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Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' und Olivia Lenoir'

„Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Frankreich; und Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Paris, Frankreich

Der starke prädiktive Wert der Proteinurie bei chronischen Glomerulopathien ist fest etabliert, ebenso wie die pathogene Rolle von Angiotensin II, das das Fortschreiten einer glomerulären Erkrankung mit einer veränderten glomerulären Filtrationsbarriere, Podozytenverletzung und Vernarbung der Glomeruli fördert. Hier fanden wir heraus, dass chronischer Angiotensin-II-induzierter Bluthochdruck den Autophagiefluss in Mausglomeruli hemmte. Die Deletion von Atg5 (ein Gen, das für ein an der Autophagie beteiligtes Protein codiert) speziell im Podozyten führte zu einer beschleunigten Angiotensin-I-induzierten Podozytopathie, akzentuierter Albuminurie und Glomerulosklerose. Dies deutet darauf hin, dass die Autophagie in diesem Zustand ein wichtiger Schutzmechanismus im Podozyten ist. Angiotensin-II-induzierte Calpain-Aktivität in Podozyten hemmt den Autophagiefluss. Podozyten von Mäusen mit transgener Expression des endogenen Calpain-Inhibitors Calpastatin zeigten zu Studienbeginn eine höhere Podozyten-Autophagie, die gegen Angiotensin-II-abhängige Hemmung resistent war. Auch eine anhaltende Autophagie mit Calpastatin begrenzte Podozytenschäden und Albuminurie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Bluthochdruck pathogene Wirkungen auf die glomeruläre Struktur und Funktion hat, teilweise durch die Aktivierung von Calpainen, was zu einer Blockade der Podozyten-Autophagie führt. Diese Ergebnisse decken einen originellen Mechanismus auf, bei dem Angiotensin-Il-vermittelte Hypertonie die Autophagie über eine kalziuminduzierte Rekrutierung von Calpain mit pathogenen Folgen im Falle eines Ungleichgewichts durch Calpastatin-Aktivität hemmt. Daher könnte die Verhinderung einer Calpain-vermittelten Abnahme der Autophagie eine vielversprechende neue therapeutische Strategie für Nephropathien sein, die mit einer hohen Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems verbunden sind.

CistancheDeserticola verhindertNiereErkrankung

Übersetzungserklärung

Angesichts der entscheidenden Rolle der Autophagie bei der Entwicklung vonNiereKrankheitenkönnte die pharmakologische Modulation der Autophagie eine vielversprechende Strategie für die Prävention und Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen sein. Parallel dazu wurde festgestellt, dass eine Überaktivierung der Calpain-Aktivität in Podozyten schädliche Auswirkungen auf die Podozytenfunktion hat, während ihre schädlichen Wirkungsmechanismen nicht identifiziert wurden. Hier liefern wir Beweise dafür, dass Calpain die schädliche Wirkung von Angiotensin II mit der schädlichen Blockade der Autophagie in Podozyten in Verbindung bringt, und schlagen vor, dass die Hemmung von Calpain ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Podozytenerkrankungen sein könnte, teilweise durch Aufrechterhaltung der Podozytenautophagie.

Bluthochdruck ist nach Diabetes die zweithäufigste Ursache für progressive ErkrankungenchronischNiereErkrankung- und selbst eine geringfügige Erhöhung des Blutdrucks ist ein unabhängiger Risikofaktor für eine Nierenerkrankung im Endstadium. Eine zunehmende Anzahl experimenteller Studien hat die Bedeutung von Podozyten bei der Entwicklung von hervorgehobenNiereVerletzung. Ein fortschreitender Verlust von Podozyten und mikrovaskuläre Veränderungen treten früh mit dem Funktionsabfall der Niere bei der experimentellen hypertensiven Nephropathie auf. Bei Patienten wurde gezeigt, dass die Ausscheidung lebensfähiger Podozyten im Urin ein sensitiver und spezifischer Marker für Präeklampsie ist, und Patienten mit Nephrosklerose hatten eine signifikant geringere Dichte an glomerulären Podozyten als Nierenspender. Darüber hinaus ist die pathogene Rolle von Angiotensin II (Angel), die das Fortschreiten einer glomerulären Erkrankung fördert, gut etabliert, nicht nur bei hypertensiven Zuständen, sondern auch bei mehreren glomerulären Erkrankungen.

