Teil 2|Eine chinesische Kräuterformel, Tonic The Kindney, verbessert die Muskelatrophie durch die Regulierung des mitochondrialen Qualitätskontrollprozesses bei 5/6 nephrektomierten Ratten

Dongtao Wang1,3, Jianping Chen2, Xinhui Liu1, Ping Zheng1, Gaofeng Song1, Tiegang Yi1,2 & Shunmin Li1

Muskelatrophieist eine der schwerwiegenden Komplikationen der chronischen Nierenerkrankung (CKD). Eine Dysregulation des mitochondrialen Qualitätskontrollprozesses (MQC), einschließlich einer verminderten mitochondrialen Biogenese, beeinträchtigt die mitochondriale Dynamik und induziert die Aktivierung der Mitophagie und spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Muskelschwund. Diese Studie zielte darauf ab, die Auswirkungen von Jian-Pi-Yi-Shen (JPYS)-Abkochung auf zu beobachtenMuskelatrophiebei CNE-Ratten und untersuchen ihren möglichen Mechanismus auf die Regulation von MQC-Prozessen. Die 5/6 nephrektomierten Ratten wurden zufällig in 2 Gruppen eingeteilt: CKD-Gruppe und JPYS-Gruppe. Außerdem waren scheinoperierte Ratten eine Scheingruppe. Alle Ratten wurden 6 Wochen lang behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung von JPYS-Abkochung Körpergewichtsverlust, Muskelverlust, Verringerung der Muskelfasergröße, Muskelproteinabbau und erhöhte Muskelproteinsynthese verhinderte. Darüber hinaus erhöhte JPYS-Abkochung den Mitochondriengehalt und die Biogenese-Proteine ​​und regulierte die Autophagie- und Mitophagie-Proteine ​​herunter. Darüber hinaus erhöhte die JPYS-Abkochung die mitochondrialen Fusionsproteine, während sie die mitochondrialen Spaltproteine ​​verringerte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die JPYS-Abkochung den mitochondrialen Gehalt und die Biogenese erhöhte, das Gleichgewicht zwischen Spaltung und Fusion wieder herstellte und den Autophagie-Lysosomen-Weg (Mitophagie) hemmte. Insgesamt zeigten unsere Daten, dass JPYS-Abkochung vorteilhaft istMuskelatrophiebei CKD, was möglicherweise mit der Modulation des MQC-Prozesses in Verbindung steht.

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Diskussion

Viele Rohextrakte und isolierte Wirkstoffe aus der TCM wurden identifiziert und zeigten eine hervorragende Wirksamkeit, insbesondere bei der Verbesserung von Entzündungen und Stoffwechselstörungen bei verschiedenen Arten vonNierenerkrankungen. Muskelatrophieist eine schwerwiegende Komplikation von CKD-Patienten, die durch einen fortschreitenden Verlust von Muskelproteinen gekennzeichnet ist. Dieses unerwünschte Ergebnis verringert die Lebensqualität und das Überleben erheblich16, 34. Die wichtigsten Merkmale vonMuskelatrophiesind eine signifikante Verringerung des Körpergewichts und ein Verlust an Muskelmasse, was auf eine CKD-assoziierte Stoffwechselerkrankung hindeutet, die speziell auf die Muskulatur abzielt. Als TCM hat sich JPYS-Abkochung als potenzielles therapeutisches Mittel zur Behandlung herausgestelltMuskelatrophieund die Muskelmasse erhöhen. Um die Anti-MuskelatrophieWirkung des JPYS-Dekokts und seines möglichen Mechanismus wurde in der vorliegenden Studie an 5/6-Nephrektomie-induzierten CNE-Ratten durchgeführt, und die Ergebnisse haben gezeigt, dass der JPYS-Dekokt Körpergewichtsverlust, Muskelmasseverlust, Abnahme der Muskelfasergröße und Muskelproteinproteolyse erheblich verhinderte , zusammen mit der Hemmung von UPS und FoxO3a. Darüber hinaus könnte die JPYS-Abkochung den mitochondrialen Gehalt und die Biogenese erhöhen, das Gleichgewicht zwischen Spaltung und Fusion wiederherstellen und die Aktivierung von Autophagie und Mitophagie blockieren. Die Skelettmuskelmasse hängt von einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Proteinsynthese und -abbau ab. Und die beiden Prozesse sind eng miteinander verknüpft35. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass JPYS-Abkochung in der Lage war, die Proteinsynthese zu steigern und gleichzeitig den Muskelabbau bei CNE-Ratten zu hemmen. Um die zugrunde liegenden Mechanismen der Verzögerung des Proteinabbaus durch JPYS-Abkochung zu untersuchen, untersuchten wir die Wege des Proteinabbaus.

