Teil 1: Verbascosid schützt Pankreaszellen vor ER-Stress
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 und Carla Perego 1,*
Abstrakt:
Erhebliche epidemiologische Beweise deuten darauf hin, dass eine Ernährung, die reich an Polyphenolen ist, vor der Entwicklung von Typ-2-Diabetes schützt. Das PhenylethanoidglykosidVerbascosid/Acteosid, eine weit verbreitete polyphenolische Pflanzenverbindung, hat mehrere biologische Eigenschaften, darunter starke antioxidative, entzündungshemmende und neuroprotektive Aktivitäten. Das Ziel dieser Forschung war es, die möglichen Auswirkungen von zu testenverbascosidauf Bauchspeicheldrüsenzellen, ein Ziel, das noch nie zuvor getestet wurde. Maus- und Human-Zellen wurden damit inkubiertverbascosid(0.8–16 uM) für bis zu fünf Tage und eine Kombination aus biochemischen und bildgebenden Verfahren wurden verwendet, um das Überleben und die Funktion der -Zelle unter normalen oder Stress induzierenden Bedingungen des endoplasmatischen Retikulums (ER) zu beurteilen. Wir fanden eine dosisabhängige Schutzwirkung vonverbascosidgegen oxidativen Stress in klonalen und humanen Zellen. Mechanistische Studien zeigten, dass das Polyphenol -Zellen vor ER-Stress-vermittelten Dysfunktionen schützt, indem es die Aktivierung des Proteinkinase-RNA-ähnlichen endoplasmatischen Retikulumkinase (PERK)-Zweigs der entfalteten Proteinantwort moduliert und die mitochondriale Dynamik fördert. Als Ergebnis wurden in diesen Zellen eine erhöhte Lebensfähigkeit, Mitochondrienfunktion und Insulingehalt nachgewiesen. Diese Studien liefern den Beweis dafürverbascosidstärkt die Fähigkeit von -Zellen, mit ER-Stress fertig zu werden, einem wichtigen Beitrag zur Dysfunktion und zum Versagen von -Zellen bei diabetischen Erkrankungen, und unterstützt das therapeutische Potenzial von Verbascosid bei Diabetes.
Schlüsselwörter:
Verbascosid; Polyphenole; insulinproduzierende Zellen; Diabetes; UPR; oxidativen Stress; ER-Stress; VORTEIL; entzündungshemmend; Mitochondrien
1. Einleitung
Diabetes ist eine chronische Erkrankung, von der Hunderte Millionen Menschen betroffen sind [1]. Unterschiedliche Ätiologien kennzeichnen Typ-1- (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D), die beide einen Insulinmangel aufweisen [2]. Insulin reguliert die Plasmaglukosekonzentration, stimuliert die Glukoseaufnahme in Muskel- und Fettzellen und moduliert den Glukosestoffwechsel in der Leber. Nährstoffverfügbarkeit, Hormone und neurale Inputs regulieren die Insulinsekretion der Bauchspeicheldrüse und halten die Blutzuckerkonzentrationen in einem physiologischen Bereich [3–5]. Daher führt eine -Zell-Dysfunktion zu Diabetes, der durch Fasten-Hyperglykämie gekennzeichnet ist.
T2D ist ein fortschreitender Zustand, bei dem Insulinresistenz und -Zellfehlfunktionen miteinander verbunden sind und neuere Erkenntnisse das Interesse an der entscheidenden primären Rolle von -Zellen für den hyperglykämischen Status verstärkt haben [6,7]. Bei nicht-diabetischen fettleibigen Personen kompensieren die Zellen die Insulinresistenz durch eine erhöhte Sekretion des Hormons. Bei einigen Probanden sinkt jedoch die Insulinämie, wenn sich ihr Zustand verschlechtert, und der Glukosespiegel steigt bis zur Hyperglykämie an [8,9].