Glomerulärer Bluthochdruck führt zu glomerulärer Kapillardehnung, Endothelschädigung und erhöhter glomerulärer Proteinfiltration, was zu glomerulärem Kollaps und Glomerulosklerose führt. Es übt auch eine direkte Wirkung auf glomeruläre Strukturen aus und verursacht signalisierende regulatorische Reaktionen, die auf eine Kompensation abzielen. Ein aktiviertes systemisches und lokales Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) fördert die mesangiale Hyperplasie und die Synthese von vaskulären Permeabilitätsfaktoren. Gleichzeitig zeigen Podozyten Calciumsignale und modifizieren ihre Form am AnglI-Rezeptor Typ 1 (AT1)-28Diese Anpassungsmechanismen sind stimulationsabhängig.24-28 Langfristig werden sie maladaptiv und führen schließlich zu Glomerulosklerose. AT1 vermittelt eine herausragende RAAS-Beteiligung für den Blutdruck und die Salz- und Wasser-Homöostase. Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer und AT1-Blocker werden klinisch zur Behandlung von Bluthochdruck und Herzinsuffizienz bei Patienten eingesetzt. Interessanterweise zeigen beide Blocker auch eine Schutzwirkung aufNiereFunktion.

Es wurde gezeigt, dass die Autophagie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wesentlich ist, insbesondere bei postmitotischen und insbesondere bei Podozyten.1- Autophagie ist ein cll9olysosomal-assoziiertes Abbausystem für langlebige zytoplasmatische Proteine ​​und dysfunktionale Organellen55 und beinhaltet die Sequestrierung von Proteinen und Organellen in Autophagosomen. Die Bildung von Autophagosomen hängt von der Induktion mehrerer Gene ab, darunter Mapllc3a/b, Berlin 1 und Atgs. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass eine Dysregulation des autophagischen Signalwegs an der Pathogenese von beteiligt istNiereAlterung und mehrereNiereKrankheiten wie akute Nierenschädigung, polyzystische Nierenerkrankung, Alterung und diabetische Nephropathie.

Die Regulation der Autophagie in Podozyten, im physiologischen und vor allem im pathologischen Kontext, ist wenig bekannt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Podozyten-Autophagie unter physiologischen Bedingungen unabhängig vom mechanistischen Ziel der Rapamycin (mTOR)-Regulation ist, was diesen Zelltyp zu einer Ausnahme macht. Die AT1-Aktivierung stimuliert die Proteinsynthese und den Proteinumsatz in den Zellen. Daher schlussfolgerten wir, dass die Aktivierung des RAAS auch die Stimulation des Proteinumsatzes und die Proteostase beeinflussen könnte.

In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf die Rolle der AnglI-Signalübertragung bei der Regulation der Podozyten-Autophagie. Wir identifizierten die kalziumaktivierten Proteasen Calpaine, die eine chronisch blockierende Wirkung von AnglI auf die Autophagie von Podozyten vermitteln. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der endogene Calpain-Inhibitor Calpastatin in der Lage war, die AngI-abhängige Autophagie-Hemmung und Podozyten-Verletzung bei Bluthochdruck zu verhindern.

Diese Ergebnisse decken einen originellen Mechanismus auf, bei dem die AnglI-vermittelte Hypertonie die Autophagie über eine kalziuminduzierte Rekrutierung von Calpain mit pathogenen Folgen im Falle eines Ungleichgewichts durch die Calpastatin-Aktivität hemmt.

