Teil 1: Abbildung des epigenomischen und transkriptomischen Zusammenspiels während der Gedächtnisbildung und des Abrufs im Hippocampus-Engramm-Ensemble

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Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila-Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1 Picower Institut für Lernen undErinnerung, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

2Abteilung für Gehirn- und Kognitionswissenschaften, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

3Labor für Informatik und künstliche Intelligenz, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

4Abteilung für Neugeborenenmedizin, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.

5Broad Institute of Harvard und MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.

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Abstrakt

Das Epigenom und die dreidimensionale (3D)-genomische Architektur entwickeln sich zu Schlüsselfaktoren bei der dynamischen Regulation verschiedener Transkriptionsprogramme, die für neuronale Funktionen erforderlich sind. Hier verwenden wir ein aktivitätsabhängiges Tagging-System in Mäusen, um den epigenetischen Zustand, die 3D-Genomarchitektur und die Transkriptionslandschaft von Engrammzellen über die Lebensdauer von zu bestimmenErinnerungBildung und Rückruf. Das zeigen unsere ErgebnisseErinnerungCodierung führt zu einem epigenetischen Priming-Ereignis, das durch eine erhöhte Zugänglichkeit von Enhancern ohne entsprechende Transkriptionsänderungen gekennzeichnet ist.ErinnerungDie Konsolidierung führt anschließend zu einer räumlichen Reorganisation großer Chromatinsegmente und Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen. Schließlich nutzen Engrammneuronen bei der Reaktivierung eine Untergruppe von Denovolong-Range-Wechselwirkungen, bei denen geprimte Enhancer mit ihren jeweiligen Promotoren in Kontakt gebracht wurden, um Gene hochzuregulieren, die an der lokalen Proteintranslation in synaptischen Kompartimenten beteiligt sind. Insgesamt verdeutlicht unsere Arbeit die umfassende Transkription, und Benutzer können den Inhalt solcher Dokumente für die akademische Forschung einsehen, drucken, kopieren und herunterladen, immer vorbehaltlich der vollständigen Nutzungsbedingungen: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Korrespondenz an: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Autorenbeiträge:

AM und L.-HT konzipierten und gestalteten das Projekt. AM und AZ führten Verhaltensexperimente, ISH, Immunfärbung und MARIS-Analyse durch. CA führte eine Virusinjektion und Immunfärbungen durch. AM und HSM führten ATAC-seq-Experimente durch. AM und AZ führten nukleare RNA-seq-Experimente durch. AM, HSM und VD führten pc-Hi-C- und Hi-C-Experimente durch. AM, HSM, VD, RMR und JDV führten eine ATAC-seq-Analyse durch. AM, RMR, HSM, VD und FG führten eine Kern-RNA-seq-Analyse durch. AM, VD, HSM und RMR führten pc-Hi-C- und Hi-C-Analysen durch. Alle Autoren halfen bei der Interpretation der Daten. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK und LHT haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben. LHT stellte die Werkzeuge zur Verfügung und betreute das Projekt.

Konkurrierende Interessen:

Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

die epigenomische Landschaft über die Lebensdauer vonErinnerungEntstehung und Rückruf im Hippocampus-Engramm-Ensemble.

Die Bildung und Erhaltung des Langzeitgedächtnisses hängt von der koordinierten Genexpression und Synthese von synaptischen Proteinen ab1. Diese molekularen Prozesse wirken innerhalb einer bestimmten Population von Neuronen, die als Engrammzellen bezeichnet werden2–4. Neuere Ansätze, die die aktivitätsabhängige Expression von Reportern verwenden, lieferten einen Rahmen für die Erforschung des Engramm-Ensembles5–8, aber der molekularen Mechanismen, die regierenErinnerungSpeicherung und Abruf sind nach wie vor kaum verstanden. Insbesondere epigenetische Modifikationen und 3D-genomische Architektur entwickeln sich zu einem Schlüsselfaktor bei der dynamischen Regulation der Genexpression9–17, und ihre Bedeutung für die neuronale Funktion, Entwicklung und Erkrankung wird zunehmend anerkannt14, 16, 18