Glukose ist der wichtigste Modulator von -Zellfunktionen. Die Glukosestimulation beeinflusst die Regulation von Genen und die Expression von Proteinen, die an vielen Zellfunktionen wie Glykolyse, Insulinsynthese und -sekretion beteiligt sind [10]. Die Glucose-induzierte Insulinsekretion beruht auf dem oxidativen Metabolismus, um Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren, und physiologisch wird eine geringe Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert. Allerdings sind -Zellen nicht sehr gut mit Scavenger-Enzymen ausgestattet und diese Schwäche macht sie sehr anfällig für oxidativen Stress [11,12]. Wenn der oxidative Stress zunimmt, nimmt die Insulinproduktion der Zellen ab und die Zellen produzieren Zytokine, die Zellschäden durch Entzündung und Apoptose auslösen [13]. Obwohl die reduzierte Zellmasse zuvor dem Zelltod zugeschrieben wurde, deuten neuere Studien interessanterweise auf eine wichtige Rolle der Zelldifferenzierung hin [14,15]. Es ist deutlich geworden, dass mehrere Stufen nach T2D fahren. Metabolische und oxidative Angriffe verursachen Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER), der zu einer Abnahme der Insulinsynthese und -sekretion führt, Entzündungsprozesse folgen der Freisetzung von Zytokinen und Zellverlust kann durch Apoptose und Dedifferenzierung auftreten. Dieses Wissen ist grundlegend, um geeignete Behandlungsstrategien zu entwickeln, da oxidativem Stress und Entzündungen entgegengewirkt werden kann und die Plastizität von Pankreaszellen die Möglichkeit bietet, Stammzellen in -Zellen umzuwandeln, wie an Mäusen nachgewiesen wurde [16].
Vor kurzem hat die Anfälligkeit von -Zellen gegenüber oxidativem Stress erfolgreich zur Verwendung von diätetischen Antioxidantien zur Vorbeugung von Diabetes geführt [17]. Olivenöl gehört zu den interessantesten antioxidativen Lebensmitteln und ist seit den alten Griechen für seine wohltuenden Eigenschaften bekannt. Olivenöl enthält eine gute Menge an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) und mehrere Polyphenole wie Tyrosol, Hydroxytyrosol, Oleuropein und Verbascosid.
Verbascosid, auch als Acteosid bekannt, ist ein Phenylethanoidglykosid, das aus Olea europea, Pflanzen der Art Verbascum und 23 anderen Pflanzenfamilien extrahiert wird [18–20]. Es kann auch aus Olivenöl-Nebenprodukten gewonnen werden (es wird im Abwasser von Olivenmühlen angereichert, das aus der Olivenverarbeitung stammt) oder durch Stoffwechseltechnik und synthetische Biologie hergestellt werden [21].
Bisher liegen keine Daten zur Bioverfügbarkeit von Verbascosid beim Menschen vor. Studien, die an Mäusen, SKBR3- und Caco-2-Zellen durchgeführt wurden, legen nahe, dass es für nicht metabolisiertes Verbascosid möglich sein könnte, die Darmbarriere zu überwinden, im Blutplasma zu zirkulieren und antioxidative Wirkungen auszuüben [20,22,23]. Im Gegensatz zu den meisten pflanzlichen Polyphenolen wirkt Verbascosid hauptsächlich auf Zellen durch die Modulation der Gentranskription einer Vielzahl von Enzymen und regulatorischen Faktoren mit antioxidativer und entzündungshemmender Wirkung [24–30].
Obwohl viele positive Wirkungen von Verbascosid auf die menschliche Gesundheit bekannt sind, gibt es keine Daten über seine Wirkung auf Pankreaszellen. Da oxidativer Stress und Entzündung die Grundlage der T2D-Pathogenese sind, untersuchten wir, ob die Behandlung mit Verbascosid die Lebensfähigkeit der -Zellen verbessern könnte und
Funktion bei ER-Stress-induzierenden Bedingungen und wir haben die molekularen Mechanismen seiner Wirkung charakterisiert. Unsere Daten zeigen, dass Verbascosid oxidativen Stress und Entzündungen der -Zellen verhindert, indem es die Aktivierung der entfalteten Proteinantwort moduliert und die mitochondriale Dynamik fördert, was zu einer erhöhten Lebensfähigkeit der -Zellen und Insulingehalt führt.