METHODEN

Tiere

Calpastatin-transgene (CST18) Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. E. Letavernier zur Verfügung gestellt. Mäuse mit einer podocytenspezifischen Unterbrechung des Atg5) wurden wie zuvor beschrieben generiert (Nphs2.cre Atg5'o durch Kreuzen von Nphs2.cre-Mäusen mit Ag5lxlomice5 auf dem C57BL6/J-Hintergrund, Nphs2.cre-Atg5'oxlox-Mäusen und Kontroll-Wurfgeschwister-Männchen , im Alter von 10 bis 12 Wochen, wurden in dieser Studie verwendet.Das hypertensive Modell wurde durch subkutane Infusion von AnglI (Sigma-Aldrich, A9525)in einer Dosis von 1 μg/kg/min für 4 bis 6 Wochen via induziert osmotische Minipumpen (Alzet Corp, Modell 2006). Pumpen wurden auf dem Rücken zwischen den Schulterblättern und Hüften implantiert. Mäuse erhielten eine Salzergänzung (3 Prozent NaCl) in der Nahrung. Atgsloxilox(Wildtyp [WT])-Mäuse wurden als Kontrollen verwendet alle Studien. Für Deoxycorticosteronacetat (DOCA)-Salz mit dem Nephron-Reduktionsmodell wurden erwachsene männliche Mäuse einer unilateralen linken Nephrektomie unterzogen. Zwei Wochen nach der Nephrektomie erhielten sie DOCA-Pellets mit der 21--Tagesfreisetzung (Innovative Research of America) sc implantiert Ein zweites Pellet wurde 3 Wochen nach der ersten Implantation implantiert.Alle Mäuse re erhielten 0,9 % NaCl im Trinkwasser ad libitum und wurden nach 6-wöchiger DOC-Verabreichung getötet.6 Die Experimente wurden gemäß den französischen veterinärmedizinischen Richtlinien und den von der Europäischen Gemeinschaft formulierten Richtlinien für den Versuchstiergebrauch (L358-86/609EEC) durchgeführt. und wurden vom französischen Forschungsministerium und der lokalen Forschungsethikkommission der Universität (APAFIS-7646 und -22373) genehmigt.

Primäres Podozytenkulturexperiment

Differenzierte primäre Podozyten wurden wie zuvor beschrieben kultiviert. Kurz gesagt wurde der frisch isolierte Nierenkortex gemischt und durch Kollagenase I (Gibco, {{0}}) im Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, {{2 }}). Die Gewebe wurden dann durch 70-μm- und 40-μm-Zellsiebe (BD Falcon, 352340 und 352350) passiert. Glomeruli, die an dem 40-um-Zellsieb haften, wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Life Technologies, 10010023) plus 0,5 % Rinderserumalbumin (Eurobio, HALALB07-65) unter Druck injiziert und dann zweimal gewaschen im PBS. Frisch isolierte Glomeruli wurden in 6-Well-Schalen im Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) ausplattiert, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin (Life Technologies, 15140122), damit Podozyten aus den Glomeruli austreten können und wachsen. Die Anreicherung von Podozyten wurde wie zuvor durch Western-Blot-Analyse verifiziert (ergänzende Abbildung S1). Podozyten wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von Bafilomycin Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) für 4 Stunden kultiviert. Für Immunfluoreszenzexperimente wurden primäre Podozyten auf 4 Plattenetiketten (Dutcher, 055071) ausplattiert. Die Podozyten wurden dann 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und für die Immunfluoreszenz verarbeitet.

