellen, (k) Neutrophile, () CD4T-Zellen und (m) CD8 plus T-Zellen werden bereitgestellt. Die Gesamtzellzahlen und die Zahlen von CD45-plus-CD4-T-Zellen in (n) Lymphknoten und (o) der Milz von WT- und CD30OX40-/-Mäusen wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. (p) Gesamtzahl der renalen Leukozyten, bewertet durch Durchflusszytometrie und (g) Prozentsätze von CD4 plus T-Zellen, CD8 plus T-Zellen, Ly6G plus SSChi-Neutrophile, Ly6C plus Monozyten und Ly6C-Monozyten inNierenvon CD30OX40- und W-Mäusen. (r) Maus-anti-Kaninchen-IgG wurde bewertet (n=10 Mäuse/Gruppe). (s) Die Gesamtzahlen von CD4-plus-CD28-plus-Zellen/Lymphknoten von nephritischen WT- (n=7-Mäusen) und CD30OX40-/(n =5-Mäusen)-Mäusen sind gezeigt. Originalvergrößerung × 40. Daten zeigen (a, b, r, s) Mittelwert ± SEM; (c,fg) Mediane sind durch eine horizontale Linie gekennzeichnet. Die Daten sind repräsentativ für 4 unabhängige Experimente. Es werden statistische Signifikanzen im Vergleich zu WT-Mäusen angegeben.*P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

Expressionsassays (Applied Biosystems, Foster City, CA) und SYBR green (BioRad) wurden verwendet (Ergänzungsmethoden).

statistische Analyse

Alle statistischen Auswertungen (Ergänzungsmethoden) wurden mit GraphPad Prism 6.0 für Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA) durchgeführt.

Ethik-Erklärung

Alle Tierversuche wurden vom Ausschuss für Ethik der Tierversuche des österreichischen Bundesministeriums für Tierversuche genehmigt (BMWFW-66.010/0054-WF/V/3b/2015).

ERGEBNISSE

Die Expression von CD30 und OX40 und ihrer Liganden ändert sich im Zeitverlauf von NTS auf Zellen der angeborenen und adaptiven Immunität. Die CD30- und OX40-Expression nahm auf CD4 plus T-Zellen der Milz im Zeitverlauf von NTS zu (Abbildung 1a). Sowohl die CD30L- als auch die OX40L-Expressionsniveaus waren auf Milz-CD4-plus-T-Zellen von nephritischen Mäusen nach 7 und 14 Tagen signifikant erhöht (Fig. 1a). Auf CD4*CD25Foxp3 plus regulatorischen T-Zellen (Tregs) wurde im Laufe der Zeit ein ähnlicher Anstieg der CD30-, CD30L- und OX40-Expression festgestellt (ergänzende Abbildung S1A). CD30, OX40 und OX40L waren auf Th17-Zellen (ergänzende Abbildung S1D) nach 14 Tagen NTS im Vergleich zu gesunden Mäusen signifikant erhöht. Auch CD30 und OX40 waren auf CD8-T-Zellen ab 12 Stunden nach NTS-Induktion im Vergleich zu gesunden Mäusen signifikant erhöht (Abbildung 1b). B-Zellen zeigten ein ähnliches Expressionsprofil wie CD4 plus T-Zellen (Abbildung 1c). OX40L wurde bereits nach 12 Stunden NTS herunterreguliert und blieb danach auf dendritischen Zellen verringert (Abbildung 1d). In ähnlicher Weise waren CD30L und OX40L Down-CD11b plus Ly6G plus SSChineutrophile, reguliert auf Ly6G-CD115 plus Ly6Ct und Ly6G-CD115Ly6C-Monozyten über den Zeitverlauf von NTS (Abbildung Bein). Auf Neutrophilen, dendritischen Zellen und Monozyten neigten CD30 und OX40 dazu, in NTS anzusteigen (Abbildung ld-g). CD30L wurde 12 Stunden nach NTS-Induktion zunehmend auf angeborenen Lymphoidzellen vom Typ 2 exprimiert, und CD30L und OX40L waren auch nach 14 Tagen NTS erhöht (ergänzende Abbildung S1B). Die Anzahl der Leukozyten, die CD30, CD30L, OX40 und OX40L exprimieren, stieg bei NTS an, was mit den Befunden zu Milzzellen übereinstimmte (ergänzende Abbildung SIE-G). Die mRNA-Expression von CD30 und Ox40l war in nicht nachweisbarNierennach 7 und 14 Tagen NTS (ergänzende Abbildung S1H). Die Cd301-mRNA war jedoch nach 7 und 14 Tagen NTS erhöht, während die Ox40-mRNA-Expression nach 14 Tagen NTS unverändert bliebNieren(Ergänzende Abbildung S1H).