2. Materialien und Methoden
2.1. Zellkultur und Materialien
Maus-tc3-Zellen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Hanahan – Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA [31]) wurden in RPMI 1640-Medium (Euroclone SpA, ECB90) kultiviert 0, Pero MI, Italien), ergänzt mit 10 Prozent (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italien), 1 Prozent (v/v) Penicillin-Streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italien) und 1 Prozent (v/v) L-Glutamin (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italien). Menschliche Langerhans-Inseln wurden in Mailand (Niguarda Ca' Granda) von toten Multiorganspendern gemäß dem von Ricordi et al. [32]; sie wurden in RPMI-Kulturmedium kultiviert, das 5,5 mmol/l Glucose, 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 0,7 mM Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, Italien) enthielt. Es wurden vier verschiedene Inselpräparate verwendet, die Inselreinheit betrug 80 ± 10 Prozent. Inselisolation und Inselstudien wurden von der Ethikkommission des Krankenhauses Niguarda Ca' Granda in Mailand genehmigt (11.12.2009). tc3-Zellen wurden mit 0,8, 1,6 und 16 uM Verbascosid (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), Kaffeesäure und Hydroxytyrosol (freundliches Geschenk von Prof. Dell'Agli, Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Universita degli Studi di Milano, Mailand, Italien) in komplettem RPMI-Medium für 5 Tage, während menschliche Inseln mit 16 &mgr;M Verbascosid. Mit Methanol/Ethanol behandelte Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Um oxidativen Stress zu induzieren, wurden die Zellen vor der Analyse mit H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM in komplettem RPMI-Medium für 20 min vor der Analyse behandelt, während die Behandlung mit Tunicamycin 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich ) für 7 h wurde durchgeführt, um ER-Stress zu induzieren.
2.2. Nachweis der Zelllebensfähigkeit durch MTT-Test
Die Zellen wurden in 96 Platten mit mehreren Vertiefungen ausplattiert und fünf Tage nach der Behandlung mit Verbascosid wurden sie mit 0,5 mg/ml MTT (3-(4,5-Dimethyltiazol{{7}) inkubiert. }yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) für 4 h in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 oC. Nach der Inkubation wurden die Zellen vorsichtig in 100 &mgr;l DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italien) resuspendiert und die Extinktion bei 540 nm wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Benchmark, Mikroplatten-Lesegerät, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als fache Zunahme gegenüber Kontrollproben ausgedrückt.
2.3. Nachweis des Zelltods durch Durchflusszytometrie
Fünf Tage nach Inkubation mit 16 µM Verbascosid wurden die &bgr;-Zellen durch 7-minütige Inkubation mit Trypsin/EDTA abgelöst, gesammelt und zentrifugiert; das Pellet wurde vorsichtig in phosphatgepufferter Salzlösung mit niedrigem Salzgehalt resuspendiert. Die Zellen wurden mit MuseTM Zähl- und Lebensfähigkeitsreagenz (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als Prozentsatz toter Zellen gegenüber der Gesamtheit ausgedrückt.
2.4. ROS-Generation
Intrazelluläre ROS wurden mit DCFDA (2/,7/-Dichlorfluoresceindiacetat) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA) bewertet, einer membrandurchlässigen Sonde, die fluoreszierend wird, wenn sie an ROS gebunden ist [34]. tc3-Zellen wurden mit 15 uM DCFDA in Krebs-Ringer-Puffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 und 2 mM CaCl2) vorbeladen.
ergänzt mit 11 mM Glucose für 1 h bei 37 oC. Der ROS-Gehalt wurde 30 min lang sowohl unter Basal- als auch unter Stressbedingungen mit einem Mikroplatten-Reader (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Schweiz) erfasst. Mittelwerte und Standardabweichungen basierten auf drei unabhängigen Experimenten.
2.5. Western-Blotting
tc3-Zellen wurden gesammelt und in RIPA-Puffer (15 0 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 % TERGITOLw NP40, 0,5 % Deoxycholat), versetzt mit Aprotinin (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) und Roche-Inhibitoren (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) für 40 min bei 4 oC. Die Proteinkonzentration wurde durch Bradford-Assay [35] unter Verwendung von Bradford-Reagenz (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA) bestimmt, 30 ug Proteine wurden durch 10 % SDS-PAGE aufgelöst und auf Nitrozellulosemembranen (Millipore, Burlington MA, USA). Primärantikörper wurden für 2 h in Blockierungspuffer mit 5-prozentiger fettfreier Milch oder 5-prozentiger BSA-Lösung aufgetragen; Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: Maus-Anti- --Aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), Maus-Anti-Acrolein (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), Maus-Anti-BIP (freundliches Geschenk von Prof. Borgese Nica, Institut für Neurowissenschaften, CNR, Mailand, Italien), Kaninchen-Anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), Maus-Anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), Kaninchen-Anti-Phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), Maus-Anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc ., 4814, Danvers, MA, USA), Kaninchen-anti-Phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), Kaninchen-anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), Schaf-Anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), Kaninchen-Anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), Kaninchen-Anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) und Kaninchen-anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signalling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Die HRP-konjugierten sekundären Antikörper (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) wurden in einer Verdünnung von 1:5000 verwendet. Proteine wurden unter Verwendung des ECL-Nachweissystems (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italien) unter Verwendung des Odyssey Fc Image-Systems (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Deutschland) nachgewiesen und die Bandendichte wurde durch die Software Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als fache Zunahme gegenüber Kontrollproben ausgedrückt.