Calpain-Aktivitätsassay

Die intrazelluläre Calpain-Aktivität wurde in primären Podozyten, wie zuvor beschrieben, bestimmt. Insgesamt 100.000 Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit 24- Vertiefungen im Roswell Park Memorial Institute 1640 kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin. Nach der angegebenen Kulturdauer wurde das Medium durch Krebs-Ringer HEPES-Bicarbonat (KRH)-Lösung (pH 7,4) mit 4 mM CaCl2 mit oder ohne 10 uM Calpain-Inhibitor -1 ersetzt und vor der Zugabe 10 Minuten lang inkubiert von 50 mM Calpainsubstrat N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methycumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Nach einer 90-minütigen Inkubationszeit wurde die Calpain-Aktivität als Unterschied zwischen der Fluoreszenz (gemessen bei 360 nm Anregung und 430 nm Emission) mit und ohne Calpain-Inhibitor -1 bestimmt.

westlicher Fleck

Primäre Podozyten wurden mit 8 0 ul Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer, enthaltend Phosphatase und Protease-Inhibitor, gekratzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285) gemessen. Zwanzig Mikrogramm Proteine ​​wurden auf Criterion XT-Fertiggel (12 Prozent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124) einer Elektrophorese unterzogen. Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (Thermo Fischer Scientific, 88518) übertragen. Nach dem Blockieren in 5 % Milch in Tris-Puffer-Kochsalzlösung 0,1 % Tween (TBS-T) wurden Membranen mit polyklonalem Kaninchen-Anti-LC3 (1:1{000, Cell Signaling Technology, 2575), polyklonalem Kaninchen-Anti-ATG5 inkubiert (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), polyklonales Meerschweinchen-Anti-Sequestosom 1 (SQSTM1)/P62 (1:10.000, PROGEN, GP62), polyklonales Kaninchen-Anti-Calpain 1-Domäne IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), polyklonales Kaninchen-Anti-Calpain 2 aminoterminales Ende der Domäne I (1:1000, Abcam, ab39165), monoklonales Maus-IgG1-Anti-Calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), Kaninchen Anti-Podocin (1:1000, Abcam, ab50339), Meerschweinchen-Anti-Nephrin (1:500, PROGEN, GP-N2) und monoklonaler Ratten-Anti-Tubulin (1:5000, Abcam, ab6160) Antikörper. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase-gebundenem Antikörper (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077) inkubiert. Der Nachweis spezifischer Signale wurde unter Verwendung des ECL-Chemilumineszenz-Kits (Bio-Rad, 170-5070) auf einem LAS 4000-Gerät (Fuji) durchgeführt. Zur Quantifizierung wurde eine densitometrische Analyse mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health) verwendet.

Blutdruckmessungen und physiologische Beurteilungen

Der systolische Blutdruck von Mäusen wurde mit der Schwanzmanschettenmethode (Visitech Systems Inc., BP-2000) aufgezeichnet. Von jeder Maus wurden zehn Messungen durchgeführt und dann ein Mittelwert bestimmt. Der systolische Blutdruck wurde zu Studienbeginn (im Alter von 12 Wochen) und dann wöchentlich bis zum Ende des Behandlungszeitraums gemessen. Alle Mäuse wurden für eine 6--stündige Urinsammlung in Stoffwechselkäfige mit freiem Zugang zu Wasser gesetzt. Kreatinin- und Plasmaharnstoffkonzentrationen im Urin wurden spektrophotometrisch unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahrens (Olympus, AU400) analysiert. Die Ausscheidung von Albumin im Urin wurde unter Verwendung eines spezifischen enzymgebundenen Immunadsorptionstests zur quantitativen Bestimmung von Albumin in Mausurin (Crystal Chem, 80630) gemessen.

Histologie

Die Nieren wurden geerntet und in 4 % PBS-gepuffertem Formalin fixiert. In Paraffin eingebettete Schnitte (3- µm dick) wurden mit Masson's Trichrom gefärbt, um die Nierenmorphologie zu bewerten. Anomalien in den Nieren wurden auf der Grundlage des Vorhandenseins und der Schwere von Komponentenanomalien, einschließlich Glomerulosklerose, mesangialer Expansion, tubulärer Atrophie oder Zylinder und Fibrose, eingestuft. Der Anteil an sklerotischen Glomeruli wurde durch eine Blinduntersuchung von mindestens 50 Glomeruli pro Nierenschnitt bestimmt.