Erhöhtes Atrogin-1 und MuRF-1 förderten die Ubiquitinierung und den 26 S-Proteasom-vermittelten Abbau von Strukturproteinen, was den Muskelproteinabbau erhöhte und somit in unseren früheren Studien zum Muskelschwund beitrug36, 37. Ubiquitinierte Proteine ​​sind schnell durch das 20S-Proteasom abgebaut, einschließlich Chymotrypsin und Trypsin-ähnlicher Aktivitäten, die zu Ub-konjugierten Proteinen in kleine Peptide führen38. In dieser Studie zeigten unsere Ergebnisse, dass die JPYS-Abkochung die erhöhten Arogin-1- und MuRF-1-Proteine ​​sowie Chymotrypsin- und Trypsin-ähnliche Aktivitäten im CNE-Muskel verhinderte. Frühere Studien identifizierten, dass die Behandlung mit TCM (Zhimu-Huangbai Herb-Pair) die Atrogin-1- und MuRF1-Expression bei krebsinduzierter Kachexie im Muskel von Mäusen hemmte. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass JPYS-Abkochung den Abbau von Muskelprotein hemmen könnte, indem es die Aktivierung von UPS bei CNE-Ratten hemmt.

FoxO3a kann an mehreren Stellen durch Akt phosphoryliert werden, das als Gerüst im Zytoplasma fungiert, und im Zytosol sequestriert werden, wodurch sie nicht mehr an die Promotoren ihrer Zielgene im Zellkern binden können, um ihre Transkription zu regulieren39. Eine frühere Studie zeigte, dass die Aktivierung von FoxO3a im Muskel zu einer erhöhten Transkription dieser Retrogene wie Atrogin-1 und MuRF1 führt und die Wirkung der Proteolyse stimuliertMuskelatrophie⁴⁰. Unser Ergebnis zeigte, dass die JPYS-Abkochung die Phosphorylierungsspiegel von FoxO3a signifikant erhöhte und den Gesamtspiegel des FoxO3a-Proteins im Muskel von CNE-Ratten abschwächte. Eine frühere Studie berichtete, dass die Behandlung mit TCM (Zhimu-Huangbai Herb-Pair) die Expression des gesamten FoxO3-Proteins im diabetischen Muskel reduzierte26. Es wurde berichtet, dass konstitutiv aktives FoxO3a die Arogin-1-Transkription induzierte undMuskelatrophie, während die Hemmung der FoxO3a-Aktivierung blockiertMuskelatrophiein vivo und in vitro40. In Kombination mit den Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass die JPYS-Abkochung den Proteinabbau der Skelettmuskulatur effizient reduzieren könnte, möglicherweise durch Hemmung der FoxO3a-Transkriptionsfaktoren.