Hier verwendeten wir das Mausmodell Targeted Recombination in Active Populations (TRAP)5,6, in dem aktivierte Neuronen, die das Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein (Arc)-Gen exprimieren, auf induzierbare Weise permanent markiert sind. Aktivierte Neuronen währendErinnerungKodierung, Konsolidierung und Rückruf wurden sortiert und einer nuklearen RNA-Sequenzierung (nRNA-seq), einem Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierung (ATAC-seq) und einer Chromosomenkonformationserfassung (Hi-C) unterzogen. Das zeigen unsere DatenErinnerungKodierung führt zu einer genomweiten Erhöhung der Chromatinzugänglichkeit, ohne erwartete Veränderungen in der Genexpression. Darüber hinaus zeigen wir, dass die späte Phase der Gedächtniskonsolidierung mit der Relokalisierung großer Chromatinsegmente (Subkompartimente) von inaktiven zu permissiven Umgebungen und der Reorganisation der Promotor-Enhancer-Interaktionslandschaft verbunden war. Schließlich Reaktivierung der Neuronen währendErinnerungRecall ist mit Denovopromotor-Enhancer-Wechselwirkungen verbunden, wobei eine große Teilmenge der Enhancer verwendet wird, die während dieser Phase geprimt wurdenErinnerungCodierung. Diese Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen sind mit einer robusten Veränderung in der Expression von Genen verbunden, die an der lokalen Proteinsynthese und synaptischen Morphogenese beteiligt sind.

Ergebnisse

Zeitliche und räumliche Identifizierung von aktivierten und reaktivierten Engrammzellen

Die zeitliche Verfolgung der neuronalen Aktivität war eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von Engrammzellen, da die Marker für die neuronale Aktivität, die als unmittelbare frühe Gene (IEGs) bekannt sind, kurz nach der Induktion auf den Ausgangswert zurückkehren1,2. Um diese Einschränkung zu überwinden, nutzten wir das TRAP5,6-Modell, das zwei Transgene erfordert, eines, das CreERT2 von einem aktivitätsabhängigen Arc-Promotor exprimiert, und eines, das die Expression des Reporters des gelb fluoreszierenden Proteins (eYFP) in einem Cre- abhängige Weise. Die Verabreichung von Tamoxifen (TAM) an die TRAP-Mäuse führt zu einer permanenten eYFP-Markierung in den aktivierten Arc-Neuronen. Ohne TAM wird CreERT2 im Zytoplasma zurückgehalten und eYFP wird nicht exprimiert (erweiterte Daten, Abb. 1a). TRAP-Mäuse wurden dem klassischen Paradigma der pawlowschen kontextuellen Angstkonditionierung (CFC) unterzogen (Abb. 1a), einer häufig verwendeten Methode zur Untersuchung aversiver Erinnerungen19. Ungefähr 1,5–2 Stunden nach der FS-Exposition wurden Gehirne gesammelt, um i) RNA-bindendes Protein Fox-1-Homolog 3 (Rbfox3), auch bekannt als NeuN plus und eYFP plus markierte Neuronen zu identifizieren, die während der anfänglichen Exposition aktiviert wurden (Aktiviert -früh), die von ii) NeuN plus /eYFP- nicht aktivierten Neuronen im Basalzustand (Basal) unterschieden werden können (Abb. 1a). Nach fünf Tagen, in Ermangelung eines Abrufs, sammelten wir iii) NeuN plus /eYFP plus Neuronen, die am Trainingstag markiert wurden, was langfristig bedeutetErinnerungKonsolidierung (Aktiviert-spät). In einem

In einer anderen Kohorte wurden die Mäuse dem konditionierten Stimulus erneut ausgesetzt, und die anschließende endogene ARC-Proteinexpression wurde 1,5–2 Stunden nach der erneuten Exposition getestet. Dies ermöglichte die Identifizierung von iv) doppelt positiven NeuN plus /eYFP plus / endogenen Arc plus Engrammneuronen, die während des Trainings aktiviert und währenddessen reaktiviert wurdenErinnerungRückruf (reaktiviert). Obwohl die DNA-Rekombination möglicherweise 1,5–2 h nach der FS möglicherweise nicht vollständig erfolgt, beobachteten wir eine hohe Co-Lokalisierung (durchschnittlich 84 Prozent) zwischen dem endogenen Arc-Protein und dem Arc:eYFP-Reporter (Erweiterte Daten, Abb. 1b), was ebenfalls der Fall war im Einklang mit früheren Berichten20.