Immunfluoreszenzfärbung von Nierenschnitten und primären Podozyten

Fixierte primäre Podozyten wurden in TBS-T 3 % Rinderserumalbumin blockiert und über Nacht bei 4 Grad mit Meerschweinchen-Anti-SQSTM1/P62-Primärantikörpern (1:1000, PROGEN, GP-62C) und Kaninchen-Anti-Green inkubiert fluoreszierendes Protein (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Nach TBS-T-Spülungen Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper Esel-Anti-Meerschweinchen-IgG-AF594-konjugierter Antikörper (Jackson ImmunoResearch,706-585-148)und Esel-Anti-Kaninchen-IgG-AF488-konjugierter Antikörper ( Invitrogen, A21206) aufgetragen. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop Zeiss 2, einer Kamera AxioCam HRc und der Software Axiovision 4.3 aufgenommen.

Für Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Nieren wurden Schnitte (3 μm) entparaffiniert und hydratisiert und die Antigengewinnung wurde in erhitztem Citratpuffer (pH 6) durchgeführt. Die Schnitte wurden dann mit Triton 0,1 Prozent (Euromedex) permeabilisiert und in TBS-T3 Prozent Rinderserumalbumin blockiert, bevor die Antikörper über Nacht bei 4 Grad inkubiert wurden. Wir verwendeten Ziegen-Antinephrin (1:100, PROGEN, GP-N2), Meerschweinchen-Anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), Kaninchen-Anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), Ziegen-anti-Podocalyxin (PODXL;1:1000, Bio-Techne,AF-1556) und Kaninchen-anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192)-Antikörper. Sekundärantikörper waren Alexa 488-- und Alexa 568--konjugierte Antikörper von Invitrogen. Kerne wurden unter Verwendung von Hoechst blau gefärbt. Die Objektträger wurden unter Verwendung eines fluoreszierenden Eindeckmediums (Dako, S3023) eingespannt. Mikrofotografien wurden mit einem Zeiss Axiophot-Fotomikroskop und Axiovision-Software aufgenommen. Halbautomatische Quantifizierungen auf Fidschi wurden zur Quantifizierung von Nephrin-positiven und PODXL plus-Flächen pro glomerulärem Schnitt auf mindestens 30 Glomeruli pro Maus verwendet. Die Podozytenzahl wurde als die Anzahl von WT1 plus Kernen pro glomerulärem Abschnitt auf mindestens 30 Glomeruli pro Maus gezählt.

Verfahren der Transmissionselektronenmikroskopie

Kleine Stücke der Nierenrinde (1 mm) wurden in 3 % Glutaraldehyd EM-Qualität (Electron Microscopy Sciences) für 1 bis 3 0 Tage fixiert und dreimal in PBS gewaschen. Die Proben wurden in 1 % Osmiumtetraoxid 0,1 M (Electron Microscopy Science) in 0,1 M PBS (pH 7,4) nachfixiert und in Wasser gewaschen. Die Proben wurden in Alkoholqualitäten und 100 % Propylenoxid (Electron Microscopy Science) dehydriert. Die Harzinfiltration wurde wie folgt durchgeführt: Mischen von Epikote 812 und Propylenoxid in einem Verhältnis von 1:1 für 30 Minuten, gefolgt von Mischen von Epikote 812 und Propylenoxid in einem Verhältnis von 1:2 bei Raumtemperatur über Nacht. Proben wurden in 4-mm-Gelatinekapseln in 100 Prozent Epikote 812 eingebettet und in einem auf 60 Grad C erhitzten Ofen polymerisiert. Ultradünne Schnitte wurden mit einem UFC7-Ultramikrotom (Leica Microsystems GmbH) geschnitten und auf Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science) aufgebracht. Sie wurden mit Uranylacetat 7 Prozent (LFG-Verteilung) und Reynolds Bleicitrat (LFG) gegengefärbt. Die Proben wurden im Transmissionselektronenmikroskop JEM1011 (JEOL) mit der Orius SC1000 CCD-Kamera (Gatan), betrieben mit der DigitalMicrograph-Software (Gatan) zur Erfassung, untersucht.