Die gegenseitige CD30- und OX40-Signalgebung ist für die Entwicklung des NTS-Phänotyps erforderlich

Wir fanden eine verringerte Albuminurie und BUN bei nephritischen CD30OX40-/-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen (Abbildung 2a und b), wohingegen die Albuminurie bei CD30-- und OX40--Mäusen mit WT-Kontrollmäusen vergleichbar war (Abbildung 2a). Eine signifikante Abnahme wurde auch in beobachtetNierePAS-Positivität, Halbmondbildung, Punktzahl für intraluminale Thromben, Tubulusgussbildung und Punktzahl für akute tubuläre Verletzungen bei CD30OX40-/-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen (Abbildung 2c-i). Alle diese histologischen Merkmale waren bei einzelnen Knockout-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen nicht signifikant verändert (Abbildung 2c und fi). Wir fanden eine signifikant geringere Anzahl von CD68-Makrophagen in den Nieren von CD30OX40---Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen (Abbildung 2j). Es gab einen Trend zu einer geringeren Anzahl vonNiere-Infiltration von CD68 plus Makrophagen in CD30-- und OX40-/- Single-Knockout-Mäusen (Abbildung 2j). Neutrophile und CD8-T-Zellen wurden in signifikant reduzierter Anzahl gefundenNierenvon CD30OX40--Mäusen im Vergleich zu nephritischen WT-Kontrollen, und CD30--- sowie OX40--Mäuse zeigten eine geringere Anzahl von Neutrophilen und C8 plus T-Zellen, die die Nieren infiltrieren (Abbildung 2k und m). CD4 plus T-Zellen wurden in signifikant geringerer Zahl bei Nephritikern gefundenNierenvon CD30OX40--(Abbildung 2l). Die Durchflusszytometrie der Nieren ergab ähnliche Ergebnisse einer reduzierten Anzahl infiltrierender Zellen (Abbildung 2p und q). Bemerkenswert ist, dass naive Single- und Double-Knockout-Mäuse keine Unterschiede in der Milzleukozytenzusammensetzung im Vergleich zu gesunden WT-Mäusen zeigten, wenn CD4 plus und CD8 plus T-Zellen, Neutrophile und Monozyten ausgewertet wurden (ergänzende Abbildung S2). Der Icos- und Gitr-Ausdruck wurde reduziertNierenvon nephritischen CD30OX40--Mäusen (ergänzende Abbildung S3B). B-Zell-Antworten, gemessen durch Maus-Anti-Kaninchen-IgG, waren bei CD30OX40--Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen reduziert (Abbildung 2r).

CD4 plus T-Zellzahlen sind in Lymphknoten von CD30OX40-/-Mäusen nicht reduziert

Die Durchflusszytometrie zeigte keinen Unterschied in der Gesamtlymphknoten- und Milzzellularität ( 2n und o) oder in der Anzahl von CD4-Plus-Zellen. Interessanterweise haben wir auch keine Unterschiede in Tregs zwischen WT- und CD30OX40--Mäusen festgestellt (ergänzende Abbildung S3). Bemerkenswert sind Zytokine (TNF-d, Interleukin-6, Interferon-Y, Interleukin-17, Interleukin-4 und Interleukin-10), gemessen in Überständen von restimulierten Splenozyten, isoliert aus WT- und CD30OX40--Mäuse zeigten 14 Tage nach NTS keinen Unterschied (Daten nicht gezeigt).