BestätigenErinnerungCodierung und Erinnerung während CFC, das Einfrierverhalten wurde während des Trainings und der erneuten Exposition gegenüber angstauslösenden Hinweisen aufgezeichnet (erweiterte Daten, Abb. 1c). In Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen6,20 zeigten unsere Daten einen signifikanten Anstieg der Anzahl von eYFP plus (aktivierte frühe und späte) Neuronen im Hippocampus im Vergleich zu Mäusen, die in ihrem Heimkäfig gegenüber CFC naiv blieben (F (2, 70)=240.3, S<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Die Gedächtnisbildung ist mit einer erhöhten Chromatinzugänglichkeit verbunden, hauptsächlich bei Verstärkern

Um die molekularen Kräfte besser zu verstehen, die verschiedene Transkriptionsprogramme steuern, haben wir genomweite Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit über verschiedene Phasen hinweg gemessenErinnerung. Hippocampus-Gewebe wurden gepoolt und isolierte Zellkerne (erweiterte Daten, Fig. 2a, Ergänzungstabelle 1) wurden einer ATAC-seq-Bibliothekspräparation unterzogen. Die Analyse der differentiell zugänglichen Regionen (DARs) (Diffbind, DESeq2-Modus) zwischen allen Populationen (Abb. 2a) ergab, dass die meisten Änderungen des Chromatinzustands während der frühen Phase der Gedächtnisbildung auftreten, wo 7, 862 Regionen im gesamten Genom gewinnen Zugänglichkeit (basal vs. früh, Ergänzungstabelle 2). Im Gegensatz dazu beobachteten wir relativ minimale Änderungen im Chromatinzustand beim Übergang von früh aktiviert zu spät aktiviert (582 DARs) und zwischen spät aktivierten und reaktivierten Neuronen (725 DARs), mit 48 Prozent Überlappung zwischen ihnen (Erweiterte Daten Abb. 2b ). Bemerkenswerterweise identifizierten wir einen großen Prozentsatz (52 Prozent) stabil gewonnener DARs, die in früh aktivierten Neuronen zugänglicher wurden und sowohl in spät aktivierten als auch in reaktivierten Neuronen zugänglich blieben (Abb. 2b, c; Ergänzungstabelle 2). Interessanterweise wurden, während sowohl frühe Veränderungen (basal vs. früh) als auch stabil gewonnene DARs für intergenische Regionen angereichert wurden, späte Chromatinveränderungen (früh vs. spät und spät vs. reaktiviert) hauptsächlich für Promotorstellen angereichert (Abb. 2d).

Ein funktioneller Einblick wurde gewährt, indem bewertet wurde, wie DARs durch verschiedene Histonmodifikationen markiert werden. Wir haben zuerst ChromHMM verwendet, um ein Chromatin-Zustandsmodell aus zwei unabhängigen Studien zu erstellen, in denen Bulk-Hippocampus-Gewebe vor und nach einem Fußschock verwendet wurde 21,22. Als nächstes führten wir eine Faltanreicherungsanalyse (über der erwarteten Verteilung beobachtet) der DARs für diese verschiedenen Zustände durch und zeigten, dass frühe Chromatinänderungen und stabile DARs für Enhancer-Markierungen angereichert wurden (Abb. 2e; Erweiterte Daten Abb. 2c, Ergänzungstabelle 3). .

Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Veröffentlichungen überein, die zeigen, dass die Stimulierung einer primären neuronalen Kultur eine verlängerte Enhancer-Aktivität induziert12,23. Als nächstes analysierten wir die Überlappung einzelner stabiler Loci mit H3K4me1 und H3K27ac21. Diese zwei Histonmarkierungen beschreiben verschiedene Populationen von Enhancern, die entweder „geprimt“ (nur H3K4me1), „aktiv“ (H3K4me1 und H3K27ac) oder „latent“ (keine Markierungen) sein können18. Stabile Peaks zeigten eine Verteilung sowohl über geprimte als auch über aktive Enhancer (erweiterte Daten, Abb. 2d), wobei 47 Prozent dieser Stellen als „latent“ vorhergesagt wurden (keine Überlappung zwischen DARs und Histonmarkierungen21, erhalten 1 Stunde nach FS). Um unser Modell zu bestätigen, führten wir eine Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) für H3K4me1- und H3K27ac-Histonmarker durch, gefolgt von qPCR. Aus unserer mutmaßlichen Enhancer-Modellierungsanalyse wurden vier ausgewählte Stellen ausgewählt (Erweiterte Daten Fig. 2d; Enhancer 1 – vorhergesagt geprimt, Enhancer {2- vorhergesagt aktiv, Enhancer 3 und 4 – vorhergesagt latent). In Übereinstimmung mit unserem Modell identifizierten wir zwei „latente“ Loci im Grundzustand (Enhancer 3 und 4), die sich währenddessen in einen „aktiven“ Zustand umwandeltenErinnerungFormation (Abb. 2f). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der mutmaßliche Enhancer 1 im Grundzustand „geprimt“ war und aktiv wurde, wo es einen signifikanten stabilen Anstieg der H3K27ac-Marker während der späten Phase und des Rückrufs gab (Abb. 2f). Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass das Repertoire an neu zugänglichen Enhancern in den potenzierten Engrammneuronen erweitert wurde, wo latente oder geprimte Regionen H3K4me1- und H3K27ac-Markierungen erhielten und somit zu aktiven Enhancern wurden.

Um die funktionelle Rolle zugänglicher Promotoren- und Enhancerregionen zu verstehen, führten wir eine Motivanreicherungsanalyse durch (Ergänzungstabelle 4). Unsere Daten zeigen, dass die Mehrheit (70 Prozent) der Motive auf zugänglichen Promotoren gleichermaßen angereichert sind und über alle Phasen hinweg identifiziert wurdenErinnerung(Erweiterte Daten Fig. 2e). Im Gegensatz dazu zeigte die Mehrheit der Enhancer-Sites unterschiedliche Muster von Transkriptionsfaktor (TF)-Bindungsmotiven über verschiedene Gedächtnisphasen hinweg. Interessanterweise wurden die ubiquitär exprimierten Motive des Jun-Proto-Onkogens, der Ap-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheit (d. h. Jun-Ap1) und der Regulatory Factor X (Rfx)-Familie von TFs erst nach der Anfangsphase von signifikant angereichert Codierung (Erweiterte Daten Fig. 2e). Es wurde zuvor berichtet, dass der Jun-Ap1-Komplex eine zentrale Rolle bei der Enhancer-Auswahl spielt und als Pionier-TF fungieren könnte, um Enhancer-Stellen während der Gehirnentwicklung und neuronalen Aktivität zu definieren12,24. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren Daten überein, die einen hohen Prozentsatz an latenten/geprimten Loci im Grundzustand zeigten (Abb. 2f, Erweiterte Daten Abb. 2c, d). Daher scheint es, dass die neuronale Aktivität die Bindung von Jun-Ap1 an latente Enhancer auslösen könnte, die dann Chromatin-Modifikatoren rekrutieren, die latente Enhancer aktivieren. In ähnlicher Weise legt die Anreicherung der Motive des Transkriptionsfaktors Yin Yang 1 (Yy1) nur in Enhancern aus den frühen und späten Stadien nahe, dass die Promotor-Enhancer-Organisation ein aktiver Prozess von istErinnerungBildung, da kürzlich berichtet wurde, dass Yy1 die Bildung dieser langreichweitigen Wechselwirkungen erleichtert25. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Anfangsphase vonErinnerungDie Bildung verändert die Chromatin-Zugänglichkeitslandschaft in aktivierten Neuronen, wobei langanhaltende stabile Veränderungen vorwiegend in Enhancer-Regionen auftreten.