Quantitatives Polymerase-Kettenreaktionsarray

Frisch isolierte Glomeruli wurden in QIazol Lysis Reagenz (Qiagen) bei -80 Grad eingefroren. Die Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung der phenolbasierten Methode wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers verarbeitet. cDNAs wurden unter Verwendung des RT²First Strand Kits (Qiagen, 330401) synthetisiert, und eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung eines benutzerdefinierten RT²Profiler-PCR-Arrays durchgeführt （ Qiagen, CLAM36771C) mit RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Die quantitativen PCR-Platten wurden auf einem Applied Bio-systems StepOnePlus Cycler laufen gelassen. Jedes Array enthält eine Qualitätskontrolle für die Effizienz der reversen Transkription und die Kontamination mit genomischer DNA. Die quantitative PCR-Analyse wurde unter Verwendung der 2-△△CT-Methode mit Hilfe des GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) durchgeführt. und als Log2-fache Änderung der Genexpression ausgedrückt.

In-silico-Proteomanalyse

Die In-Silico-Vorhersage der Calpain-Spaltstelle wurde mit DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) und CaMPDB (http:// calpain.org/)Online-Tools. Die Aminosäuresequenz des Mausproteins wurde von Uniprot (https://www.uniprot.org) erhalten. Die Ergebnisse sind in den Ergänzungstabellen S1 und S2 zusammengefasst.

Statistische Analysen

Alle Diagramme stellen individuelle Werte dar und bedeuten ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung der GraphPad Prism-Software, Version 9, durchgeführt. Ein Vergleich zwischen 2 Gruppen wurde unter Verwendung eines parametrischen Student-t-Tests durchgeführt, wenn die Proben die Anderson-Darling- und D'Agostino-Normalitätstests und den F-Test auf Varianzgleichheit bestanden. Ansonsten wurde ein nichtparametrischer Mann-Whitney-Test verwendet. Der Vergleich zwischen mehreren Gruppen wurde unter Verwendung einer 1--Weg- oder 2--Weg-Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von einem multiplen Vergleichstest mit Sidak-Korrektur. Werte von P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Abbildung 1| Angiotensin I (Angel) plus salzreiche Ernährung (HSD)-induzierter Bluthochdruck hemmt die glomeruläre Autophagie. (ac)

Immunfluoreszenz von Podocalyxin (PODXL;rot) und P62 (grün) in Glomeruli (a,a') von Wildtyp (WT)-Mäusen, (b,B) von WT-Mäusen nach 6 Wochen Angel plus HSD und (c) aus Nphs2.cre Atgsl/ox-Mäusen, die die Akkumulation von P62 in Podozyten während Bluthochdruck und in Podozyten-spezifischen ATG5--defizienten Mäusen zeigen. Die Pfeilspitzen zeigen P62 plus Punkte in WT in (a'). Kerne wurden mit Hoechst (blau) gegengefärbt. Abbildungsunterteile mit Apostroph zeigen eine höhere Vergrößerung an. Balken =50 μm. （d）Assoziierte Quantifizierung von P62 plus wird als Prozentsatz der glomerulären Fläche ausgedrückt.n =4 WT-Mäuse und n=5 WT mit Angel plus HSD und Nphs2.cre Atgsoxlo-Mäusen. Die Werte werden als einzelne Diagramme dargestellt und bedeuten ± SEM. Mann-Whitney-Test:*P= 0.0159.

