Teil 1: Epigenetische Regulation des zirkadianen Gens Per1 trägt zu altersbedingten Veränderungen im Hippocampus-Gedächtnis bei

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Plc klicken Sie hier zu Teil 2

Janine L. Kwapis1,2,3, Yasaman Alaghband1,2, Enikö A. Kramár1,2, Alberto J. López1,2, Annie Vogel Ciernia4, André O. White5, Guanhua Shu1,2, Diane Rhee1,2,

Christina M. Michael1,2, Emilie Montellier6, Yu Liu7,8, Christophe N. Magnan7,8, Siwei Chen7,8, Paolo Sassone-Corsi6, Pierre Baldi7,8, Dina P. Matheos1,2 & Marcelo A. Wood1,2 ,3

Das Altern wird von Beeinträchtigungen sowohl der zirkadianen Rhythmik als auch langfristig begleitetErinnerung. Obwohl das klar istErinnerungDie Leistungsfähigkeit wird durch den zirkadianen Zyklus beeinflusst, es ist jedoch nicht bekannt, ob eine altersbedingte Störung der zirkadianen Uhr zu einer Beeinträchtigung des Hippocampus führtErinnerung. Hier zeigen wir, dass die repressive Histon-Deacetylase HDAC3 das Langzeitgedächtnis, die synaptische Plastizität und die erfahrungsinduzierte Expression des circadianen Gens Perlin im alternden Hippocampus einschränkt, ohne die rhythmischen circadianen Aktivitätsmuster zu beeinflussen. Wir zeigen auch, dass Hippocampus Per] langfristig kritisch istErinnerungFormation. Zusammen stellen unsere Daten die traditionelle Vorstellung in Frage, dass Änderungen in der zentralen zirkadianen Uhr zirkadiane Veränderungen bewirkenErinnerungBildung und argumentieren stattdessen für eine autonomere Rolle der Genfunktion der zirkadianen Uhr in Hippocampuszellen, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Langzeitgedächtnisses zu verhindern.

Cistanche kann das Gedächtnis verbessern

Tiere haben eine innere zirkadiane Uhr, die den rhythmischen Zyklus biologischer Prozesse alle ~24 h antreibt. Zirkadiane Rhythmen treiben zahlreiche physiologische Ereignisse an, darunter den Schlaf-Wach-Zyklus, das Ernährungsverhalten, die Körpertemperatur und den Stoffwechsel. In der zirkadianen Hauptuhr, dem suprachiasmatischen Nucleus (SCN), schwingt eine Gruppe von Genen der Kernuhr in einer negativen Rückkopplungsschleife, die alle ~24 h1,2 zyklisch läuft. Neben der Regulierung grundlegender biologischer Prozesse hat die circadiane Uhr auch einen starken Einfluss aufErinnerung. Das transkriptionsabhängige Langzeitgedächtnis zeigt einen starken Tageszeiteffekt mit einer Spitzenleistung des Gedächtnisses während des Tages (inaktive Phase) bei Mäusen3,4. Vor allem beide langfristigErinnerungund die zirkadiane Rhythmik werden mit zunehmendem Alter beeinträchtigt5, was darauf hindeutet, dass gemeinsame molekulare Mechanismen beiden Prozessen zugrunde liegen könnten. Eine Idee ist, dass sich Uhrengene darin befindenErinnerung-relevante Strukturen, wie der dorsale Hippocampus, könnten die Bildungsfähigkeit eines Tieres langfristig blockierenErinnerungbasierend auf der Tageszeit6. In Übereinstimmung damit kann die Störung mehrerer individueller Uhrengene im gesamten Gehirn das Hippocampus-Langzeitgedächtnis bei jungen Tieren beeinträchtigen. Da bisher keine Studie die zirkadiane Genfunktion im dorsalen Hippocampus selektiv gestört hat, ist unklar, ob Uhrengene in den Hippocampuszellen langfristig wirkenErinnerungoder ob diese Gedächtnisdefizite aus Off-Target-Effekten in anderen Hirnregionen resultieren, wie z. B. Störungen des zirkadianen Rhythmus, Schlafdefizite oder sogar Entwicklungsstörungen.