Die Fähigkeit derSkelettmuskulatursich an zelluläre Störungen anzupassen, hängt stark von der mitochondrialen Biogenese ab. Kürzlich wurde gezeigt, dass die mitochondriale Muskelmenge bei CNE abnimmt^{41, 42}, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmte, und die Reduktion wurde durch JPYS-Abkochung gehemmt. Die Hauptschritte des Prozesses der mitochondrialen Biogenese umfassen Signalereignisse, die zur Transkriptionsregulation von Kerngenen wie NRF1 führen, hauptsächlich vermittelt durch PGC-1 43. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Proteine ​​der mitochondrialen Biogenese im CNE-Muskel herunterreguliert zu sein schienen, wie durch den niedrigeren Gehalt an PGC-1 und NRF-1 seiner Zielproteine ​​angezeigt wird, der durch JPYS-Abkochung gehemmt wurde. Die Überexpression von PGC-1 im Skelettmuskel erhöht den mitochondrialen Gehalt und die oxidative Kapazität durch seine Modulation einer großen Gruppe von Genen, die am Stoffwechsel beteiligt sind44, 45. Darüber hinaus neigen die PGC-1a-Spiegel dazu, bei Muskelschwundzuständen reduziert zu sein46 , 47 und eine muskelspezifische Überexpression von PGC-1a dämpft diesen Muskelverlust nachweislich48. Insgesamt implizierten unsere Daten, dass es möglich ist, dass JPYS-Abkochung die Expression von PGC-1 /NRF1 und die nachfolgende mitochondriale Biogenese im CNE-Muskel fördert.

Autophagie/Mitophagie ist ein hoch konservierter homöostatischer Mechanismus, der durch die lysosomale Maschinerie von Massenzytoplasma, langlebigen Proteinen, Mitochondrien und Organellen zum Abbau und Recycling verwendet wird49. Die Selektivität der Mitophagie wird durch die Proteine ​​PINK1, Parkin und BNIP3L gesteuert. PINK1 phosphoryliert Ubiquitin an Ser65 von ubiquitinierten Proteinen der äußeren mitochondrialen Membran (OMM) und der Ubiquitin-ähnlichen Domäne von Parkin. Nach der Phosphorylierung verstärkt Parkin das Mitophagiesignal, indem es mehr Ubiquitinketten auf OMM-Proteinen erzeugt, die weitere Substrate für PINK1 sein können. BNIP3L wird auf dem OMM stabilisiert, interagiert mit prozessiertem LC3II, das die Sequestrierung von Mitochondrien innerhalb des Autophagosoms zum Abbau fördern kann⁹. In unserer Studie zeigten die Ergebnisse, dass die autophagischen Marker LC3II und p62 sowie die mito-phagen Marker PINK1 und Parkin im CNE-Muskel signifikant erhöht waren und dies durch JPYS-Abkochung verzögert wurde. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Autophagie, einschließlich Mitophagie, oft in mehreren Modellen von stimuliert wirdMuskelatrophie, wie Denervation und CKD^{37, 50}. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die JPYS-Abkochung verbessert hatMuskelatrophiedurch Hemmung der Autophagie- und Mitophagiewege.

Es wird berichtet, dass Mitochondrien hochdynamische Organellen sind, die durch Spaltung und Fusion ständig in Bewegung sind51. Es wird angenommen, dass die mitochondriale Fusion den Austausch ihres Inhalts, einschließlich der mitochondrialen DNA (mtDNA) und Proteinen, ermöglicht und so die mitochondriale Qualität und mtDNA-Integrität aufrechterhält. Es wird angenommen, dass die mitochondriale Fusion die Ansammlung beschädigter und defekter Komponenten durch Umverteilung ihres Inhalts einschließlich der mitochondrialen DNA verhindert (mtDNA), Lipide, Metaboliten und Proteine, während die mitochondriale Spaltung es den Mitochondrien ermöglicht, schwer beschädigte und dysfunktionale Mitochondrien durch Mitophagie zu trennen⁵². In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die Fusionsproteine ​​Mfn-2 und OPA-1 im CNE-Muskel herunterreguliert wurden und diese Veränderung durch JPYS-Abkochung verhindert wurde. Mfn2 und OPA-1 spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der mtDNA-Integrität, und ihre Herunterregulierung könnte eine mitochondriale Spaltung sowie eine mitochondriale Fragmentierung und Mitophagie induzieren53. Aufgrund einer Rolle bei der mitochondrialen Fusion wurde die Spaltung in Verbindung gebracht