Angel plus salzreiche Diät-induzierter Bluthochdruck hemmte die Podozyten-Autophagie

Podozyten weisen in vivo ein hohes Maß an Autophagie auf, wie die starke GFP-Expression in transgenen Mäusen mit GFP-Fusion an LC3 (GFP-LC3-Mäuse), einem Schlüsselmarker der Autophagie, zeigt (ergänzende Abbildung S2A). Autophagie ist ein dynamischer Prozess mit ständiger Bildung von Autophagosomen und Abbau von Autophagolysosomen. Das Blockieren des autophagosomalen Abbaus mit Chloroquin führte zur Akkumulation von GFP plus Punkten, was auf einen hohen autophagischen Fluss in Podozyten hinweist (ergänzende Abbildungen S2A und B). Die Bestätigung, dass GFP plus Punkte Autophagosomen waren, wurde durch doppelte Immunfluoreszenz für GFP und SQSTM1/P62, ein durch Autophagie abgebautes Chaperonprotein, gezeigt (ergänzende Abbildung S2C und D). Auch hier induzierte die Chloroquinbehandlung die Akkumulation von GFP plus P62 plus Punkten, was einen wichtigen autophagischen Fluss in Podozyten demonstriert. Schließlich wurde ein hoher autophagischer Fluss in vitro konserviert, wie durch GFP- und P62-Expression in primären Podozyten, die aus GFP-LC3-Mäusen isoliert wurden, und starke Akkumulation von GFP plus- und P62 plus-Punkten unter Behandlung mit Bafilomycin Al, einem weiteren Blocker des autophagosomalen Abbaus, gezeigt wurde (ergänzende Abbildung S2E- H).

Die Fähigkeit von Bluthochdruck, die autophagischen Reaktionen von Podozyten zu modulieren, wurde dann bei Mäusen, denen AngII infundiert wurde, mit einer salzreichen Diät (HSD) für 6 Wochen und bei Kontrollen ohne Bluthochdruck bewertet. Wie in Abbildung 1 gezeigt, induzierte AnglI plus HSD eine P62-Akkumulation in Glomeruli mit starker Akkumulation in Podozyten, was darauf hindeutet, dass Angl plus HSD für die Blockade der Podozyten-Autophagie verantwortlich war (Abbildung Land). Interessanterweise war die P62-Akkumulation in Podozyten ähnlich der, die bei Mäusen beobachtet wurde, denen es an Podozyten-Autophagie fehlte (Nphs2.cre Atg5'olox-Mäuse). Zeitverlauf der Krankheit (ergänzende Abbildung S3).

Die Deletion von Atg5 speziell in Podozyten führt zu erhöhter Albuminurie, Podozytenverlust und glomerulärer Schädigung im Angel-plus-HSD-Modell

Wir untersuchten dann, ob die Blockade der Autophagie nur in Podozyten (Nphs2.cre Atg5laxlox-Mäuse) eine glomeruläre Schädigung im AnglI plus HSD-Modell beeinflusst. Wir haben zuerst bestätigt, dass Nphs2. cre Atg5-Mäuse hatten einen normalen Blutdruck, eine normale Nierenfunktion und bis zum Alter von 10 Monaten keine glomerulären histologischen Läsionen, wie zuvor berichtet (Supplementary lox (WT) und Nphs2.cre Atgslox, Abbildung S4).2 Dann wurden Atg5'cl-Mäuse mit infundiert AngII mit HSD für 6 Wochen. Wichtig ist, dass der systolische Blutdruck in den beiden Gruppen nach der AnglI-Infusion im Verlauf der Studie ähnlich war (Abbildung 2a), obwohl die zur Blutdruckmessung verwendete Schwanzmanschettenmethode möglicherweise nicht in der Lage ist, kleine Blutdruckunterschiede aufzulösen. Die Angl-Infusion mit HSD erhöhte das Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis im Urin bei WT-Mäusen deutlich, und dieser Effekt war bei Mäusen weiter signifikant erhöht (Abbildung 2b). Hypertensive Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox-Mäuse zeigten im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern auch eine signifikant erhöhte Glomeruläre Sklerose (Abbildung 2c-e). In Übereinstimmung mit der gemessenen Proteinurie waren Proteinzylinder und tubuläre Dilatation signifikant häufiger bei Mäusen mit Podozytenmangel in ATG5 (Abbildung 2f-h).