2.6. Mitochondrienmembranpotential
tc3-Zellen und menschliche Langerhans-Inseln wurden mit 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mailand, Italien) oder 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Mailand, Italien) für 30 min bei 37 inkubiert oC; Fluoreszenzintensitäten wurden mit dem Mikroplatten-Reader TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em für MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em für MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Schweiz) erfasst. Die Zellen wurden mit 500 &mgr;M H 2 O 2 für 20 min inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde wie zuvor beschrieben erfasst. Mittelwerte und Standardabweichungen basierten auf drei verschiedenen Experimenten.
2.7. Mitochondriale Morphologie und Dynamik
tc3-Zellen wurden mit 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mailand, Italien) in 11 mM Glukose-Krebs-Ringer-Puffer bei 37 °C für 30 min vorbeladen. Proben wurden in einer Abbildungskammer positioniert und Zufallsfelder wurden unter Verwendung des Rhodan-Filters des Mikroskops Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Deutschland) abgebildet. Um die mitochondriale Morphologie zu bewerten, wurden die folgenden Parameter mit der Partikelanalysesoftware ImageJ analysiert: Fläche (um2), Zirkularität (4mArea2/Perimeter2) und maximaler Durchmesser von Feret (um) [37].
Für Zeitrafferexperimente wurde Einzelzellbildgebung mit 1 Bild pro Sekunde für 30 s unter Kontroll- oder oxidativen Stressbedingungen durchgeführt. Um die mitochondriale kumulative Distanz (um2) zu messen, wurden die Bilder zuerst für das Ausbleichen von Fotos korrigiert, dann wurden die Videos mit einem bestehenden Image-Pro Plus Plug-in (Objektverfolgung) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) analysiert. Bis zwölf
Zellen wurden in drei unabhängigen Experimenten abgebildet und die Daten wurden als Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt.
2.8. Insulinsekretion
Vom Menschen isolierte Langerhans-Inseln wurden in einer 96--Well-Platte mit einer Dichte von 20 Inseln pro Well ausgesät, und nach 5 Behandlungstagen wurden der Insulingehalt und die Insulinsekretion als Basalwert (3,3 mM Glucose) gemessen und stimuliert (16,7 mM Glucose )-Bedingungen mittels ELISA-Immunoassay (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Schweden).
2.9. Statistische Analysen
Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.0 an unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt. Mittelwerte zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests ausgewertet, und ein p-Wert < 0,05="" wurde="" als="" beweis="" für="" statistische="" signifikanz="" angenommen.="" die="" mittelwerte="" von="" drei="" oder="" mehr="" gruppen="" wurden="" durch="" varianzanalyse="" (anova)="" verglichen,="" gefolgt="" von="" einem="" multiplen="" post-hoc-vergleichstest="" (tukey's).="" der="" verwendete="" statistische="" test,="" genaue="" p-werte="" und="" die="" anzahl="" der="" wiederholungen="" (n)="" sind="" in="" den="" legenden="" der="" einzelnen="" abbildungen="" angegeben.="" fehlerbalken="" in="" den="" abbildungen="" zeigen="" den="" mittelwert="" ±="" sd="" oder="" den="" mittelwert="" ±="" se,="" wie="">
3. Ergebnisse
3.1. Verbascoside verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen
Da es keine Daten zur Wirkung von Verbascosid auf -Zellen gab, führten wir einen MTT-Test durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und wie in 1A gezeigt, wurde ein positiver dosisabhängiger Trend beobachtet. Daher haben wir für weitere Studien die Konzentration von 16 uM ausgewählt, die sich statistisch als wirksam erwiesen hat, um die Lebensfähigkeit der -Zellen zu verbessern. Mittels Durchflusszytometrie untersuchten wir die Auswirkung einer fünftägigen Inkubation von Verbascosid auf das Überleben der -Zellen unter basalen Bedingungen und nach 2 {{21} } min Vorbehandlung mit 500 µM H2O2. Im Grundzustand beeinflusste Verbascosid das Überleben der Zellen nicht, was darauf hindeutet, dass die im MTT-Assay beobachtete erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen auf eine verbesserte mitochondriale Aktivität zurückzuführen sein könnte. Während nach H2O2-Exposition eine Vorbehandlung mit 16 μM Verbascosid den durch oxidativen Stress induzierten Zelltod signifikant reduzierte (Abbildung 1B,C). Verbascosid ist ein komplexes Molekül, das durch hydrolysierende Enzyme modifiziert werden kann [18]. Um zu testen, ob Verbascosid-Metaboliten für die beobachtete Schutzwirkung verantwortlich sein könnten, wurden tc3-Zellen mit Hydroxytyrosol und Kaffeesäuren (0,8 und 16 uM) für 5 Tage behandelt. Beide Metaboliten verbesserten die Zellviabilität nicht, im Gegenteil, ein zytotoxischer Effekt, relevanter nach H2O2-Exposition, wurde für die Konzentration von 16 uM nachgewiesen (Abbildung S1). Dieser Befund beweist, dass Verbascosid und nicht seine Metaboliten die Schutzwirkung auf die H2O2-Behandlung ausüben.