Die Genexpression nimmt im alternden Gehirn ab, was die Folge einer stärker repressiven Chromatinstruktur sein kann. Die Transkription wird teilweise durch Veränderungen in der Chromatinstruktur kontrolliert, die den Zugang zu neuronaler DNA nach einem Lernereignis dynamisch fördern oder einschränken können. Eine von Barnes und Sweatt aufgestellte Hypothese besagt, dass das Epigenom in alternden Neuronen verändert ist, was zu einer repressiven Chromatinstruktur führt, die eine normale Genexpression verhindert, die für die Bildung des Langzeitgedächtnisses erforderlich ist7. Mehrere Studien unterstützen diese Idee und zeigen veränderte Histon-Modifikationsmechanismen im alternden Gehirn8–10. Ob jedoch Chromatin-Modifikationsmechanismen die zirkadiane Genexpression in einem Schlüssellernprozess abnormal regulierenErinnerungGehirnregion ist unbekannt. Hier untersuchten wir diese Möglichkeit, indem wir uns auf die Rolle der Histon-Deacetylase 3 (HDAC3)-abhängigen Regulation des altersbedingten Gedächtnisses und der Genexpression konzentrierten. Wir fanden heraus, dass die Deletion oder Unterbrechung von HDAC3 im dorsalen Hippocampus altersbedingte Beeinträchtigungen des Langzeitgedächtnisses und der synaptischen Plastizität bei 18- Monate alten Mäusen verbessert, ein Effekt, der teilweise durch die zirkadiane Kernuhr vermittelt zu sein scheint Gen Period1 (Per1). Im Großen und Ganzen legt diese Arbeit nahe, dass Per1 ein Mechanismus sein könnte, der langfristig zu altersbedingten Beeinträchtigungen beiträgtErinnerungund zirkadiane Rhythmik, je nach Struktur.

Ergebnisse

HDAC3 trägt altersbedingt dazu beiErinnerungBeeinträchtigungen. Wir haben zunächst getestet, ob die repressive Histon-Deacetylase HDAC3 bei altersbedingten Erkrankungen eine Rolle spieltErinnerungAbfall. HDAC3 ist ein potenter negativer Regulator der Gedächtnisbildung, und die Störung von HDAC3 bei jungen Tieren kann ein unterschwelliges Lernereignis in ein Ereignis umwandeln, das ein dauerhaftes Langzeitgedächtnis für mehrere Aufgaben erzeugt11–14. Wir verwendeten zwei Methoden zur Zerstörung von HDAC3 im dorsalen Hippocampus von alternden (18- Monate alten) Mäusen. Zuerst erzeugten wir fokale homozygote Deletionen von HDAC3 durch Infusion von AAV2.1-CaMKII-Cre-Rekombinase (1 μl pro Seite) in die dorsalen Hippocampi von HDAC3flox/flox-Mäusen (Ergänzende Abb. 1a). Zweitens, um die enzymatische Aktivität von HDAC3 selektiv zu blockieren, verwendeten wir ein dominant-negatives Punktmutantenvirus, AAV2.1-CMV-HDAC3(Y298H)-v5, das spezifisch die HDAC3-Deacetylase-Aktivität blockiert, ohne die Protein-Protein-Wechselwirkungen zu beeinträchtigen (siehe Ref. 12,15–17 Ergänzende Abb. 1b). Viren wurden zwei infundiertWochen vor dem Training, was eine strenge räumliche und zeitliche Kontrolle über unsere HDAC3-Manipulationen ermöglicht, um potenzielle Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch eine längere HDAC3-Störung während der Entwicklung auftreten könnten18,19. Zwei Wochen nach der AAV-CaMKII-Cre-Infusion (ergänzende Abb. 1c) beobachteten wir, dass die Hdac3-mRNA-Expression nicht durch das Training der Objektlokalisierung beeinflusst wurdeErinnerung(OLM), aber die genetische Deletion von hippocampalem Hdac3 störte die Expression von Hdac3-mRNA (ergänzende Abb. 1d) zusätzlich zum HDAC3-Protein (ergänzende Abb. 1a).