Dynamische Veränderungen in der räumlichen Kernarchitektur und Chromatinzugänglichkeit während der InitialisierungErinnerungBildung korrespondieren mit erhöhter Promotor-Enhancer-Wechselwirkungshäufigkeit währendErinnerungabrufen

Die nukleare 3D-Architektur entwickelt sich zu einem Schlüsselfaktor bei der dynamischen Regulation der Genexpression in vielen neuronalen Funktionen26–28. Daher waren wir daran interessiert, die genauen Änderungen zu beschreiben, die während der räumlichen Chromatinorganisation auftretenErinnerungBildung und Festigung. Wir haben Hi-C-Daten aus Basalzustand und eYFP plus markierten Neuronen (früh und spät, Ergänzungstabelle 5) erstellt. Chromatin ist in zwei räumlich getrennte subnukleäre Kompartimente „A“ und „B“ unterteilt, die dem transkriptionell aktiven bzw. inaktiven Chromatin entsprechen15, 16,26. Frühe Beweise deuten darauf hin, dass neuronale Aktivität und extrinsische Signalgebung eine Reorganisation der 3D-Chromatin-Architektur induzieren könnten14,27,28. Unsere Kompartimentzustandsanalyse15, 16,26 (Abb. 3a–c) zeigte eine Relokalisierung großer Chromatinsegmente von der inaktiven (B) in die permissive Umgebung (A) (und umgekehrt) während der Anfangs- und Spätphase vonErinnerungFormation (212 Segmente wechseln von A nach B, 127 von B nach A, durchschnittliche Größe von ~436 Kbp). Interessanterweise behielten 52 Prozent der Regionen in der frühen Phase, die von B nach A wechselten, diesen Zustand in der späten Phase bei (dh blieben in Zustand A, Abb. 3b, c; Ergänzungstabelle 6). Darüber hinaus überschnitten sich fast alle diese Regionen mit gewonnenen DARs aus unserer ATAC-seq-Analyse, was den Übergang des Unterkompartiments von der inaktiven in die permissive Umgebung bestätigt (Abb. 3d). Diese Daten weisen darauf hin, dass einige Loci über verschiedene Gedächtnisphasen hinweg einem Unterkompartimentwechsel unterliegen und daher zu langfristigen Veränderungen der neuronalen Eigenschaften und Funktionen nach der anfänglichen Aktivierung beitragen könnten.

Während unsere Hi-C-Daten auf eine groß angelegte Reorganisation hindeuteten, blieb unklar, ob diese Neuorientierung die Interaktion neuer Promotor-Enhancer-Repertoires und die Feinabstimmung verschiedener Transkriptionsprogramme ermöglichte (Abb. 3e). Unter Verwendung der Promoter-Capture-Hi-C (pc-HiC)-Technik untersuchten wir die genauen Änderungen, die bei den Promoter-Enhancer-Wechselwirkungen während des Prozesses von auftretenErinnerungBildung und Rückruf. Für diese Studie haben wir kundenspezifische „Köder“ verwendet, die auf ~5000 Promotoren abzielen29. In Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen29 entdeckten wir ~19.000 (pro Gruppe) signifikante Promotor-Enhancer- (67,5 Prozent) und Promotor-Promotor-Interaktionen (46,2 Prozent) (erweiterte Daten, Abb. 3a,b).