die Entfernung stark geschädigter Mitochondrien durch Induktion der Mitophagie. Tatsächlich zeigten unsere Ergebnisse, dass die Fis-1- und Drop-1-Expression die CKD-Muskeln verstärkten und dies durch JPYS-Abkochung verhindert wurde, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmte50, 54. Daher die Ergebnisse der vorliegenden Studie weisen darauf hin, dass der JPYS-Sud die mitochondriale Dynamik der Fusion und Spaltung modulierte, indem er die Mfn2- und OPA-1-Expression erhöhte und gleichzeitig die Fis-1- und Drop-1-Expression verringerte.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine 6--wöchige JPYS-Abkochungsbehandlung das Körpergewicht bewahrte, Muskelmasseverlust und Abnahme der Muskelfasergröße und Muskelproteinabbau verhinderte, zusammen mit der Hemmung von FoxO3a und UPS bei CNI-Ratten. Darüber hinaus schwächte die JPYS-Abkochung die CKD-induzierten Störungen der QMC-Prozesse ab, indem sie die mitochondriale Biogenese erhöhte, das Gleichgewicht zwischen Spaltung und Fusion wiederherstellte und den Autophagie-Lysosomen-Weg (Mitophagie) hemmte. Dieser Befund deutet auf eine vielversprechende Strategie hin, die eine Verbesserung der Dysregulation von MQC-Prozessen verhindern und behandeln könnteMuskelatrophiebei CNI.

Acteosid einZistanchegute Wirkung haben aufNiere

Materialen und Methoden

Zusammensetzung der JPYS-Abkochung.

Pflanzenmaterial: Astragali Radix (Lot. 150621; Wurzeln von Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. Mongolic (Bge.) Hsiao), Atractylodis Macrocephalae Rhizoma (Lot. 141230; Rhizome von Atractylodes macrocephala Koidz.), Dioscoreae Rhizoma (Lot . 150615; Rhizome von Dioscorea gegenüber Tunb.), Cistanches Herba (Lot. 150621; Kräuter vonCistanche DeserticolaYC Ma), Amomi Fructus Rotundus (Lot. 150617; Früchte von Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.), Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Lot. 150626; Wurzeln und Rhizome von Salvia miltiorrhiza Bge.), Rhei Radix et Rhizoma (Lot. 150104 ; Wurzeln und Rhizome von Rheum palmatum L.) und Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle (Charge 150615; Wurzeln und Rhizome von Glycyrrhiza uralensis Fisch.) wurden von Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd (Shenzhen, China) gekauft. Die Pflanzenmaterialien wurden von Dr. Jianping Chen anhand ihrer morphologischen Eigenschaften authentifiziert. Die Belegexemplare wurden in der pharmazeutischen Abteilung des Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital unter den Nummern 2010015Z, 2010024ZZ, 2010037Z, 2040056Z, 202086Z, 2010006Z, 2010040Z bzw. 2010008ZZ aufbewahrt. Die Gewährleistung der Qualitätskontrolle für alle Materialien wurde gemäß dem Chinesischen Arzneibuch (China Pharmacopoeia Committee, 2015) validiert. Astragali Radix (30 g), Atractylodis Macrocephalae Rhizoma (10 g), Dioscoreae Rhizoma (30 g),Cistanches Herba(10 g), Amomi Fructus Rotundus (10 g), Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (15 g), Rhei Radix et Rhizoma (10 g) und Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle (6 g) wurden gewogen und kochend extrahiert Wasser (1,2 l) zweimal für 1 h. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand unter vermindertem Druck zu Pulver getrocknet und bei –80 Grad gelagert. Vor der Behandlung wurde das Pulver wieder in Milli-Q-Wasser gelöst und bei Raumtemperatur gevortext, um JPYS-Extrakt zu erhalten.