Um festzustellen, ob sich die Löschung von HDAC3 verbessertErinnerungBei alternden Mäusen testeten wir die Wirkungen einer hippocampalen HDAC3-Deletion (HDAC3flox/flox) oder einer Aktivitätsstörung (HDAC3 (Y298H)) auf das Langzeitgedächtnis für OLM (Abb. 1a). In Übereinstimmung mit zahlreichen Berichten über altersbedingte Hippocampus-Gedächtnisdefizite fanden wir heraus, dass alternde 18-mo-Wildtyp (HDAC3 plus / plus)-Mäuse nach 10- min Training ein schlechtes Gedächtnis für OLM zeigten und keine signifikante Zunahme von DI zwischen Training und Test (Abb. 1b, graue Balken). Wichtig ist eine 10--minütige Trainingseinheit.

2 NATURKOMMUNIKATION|(2018)9:3323 |DOI: 10.1038/s41467-018-05868-0 |www.nature.com/naturecommunications

Abb. 1 Das Löschen oder Unterbrechen von HDAC3 verbessert altersbedingte Beeinträchtigungen des Hippocampus-Gedächtnisses. ein OLM-Verfahren. AAV wurde 2 Wochen vor dem Training infundiert. b 18-mo HDAC3flox/flox-Mäuse zeigten ein signifikant besseres Gedächtnis für OLM im Vergleich zu Wildtyp (HDAC3 plus / plus)-Wurfgeschwistern (Zweifach-ANOVA: Signifikante Genotyp-x-Sitzungsinteraktion (F(1,29) {{1{ {12}}}}.96, p < 0.001),="" sidaks="" post-hoc-tests,="" ***p="">< 0.001,="" n="" {{="" 16}}(5f),="" 17(6f)).="" c="" die="" gesamtexploration="" war="" für="" beide="" gruppen="" beim="" test="" ähnlich="" (t(29)="1.67," ***p="0.11)." d="" die="" unterbrechung="" der="" hdac3-aktivität="" im="" dorsalen="" hippocampus="" mit="" aav-hdac3="" (y298h)-v5="" verbesserte="" auch="" die="" hippocampus-gedächtnisstörungen="" bei="" 18-mo-mäusen="" (zweifach-anova:="" haupteffekt="" der="" sitzung="" (f(1,16)="" {{35="" }}.96,="" p="">< 0,001),="" sidak's="" post="" hoc="" tests,="" ***p="">< 0,001,="" *p="">< 0,05,="" n="9,10;" alle="" männer).="" e="" gesamtexplorationszeit="" war="" für="" beide="" gruppen="" beim="" test="" ähnlich="" (t(16)="0.28," p="0.78)." f="" orm-versuchsverfahren,="" 2="" wochen="" nach="" abschluss="" von="" olm.="" g="" sowohl="" 18-mo="" hdac3flox/flox-mäuse="" als="" auch="" hdac3="" plus/plus-wurfgeschwister="" zeigten="" wenig="" präferenz="" für="" das="" neue="" objekt="" (zweiweg-anova,="" keine="" haupteffekte="" oder="" wechselwirkung,="" n="14(5" f),="" 17(="" 6f)).="" h="" die="" gesamtexplorationszeit="" war="" für="" beide="" gruppen="" beim="" test="" ähnlich="" (t(29)="0.59," p="0.56)." i="" die="" störung="" der="" hdac3-aktivität="" im="" dorsalen="" hippocampus="" mit="" aav-hdac3(y298h)="" hatte="" ebenfalls="" keine="" auswirkung="" auf="" die="" orm,="" wobei="" keine="" der="" gruppen="" eine="" präferenz="" für="" das="" neue="" objekt="" zeigte="" (zwei-wege-anova,="" keine="" haupteffekte="" oder="" wechselwirkung,="" n="9" ,10;="" alle="" männer).="" j="" gruppen="" zeigten="" beim="" test="" eine="" ähnliche="" gesamtexplorationszeit="" (t(16)="0.28," p="0.78)." die="" daten="" werden="" als="" mittelwert="" ±="" sem="" dargestellt;="" schwarze="" kreise,="" männchen;="" graue="" quadrate,="" weibchen="" produzieren="" bei="" jungen="" mäusen="" normalerweise="" ein="" starkes="" langzeitgedächtnis20.="" im="" gegensatz="" dazu="" bildeten="" 18-mo="" hdac3flox/flox-wurfgeschwister="" ein="" robustes="" langzeitgedächtnis="" (abb.="" 1b,="" blaugrüne="" balken),="" mit="" einer="" signifikanten="" zunahme="" der="" präferenz="" für="" das="" sich="" bewegende="" objekt="" in="" ruhe="" im="" vergleich="" zum="" training.="" hdac3flox/flox-mäuse="" zeigten="" einen="" signifikant="" höheren="" di="" beim="" test="" als="" hdac3="" plus/plus-mäuse="" trotz="" ähnlicher="" gesamtexploration="" während="" der="" testsitzung="" (abb.="" 1c).="" ähnliche="" effekte="" beobachteten="" wir="" beim="" aktivitätsspezifischen="" aav-hdac3(y298h)-virus.="" alternde="" kontrollmäuse="" mit="" 18-mo="" leerem="" vektor="" (ev)="" zeigten="" ein="" schlechtes="" gedächtnis="" für="" olm,="" wohingegen="" mäuse,="" denen="" aav-hdac3(y298h)="" in="" das="" dh="" infundiert="" wurde,="" eine="" signifikant="" höhere="" präferenz="" für="" das="" sich="" bewegende="" objekt="" zeigten,="" ohne="" dass="" sich="" die="" gesamterkundung="" änderte="" (abb.="" 1d,="" e).="" im="" gegensatz="" zu="" dem="" schlechten="" langzeitgedächtnis,="" das="" bei="" 18-mo="" wildtyp-mäusen="" beobachtet="">