Die Anzahl der Podozyten pro Glomerulus war bei Nphs2.cre Atg5loxlox (Abbildung 2i-k) signifikant verringert ) Aktivierungsmarker CD44 in Glomeruli (Abbildung 2l und m). Die elektronenmikroskopische Analyse identifizierte signifikante Veränderungen im Zusammenhang mit dem ATG5-Mangel nach chronischer AngII-Infusion mit HSD, einschließlich der Auslöschung des Fußfortsatzes bei Mäusen. Im Gegensatz dazu nur wenige ultrahypertensive Nphs2. cre Atg5'oxlx-Strukturdefekte wurden in Podozyten von WT-Mäusen sogar nach 10 Wochen AngII-Infusion mit HSD gefunden (Abbildung 2n und o), was darauf hinweist, dass die autophagische Aktivität von Podozyten für ihre Resistenz gegen Angel plus HSD-induzierte Schäden erforderlich ist. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass im AnglIl plus HSD-Modell die Autophagiehemmung die Verletzung und den Verlust von Podozyten verschlimmert und eine nachfolgende fokale und segmentale Glomerulosklerose induziert.

Abbildung 2|Die Deletion von Atg5 speziell in Podozyten führt zu einem signifikanten Anstieg von Albuminurie, Nierenschädigung und Podozytenverlust nach 6-wöchiger Angiotensin-II(Angel)-Infusion plus salzreiche Ernährung (HSD). (a) Systolischer Blutdruck in Atgslo/b- und Nphs2.cre-Ataslo-Mäusen während 36 Tagen von Angel plus HSD.n =9-Mäusen pro Genotyp. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiweg-Varianzanalyse (ANOVA): ns. In (bm) n =10 Mäuse pro Genotyp. In (b,g,h,k) sind die Werte als einzelne Diagramme dargestellt und bedeuten ± SEM. (b) Angel plus HSD (Fortsetzung

Abbildung 3| Calpain-Expression und -Aktivität in Podozyten. (a) Western-Blot-Analyse der Expression von Calpain-1.calpain-2 und Calpain-4 in primären Podozyten. Die Tubulin-Expression dient der Normalisierung. (b) Die Calpain-Aktivität wurde an primären Podozyten gemessen, die mit Angiotensin II (Angel; 100 nM) für 24 Stunden mit oder ohne Calpeptin (10 uM) behandelt oder nicht behandelt wurden, n =5 unabhängige Experimente. Die Werte werden als einzelne Diagramme dargestellt und bedeuten ± SEM. Einweg-Varianzanalyse (ANOVA): Behandlung, P=0.0035.Sidaks multipler Vergleichstest:*P=0.0128 für Angll versus Baseline," P=0.0056 für Angll plus Calpeptin versus Angll.(c) Die Calpain-Aktivität wurde an primären Podozyten von Wildtyp (WT)- oder Calpastatin-transgenen (CST')-Mäusen gemessen, die 24 Stunden lang mit Angel (100 nM) behandelt oder nicht behandelt wurden. n {{18} } unabhängige Experimente. Werte werden als einzelne Plots und Mittelwerte ± SEM dargestellt. Zweiweg-ANOVA, gepaart für den Behandlungsgenotyp. P= 0.0483. Sidak's multipler Vergleichstest:**P=0.0009 für WT Angll versus Baseline, *P=0.0420 für CST'9 Angll versus Baseline, *P=0.0424 für WT versus CST9 Angll.

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