3.2. Verbascosid moduliert die Redox-Homöostase und übt eine entzündungshemmende Wirkung in -Zellen aus
Wir bestätigten zuerst in tc3-Zellen die entzündungshemmenden und antioxidativen Wirkungen von Verbascosid, die in anderen Zelltypen beobachtet wurden [24,29,34]. Die ROS-Abfangaktivität von Verbascosid wurde mit tc3-Zellen bewertet, die mit der ROS-spezifischen zellgängigen Sonde DCFDA (2/,7/-Dichlorfluoresceindiacetat) markiert waren. Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde nach der Vorbehandlung mit Verbascosid sowohl unter basalen als auch unter oxidativen Stressbedingungen eine signifikante Abnahme des ROS-Gehalts festgestellt.
Western-Blot-Analysen zeigten eine signifikante Abnahme der Expression der oxidativen Stressmarker Acrolein und 4-hydroxynonenal (HNE) in mit Verbascosid behandelten Zellen. Darüber hinaus fanden wir eine Zunahme der Superoxiddismutase (SOD1)-Expression, was darauf hindeutet, dass Verbascosid seine antioxidative Aktivität wahrscheinlich mit zwei verschiedenen Mechanismen ausübt, direkt als ROS-Scavenger und indirekt durch Induktion der Expression antioxidativer Enzyme (Abbildung 2B,C).
Die entzündungshemmende Wirkung von Verbascosid auf -Zellen wurde durch Bewertung der Aktivierung des NFKB-Signalwegs, des wichtigsten entzündungsfördernden Signalwegs in diesen Zellen, bewertet [38]. Durch Western-Blot-Analyse fanden wir eine reduzierte Expression des Inhibitors des Kernfaktors Kappa B (IKB) und des Kernfaktors Kappa-Light-Chain-Enhancer (NFKB) und eine signifikante Abnahme der NFKB-Phosphorylierung in vorbehandelten Zellen, was die Hypothese von stützt die Wirksamkeit von Verbascosid zur Reduzierung von Zellentzündungen (Abbildung 2D,E).
3.3. Verbascosid moduliert die entfaltete Proteinantwort von -Zellen
Anschließend analysierten wir eingehend den molekularen Mechanismus, durch den Verbascosid antioxidative und entzündungshemmende Funktionen ausübt, wobei wir uns auf das endoplasmatische Retikulum konzentrierten, das sich als Schlüsselsensor für Stoffwechsel- und Stresssignale in -Zellen herausstellt. Unter Stressbedingungen baut die Organelle eine homöostatische Reaktion auf, die als unfolded protein response (UPR) bekannt ist und darauf abzielt, die ER-Funktion wiederherzustellen; Die übermäßige Aktivierung dieses Signalwegs führt jedoch zu Apoptose [39,40].
Marker für erhöhten ER-Stress sind die Hochregulierung von Chaperonproteinen und die Aktivierung der UPR-Antwort. Die Western-Blotting-Analyse von mit Verbascosid behandelten Zellen ergab verringerte Spiegel der beiden Chaperonine Hitzeschockprotein 70 (HSP70) und bindendes Immunglobulinprotein (BIP) (Abbildung 3A,B). Darüber hinaus wurden eine signifikante Verringerung der Expression der Proteinkinase-RNA-ähnlichen ER-Kinase (PERK) und eine verringerte Phosphorylierung ihres nachgeschalteten Effektors, des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 (eIF2), festgestellt.