(Abb. 1b, d), Kurzzeitgedächtnis für OLM (getestet 60 m nach

Erwerb; Die ergänzende Abb. 2a) war sowohl für HDAC3 plus / plus- als auch für HDAC3flox/flox-Mäuse intakt (ergänzende Abb. 2b, c), und es gab keinen signifikanten Unterschied in der Angst zwischen diesen Gruppen (ergänzende Abb. 2d). Wir haben auch keinen signifikanten Unterschied in der Bewegung zwischen den Gruppen während der Gewöhnung beobachtet (ergänzende Abb. 2e, f, 8a, b). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass altersbedingte Beeinträchtigungen bei OLM durch Deletion oder Störung von HDAC3 im dorsalen Hippocampus verbessert werden.

Als nächstes testeten wir, ob unsere fokale HDAC3-Manipulation die Objekterkennung beeinflussteErinnerung(ORM), die den dorsalen Hippocampus nicht zum Abruf benötigt20. Bei dieser Aufgabe wird ein vertrauter Gegenstand durch einen neuen Gegenstand ersetzt (Abb. 1f). Das Löschen von HDAC3 im dorsalen Hippocampus brachte keine RettungErinnerungfür ORM, wobei sowohl HDAC3 plus/plus- als auch HDAC3flox/flox-Mäuse beim Test im Vergleich zum Training keine Präferenz für das neue Objekt zeigten (Abb. 1g). Auch hier unterschieden sich die Gruppen während der Testsitzung nicht im Gesamtexplorationsniveau (Abb. 1h). In ähnlicher Weise konnte die aktivitätsspezifische Unterbrechung von HDAC3 im Hippocampus die altersbedingten ORM-Beeinträchtigungen nicht verbessern (Abb. 1i, j). Daher wurden altersbedingte Beeinträchtigungen der Langzeit-ORM nicht durch Deletion oder Störung von HDAC3 im Hippocampus verbessert.

Zusammengenommen weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Deletion oder Störung von HDAC3 im dorsalen Hippocampus die altersbedingte Langzeitentwicklung verbessern kannErinnerungDefizite für eine Hippocampus-abhängige Aufgabe (OLM; Abb. 1a–e) ohne Beeinträchtigung des Gedächtnisses für eine Hippocampus-unabhängige Aufgabe (ORM; Abb. 1f–j). Wichtig ist, dass alle Mäuse kurzfristig intakt warenErinnerungfür OLM (Ergänzende Abb. 2), was darauf hindeutet, dass diese Tiere ein normales Gedächtnis erwerben, diese Informationen jedoch nicht langfristig beobachtbar konsolidierenErinnerung. Da das Kurzzeitgedächtnis transkriptionsunabhängig ist (zur Übersicht21), stimmt dieser Befund mit der Vorstellung überein, dass die lerninduzierte Genexpression bei alternden Mäusen verändert wird, was zu altersbedingten Beeinträchtigungen des Langzeitgedächtnisses führt.

Eine HDAC3-Störung kehrt altersbedingte Beeinträchtigungen bei LTP um.