CD4-plus-T-Zellen mit CD30- und OX40-Mangel können NTS nicht fördern Um die Rolle der CD30- und OX40-Expression auf CD4-plus-Zellen bei NTS zu untersuchen, wurden Rag1- CD4-plus-Zellen (ergänzende Abbildung S4) aus der Milz von beiden injiziert WT oder CD30OX40-/Mäuse. Die Gesamtzahl der Milz-CD4 plus -Zellen und die Raten toter Zellen waren am 4. Tag nach der NTS-Induktion vergleichbar (ergänzende Abbildung S5). Obwohl Rag1~-Mäuse, die CD4-plus-Zellen von WT-Mäusen erhielten, nach 14 Tagen NTS eine signifikante Albuminurie und BUN entwickelten, war dies bei Rag1-/-Mäusen, die mit CD4-plus-Zellen von CD30OX40-Mäusen rekonstituiert wurden (Abbildung 3a), nicht der Fall. Der histologische Schaden war bei Ragl1--Mäusen, die CD4 plus T-Zellen von CD30OX40---Mäusen erhielten, im Vergleich zu WT-Zellen signifikant reduziert, wie durch PAS-Scoring, Crescent-Score, Score für intraluminale Thromben, Score für akute tubuläre Verletzungen, und röhrenförmige Abgüsse (Abbildung 3b-g). Zellen infiltrierenNierenvon Ragl-Mäusen, einschließlich CD4-Plus-Zellen, CD68-Makrophagen und Ly6G-Plus-Neutrophilen, waren ebenfalls signifikant reduziert, wenn übertragene CD4-Plus-Zellen CD30 und OX40 nicht exprimierten (Abbildung 3h-k).CD4-Plus-T-Zellen, die aus WT-Mäusen isoliert wurden, die CD90 exprimieren .1- und CD30OX40--Mäuse, die CD90.2 exprimieren, wurden weiter adoptiv auf Rag1-/Mäuse in einem Verhältnis von 1:1 übertragen. Hierin waren die absoluten Zahlen von CD90.2 exprimierenden CD30OX40-- CD4 plus T-Zellen in der Milz im Vergleich zu CD90.1 WT CD4 plus T-Zellen verringert (Abbildung 4t und u), aber die Prozentsätze von Ifn-Y (Abbildung 4a und b), l4 (Abbildung 4d und e) und Il17 (Abbildung 4g und h) produzierende Zellen waren signifikant höher in CD90.2 exprimierenden Knockout-Zellen. Gleichzeitig wurde jedoch festgestellt, dass verringerte Prozentsätze von CD90.2-Knockout-Zellen in Nieren im Vergleich zu CD90.1-WT-Zellen einen Th17-Phänotyp aufweisen (Abbildung 4i), während das Gegenteil für The- und T-Helferzellen 2 (Th2) festgestellt wurde ) Zellen einNieren(Abbildung 4c und f). Dennoch sind die absoluten Zahlen der übertragenen CD90.2-Knockout-Zellen imNierewaren im Vergleich zu CD90.1-WT-Zellen signifikant niedriger (Daten nicht gezeigt).

CD30- und OX40-Mangel stört die Th17-Migration von sekundären lymphatischen Organen zu den Nieren

Der CXC-Chemokinrezeptor (CXCR)3 (Abbildung 4j und k) war auf CD90.2-CD30OX40-/--Zellen im Vergleich zu CD90.1-WT-Zellen erhöht, während für die CXCR6-Expression (Abbildung 4l und m) keine Unterschiede festgestellt wurden . Noch wichtiger ist, dass wir eine signifikante Abnahme des CC-Chemokinrezeptors (CCR)6 auf CD90.2-Knockout-Zellen fanden (Abbildung 4n und o). Im nächsten Schritt wurden naive CD4-plus-T-Zellen in vitro unter Th1- oder Th17-Differenzierungsbedingungen stimuliert ( Ergänzende Abbildung S6). Wir beobachteten einen Trend zu einem größeren Potenzial für die Th17- (Abbildung 5a und) und Th1-Differenzierung (Abbildung 5c ​​und d) von naiven CD4 plus T-Zellen, die aus CD30OX40-/--Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu WT-Mäusen in vitro. Bemerkenswerterweise wurden CD4 plus T-Zellen, die CD28 exprimieren, signifikant erhöht gefunden

Abbildung 3| Rag1-/Mäuse, die CD4 plus T-Zellen von CD30OX40- erhalten/sind vor nephrotoxischer Serumnephritis (NTS) geschützt. Rag1-/Mäuse, die CD4-T-Zellen von beiden Wildtypen (WT ) oder CD30OX40--Mäuse wurden NTS unterzogen und 14 Tage lang nachbeobachtet (n =6 bis 7 Mäuse pro Gruppe).(a) Albuminurie und Serum-Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Spiegel wurden bewertet.( e) Repräsentative Perjodsäure-Schiff(PAS)-gefärbtNierensowie (b) PAS-Scores, (C) Crescent-Score, (d) Thrombi-Score, (t) Tubulusabgüsse und (g) Score für akute tubuläre Verletzungen sind gezeigt. (h) Anzahl von CD4T-Zellen (i) CD68 plus Makrophagen , und (j)Ly6Gt-Neutrophile sowie (k) repräsentative Bilder sind gezeigt. Originalvergrößerung × 40 (PAS-, CD4-, [Fortsetzung]-Zahlen in Lymphknoten von nephritischen CD30OX40-/-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen (Abbildung 2s).

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