Da Promotoren im Gehirn von Säugetieren unter der Kontrolle mehrerer regulatorischer Elemente stehen könnten14,30,31, analysierten wir die Überlappung zwischen allen interagierenden Enhancern und ihren jeweiligen Promotoren. Das haben wir bei jedem festgestelltErinnerungPhase interagieren die gleichen Promotoren häufiger mit einer bestimmten Untergruppe von Enhancern (d. h. Unique, Basal – 3243, Early - 7602, Late - 7028, Reactivated – 7244; Abb. 4a,b; Extended Data Abb. 3c, Ergänzungstabelle 7). Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Veröffentlichungen überein, die zeigen, dass mehrere Enhancer, die mehrere Gene (c-Fos und Arc) umgeben, entscheidend für ihre Aktivierung sind und ihre Interaktionsfrequenz mit ihren jeweiligen Promotoren als Reaktion auf verschiedene depolarisierende Mittel in kultivierten Neuronen verändert wird31. Wir identifizierten auch eine kleinere Teilmenge von Interaktionen, bei denen die Promotoren mit denselben Enhancern über verschiedene hinweg interagiertenErinnerungPhasen (dh häufig, ~ 31 Prozent aller Interaktionen; Ergänzungstabelle 7). Darüber hinaus zeigten reaktivierte Neuronen signifikant stärkere Interaktionswerte (wie von Chicago berechnet, Abb. 4b; Erweiterte Daten Abb. 3d). Obwohl die Anzahl einzigartiger Interaktionen in frühen, späten und reaktivierten Zuständen ähnlich war, zeigen stärkere Interaktionswerte, dass spezifische Promotor-Enhancer-Interaktionen häufiger während des Gedächtnisses auftreten

abrufen. Diese Vorstellung wurde durch 3C-Experimente weiter bestätigt, wobei Primer entwickelt wurden, um die Häufigkeit der Wechselwirkung zwischen ausgewählten Enhancern (E) und Genpromotoren (P) zu messen, die für die Untereinheit D (Eif3d) des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 3 oder den ionotropen Glutamatrezeptor Kainat kodieren 3 (Grik3) (Abb. 4c). Unsere Daten zeigten, dass reaktivierte Neuronen im Vergleich zu den anderen Populationen eine signifikante Zunahme der Interaktionsfrequenz zwischen dem Eif3d-Promotor und dem ausgewählten Enhancer aufwiesen (Abb. 4c). Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen häufiger während auftretenErinnerungabrufen.

Als nächstes fragten wir, ob die über pc-HiC identifizierten dynamischen langreichweitigen Wechselwirkungen Chromatinregionen entsprechen, die zugänglicher werden, wie über ATAC-seq bestimmt. Dies würde bestätigen, dass die erhöhte Zugänglichkeit eine funktionelle Konsequenz hat, indem sie neue Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen herbeiführt. Um dies zu erreichen, verglichen wir die Überlappung zwischen interagierenden Enhancern in jeder Zellpopulation mit DARs (beobachtet) oder einem zufälligen Satz zugänglicher genomischer Loci (erwartet). Unsere Analyse ergab eine signifikante Überlappung zwischen beiden gewonnenen DARs in aktivierten frühen Neuronen und stabil gewonnenen DARs mit den interagierenden Enhancern in allen Zellpopulationen (alle Ps < 0.0001,="" erweiterte="" daten,="" abb.="" 3e).="" im="" gegensatz="" dazu="" treten="" änderungen="" in="" der="" chromatinzugänglichkeit="" auf,="" die="" während="" der="" späten="" phase="" von="">ErinnerungKonsolidierung und Reaktivierung überlappten nicht signifikant mit interagierenden Enhancern (erweiterte Daten, Fig. 3e). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der Zugänglichkeitsgewinn während der Gedächtniscodierung ein Priming-Ereignis ist und diese geprimten Loci in späteren Phasen von de-novo-funktionellen Promotor-Enhancer-Interaktionen involviert sindErinnerungFormation. Diese dynamische Landschaft wird durch die Visualisierung der genomischen Regionen um das eukaryotische Gen für den Translationsinitiationsfaktor 5 der Untereinheit A (Eif5a) veranschaulicht (Abb. 4d). Diese zeitliche molekulare Zergliederung der Engramm-Lebensdauer zeigt, wie koordiniert das Priming des epigenetischen Zustands einer Zelle währendErinnerungKodierung und Konsolidierung erleichtern langreichweitige Interaktionen während der Reaktivierung.