Um zu testen, ob HDAC3 auch zu altersbedingten Beeinträchtigungen der synaptischen Plastizität beiträgt, untersuchten wir die Langzeitpotenzierung (LTP) in akuten Hippocampus-Schnitten entweder nach Deletion oder Disruption von HDAC3. LTP wird auch mit zunehmendem Alter beeinträchtigt, insbesondere wenn das Stimulationsprotokoll nahe an der LTP-Induktionsschwelle liegt22. Zwei Wochen nach der viralen Infusion präparierten wir Hippocampus-Schnitte und induzierten LTP mit einem einzigen Zug von 5-Theta-Bursts zu Schaffer-Kollateraleingängen und zeichneten Feld-EPSPs von apikalen Dendriten von CA1b auf. Diese relativ milde Form der Stimulation erzeugte einen stabilen LTP-Spiegel in jungen HDAC3 plus/plus-Scheiben (Abb. 2a). Die Deletion von HDAC3 im Hippocampus verstärkte LTP, wobei HDAC3flox/flox-Mäuse eine signifikant höhere Potenzierung zeigten als Wildtyp-Kontrollen. Wie vorhergesagt, zeigten alternde -18-mo HDAC3 plus / plus-Mäuse eine beeinträchtigte LTP und die HDAC3-Deletion verbesserte dieses Defizit, wodurch eine LTP erzeugt wurde, die mit der von jungen Wildtyp-Mäusen vergleichbar war (Abb. 2b, c), ohne Auswirkung auf die Grundlinie der Synapsen Übertragung (Abb. 2g, h).

Wir beobachteten ähnliche Ergebnisse bei der aktivitätsspezifischen Unterbrechung. Hier verwendeten wir ein Within-Subjects-Design, bei dem jungen und alten Wildtyp-Mäusen das Kontrollvirus (AAV-EV) in einen Hippocampus und AAV-HDAC3 (Y298H) in den kontralateralen Hippocampus infundiert wurden. Wie zuvor fanden wir heraus, dass die Unterbrechung der HDAC3-Aktivität LTP in Schnitten von jungen Mäusen (Abb. 2d) und altersbedingte LTP-Beeinträchtigungen in Schnitten von alternden Mäusen (Abb. 2e, f) verbesserte, ohne die synaptische Grundlinienübertragung zu beeinträchtigen (Abb. 2i). , j). Entweder die Deletion oder die Unterbrechung von HDAC3 kann daher altersbedingte Beeinträchtigungen der hippocampalen LTP verbessern.

Eine Untergruppe altersgeschädigter Gene wird durch HDAC3-Deletion verbessert. Unsere Daten legen nahe, dass das Löschen oder Unterbrechen von HDAC3 altersbedingte Beeinträchtigungen des Langzeitgedächtnisses und der synaptischen Plastizität verbessert. Als nächstes fragten wir, ob altersbedingte Defizite in der Genexpression im Hippocampus auch durch die Deletion von HDAC3 verbessert werden könnten. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Dysregulation der HDAC3-Aktivität im alten Gehirn zu einer ungewöhnlich repressiven Chromatinstruktur führt, die die Genexpression einschränkt, was letztendlich zu einer langfristigen Beeinträchtigung führtErinnerung. Um zu identifizieren, welche spezifischen Gene durch HDAC3 im jungen und alternden Gehirn reguliert werden, führten wir ein RNA-Sequenzierungsexperiment durch, in dem wir junge (3-mo) Wildtypmäuse mit alternden (18-mo) HDAC3 verglichen plus/plus-Mäuse und alternde (18-mo) HDAC3flox/flox-Wurfgeschwister. Um Änderungen der Genexpression während zu identifizierenErinnerungKonsolidierung wurden die Tiere in jeder Gruppe 60 m nach 10- min OLM-Training getötet und mit den Kontrollen in Heimkäfigen (HC) verglichen. Nach Kartierung und Berücksichtigung des haploiden Genoms23,24 wurde die Sequenzierungsqualität bewertet (ergänzende Abb. 3a, b) und signifikante Unterschiede in den Expressionsprofilen zwischen allen Probenpaaren für p < 0,0520="">

Wir erwarteten, dass die erfahrungsinduzierte Genexpression im alten Gehirn, wie zuvor beschrieben, verändert werden würde, wobei eine Untergruppe von Genen nach dem Lernen nicht mehr exprimiert werden würde. Wir konzentrierten uns daher auf jene Gene, die in den trainierten Gruppen im Vergleich zu den Kontrollen in Heimkäfigen auf signifikant höherem Niveau exprimiert wurden. Während jede Gruppe (Young WT, Old WT, Old HDAC3flox/flox) eine beträchtliche Anzahl von Genen zeigte, die durch das OLM-Training induziert wurden, zeigte jede Gruppe ein einzigartiges Genexpressionsprofil (Abb. 3a, Ergänzungstabellen 1–3). Alte Gehirnehochreguliert sowohl in den jungen Wildtyp- als auch in den alten HDAC3flox/flox-Gruppen, die keine erfahrungsbedingten Anstiege im alten Wildtyp-Hippocampus zeigen. Dies sind die Gene, die nach dem OLM-Training im alten Gehirn nicht normal exprimiert werden, aber durch die HDAC3-Deletion gerettet werden und daher als Mechanismus fungieren können, durch den die HDAC3-Deletion altersbedingte Gedächtnisstörungen verbessert. In dieser Gruppe wurden vier Gene identifiziert: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3 und Per1. Alle diese Gene sind weitgehend an der Gedächtnisbildung beteiligt6,26,27, obwohl dies die erste Studie ist, die zeigt, dass die erfahrungsinduzierte Expression dieser Gene mit zunehmendem Alter beeinträchtigt und durch HDAC3-Deletion gerettet wird.

Das Löschen von HDAC3 verbessert altersbedingte Defizite in Per1. Von den durch unsere RNA-Seq identifizierten Genen wurde Period1 (Per1) am stärksten durch das OLM-Training in der HDAC3flox/flox-Gruppe induziert (Abb. 3c). Dieses Ziel ist besonders faszinierend, da Per1 typischerweise im Zusammenhang mit zirkadianen Rhythmen untersucht wird, aber auch mit dem Hippocampus in Verbindung gebracht wurdeErinnerungBildung6,28,29. Da bekannt ist, dass das Altern von Beeinträchtigungen des zirkadianen Rhythmus begleitet wird5 und das Gedächtnis mit der Tageszeit verknüpft ist2,30, könnte dieses Ziel von HDAC3 eine kritische und wenig erforschte Schnittstelle zwischen Alterung, Chromatinmodifikation und der zirkadianen Uhr darstellen.

Um die Expression von Per1 in alten HDAC3 plus / plus- und alten HDAC3flox/flox-Tieren weiter zu untersuchen, verwendeten wir RT-qPCR und ChIP-qPCR. Wir fanden heraus, dass das OLM-Training keine Hochregulierung von Per1 im dorsalen Hippocampus von 18-mo HDAC3 plus / plus-Mäusen induzieren konnte, aber in Abwesenheit von HDAC3 (HDAC3flox/flox) löste das OLM-Training einen signifikanten Anstieg der Per1-mRNA aus ( Abb. 3f). Wir haben auch die Expression von zwei weiteren Genen gemessen, die langfristig eine gut dokumentierte Rolle spielenErinnerungFormation: Arc und cFos31. Die erfahrungsinduzierte Expression von Arc war im alternden Wildtyp-Gehirn intakt und wurde durch die HDAC3-Deletion nicht beeinflusst (ergänzende Abb. 3c). Die cFos-Expression hingegen konnte nicht durch das OLM-Training im alten HDAC3 plus / plus-Hippocampus induziert werden, aber das Löschen von HDAC3 reichte nicht aus, um diese fehlgeschlagene Induktion wiederherzustellen (ergänzende Abb. 3d). Das Löschen von HDAC3 stellt daher nur die Expression einer Untergruppe von erfahrungsinduzierten Genen im alternden Gehirn wieder her, einschließlich Per1.

Um zu bestimmen, ob das Löschen von HDAC3 die Expression von Per1 wiederherstellt, indem es die Histonacetylierung zusammen mit seinem Promotor fördert, haben wir als nächstes die Acetylierung von Histon 4, Lysin 8 (H4K8Ac) an der Stelle des Per1-CRE-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-qPCR) gemessen. H4K8Ac ist ein Marker für die Transkriptionsaktivierung32 und gilt als Ziel von HDAC311,12. Das OLM-Training veränderte die H4K8Ac-Spiegel am Per1-Promotor im alten Wildtyp-Gehirn nicht, aber in Abwesenheit von HDAC3 waren die H4K8Ac-Spiegel am Per1-Promotor als Reaktion auf das OLM-Training signifikant erhöht (Abb. 3g). Bei Arc und cFos sahen wir keine Änderung der H4K8Ac-Belegung zwischen den Gruppen (ergänzende Abb. 3e, f). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Deletion von HDAC3 die Acetylierung am Per1-Promotor und die Expression von Per1-mRNA als Reaktion auf das Lernen erhöht.

Eine wichtige Frage ist, ob die beobachteten Veränderungen in Per1 auf Veränderungen im circadianen Rhythmus von HDAC3flox/flox-Mäusen zurückzuführen sind. Wenn die Deletion von HDAC3 im dorsalen Hippocampus die zirkadiane Rhythmik verändert, könnte dies die beobachteten Veränderungen sowohl in der Per1-Expression als auch langfristig erklärenErinnerungFormation. Um dies auszuschließen, untersuchten wir die zirkadiane Rhythmik von jungen (3- Monaten) und alternden (18- Monaten) HDAC3flox/flox-Mäusen und ihren HDAC3 plus/plus-Wurfgeschwistern nach AAV-CaMKII-Cre-Infusion. Nach 2-wöchiger Verbringung in einen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (LD) wurden die Mäuse in konstante Dunkelheit (DD) gesetzt, um endogene zirkadiane Rhythmen zu messen (ergänzende Abb. 4a). Wir beobachteten keinen Unterschied in den zirkadianen Aktivitätsmustern zwischen HDAC3 plus/plus- und HDAC3flox/flox-Mäusen in beiden Altersgruppen (ergänzende Abb. 4b–f), was darauf hindeutet, dass Hippocampus-HDAC3 keinen Einfluss auf die zirkadiane Rhythmik hat. Daher können die beobachteten Veränderungen in der Per1-Expression und der Bildung des Langzeitgedächtnisses nach HDAC3-Deletion nicht durch Veränderungen in der zirkadianen Rhythmik erklärt werden.

Per1 wird durch OLM-Training induziert und durch HDAC3 reguliert.

Als nächstes wollten wir feststellen, ob Hippocampus Per1 für eine langfristige Untersuchung erforderlich istErinnerungFormation. Zunächst untersuchten wir, ob Hippocampus-abhängiges Lernen typischerweise die Per1-mRNA-Expression induziert. Wir opferten junge (3-mo) Wildtypmäuse 60 Minuten nach dem Erwerb von entweder OLM oder kontextbezogener Angstkonditionierung (CFC)12. Die Per1-mRNA-Expression war bei Tieren, die entweder mit OLM (Abb. 4a) oder CFC (Abb. 4b) trainiert wurden, im Vergleich zu den Kontrolltieren in Heimkäfigen signifikant hochreguliert, was darauf hindeutet, dass die Per1-mRNA-Expression typischerweise im Hippocampus während der Gedächtniskonsolidierung für mehrere Aufgaben induziert wird.

Um festzustellen, ob dieser erfahrungsbedingte Anstieg von Per1 möglicherweise durch HDAC3 vermittelt wird, verwendeten wir als nächstes ChIP-qPCR, um die HDAC3-Belegung nach dem OLM-Training an verschiedenen Stellen zusammen mit dem Per1-Promotor im jungen Hippocampus zu messen (Abb. 4c, oben). Wir fanden heraus, dass die HDAC3-Belegung am Per1-Promotor an allen drei getesteten Stellen nach dem OLM-Training reduziert war (Abb. 4c, unten). Zusammen mit unserem früheren Befund, dass die HDAC3-Deletion sowohl die Acetylierungen bei Per1 als auch bei der Per1-mRNA-Expression wiederherstellt (Abb. 3), deutet dies stark darauf hin, dass HDAC3 die Per1-Expression im dorsalen Hippocampus reguliert und eine Dysregulation von HDAC3 zu altersbedingten Beeinträchtigungen durch Erfahrung beitragen kann Per1-Ausdruck. PER1 könnte daher Teil eines Schlüsselmechanismus sein, durch den die HDAC3-Deletion altersbedingte Beeinträchtigungen im Hippocampus langfristig verbessertErinnerungFormation.