Vor der Behandlung von Tieren mit Extrakt wurde JPYS-Extrakt chemisch standardisiert. Für den JPYSF-Extrakt wurde ein HPLC-Fingerabdruck bei 260 nm entwickelt (Abb. 8): Ein individueller Referenzstandard wurde verwendet, um zu bestätigen, dass zahlreiche chemische Komponenten aus dem Extrakt durch HPLC-Analyse identifiziert werden sollten, wie z.Echinacosid, Acteosid, Calycosin 7-Ob-Glucosid, Salvianolsäure B, Formononetin und Rhein. Außerdem ist die Mindestanforderung für die Mengen vonEchinacosid, Salvianolsäure B und Rhein sollten nicht weniger als 1,2 mg/g, 5,7 mg/g und 0,2 mg/g des getrockneten Extrakts betragen. Die Ausbeute der Extraktion betrug weniger als 32,59 ± 1,1 Prozent (w/w, Mittelwert ± Standardabweichung, n=3). Der hier verwendete Extrakt erfüllte die oben genannten Anforderungen.

Cistancheentlasten kannNierenerkrankung

Versuchstiere.

Die Versuchs- und Fütterungsprotokolle entsprachen den nationalen Gesundheitsrichtlinien und wurden von der Guangzhou University of genehmigtChinesische MedizinInstitutionelles Komitee für Tierpflege und -nutzung. Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden vom Guangdong Medical Laboratory Animal Center (GDMLAC, China), Genehmigung Nr. SCXK (YUE) 2013-0002 mit einem Gewicht von 190–220 g gekauft. Die Tiere befanden sich unter kontrollierter Raumtemperatur (20 ± 1 Grad) und Feuchtigkeit mit 12/12- Stunden Licht-Dunkel-Wechsel und hatten Zugang zu Wasser und Futter nach Belieben. CKD wurde durch eine zweistufige 5/6-Nephrektomie induziert, wie zuvor beschrieben36. Kurz gesagt umfasste die erste Nierenoperation eine Elektrokauterisation der linken Niere mit Ausnahme eines Bereichs von 2- mm um den Hilus herum. Eine zweite Nierenoperation wurde eine Woche später durch doppelte Ligatur des Nierenhilus mit Seidennaht und chirurgische Exzision der rechten Niere durchgeführt. Eine Scheinoperation bestand aus einer Anästhesie, einem Fächerschnitt, der die Niere freilegt, und einem Verschluss der Bauchwand.

Verabreichung von Medikamenten.

16 Wochen nach der Operation waren die Scr-Werte der 5/6-Nephrektomie-Gruppe signifikant höher als die der Schein-Gruppe (S<0.05). ten,="" the="" 5/6="" nephrectomy="" group="" was="" randomly="" divided="" into="" two="" groups:="" ckd="" group="" (5/6="" nx,="" n="10):" ckd="" rats="" were="" treated="" with="" distilled="" water="" and="" jpys="" group="" (5/6="" nx+jpys="" decoction,="" n="10):" ckd="" rats="" that="" were="" orally="" administrated="" a="" dose="" of="" 10.89="" mg/kg="" of="" jpys="" decoction="" daily.="" the="" sham-operated="" rats="" were="" also="" treated="" with="" distilled="" water.="" te="" drugs="" were="" administered="" for="" 6="" weeks.="" all="" rats="" used="" in="" this="" study="" received="" humane="">

Biochemische Parameter.

Nach 6-wöchiger Behandlung wurden die Ratten mit Natriumpentobarbital getötet und sofort Blutproben entnommen. Die biochemischen Serumindizes Scr, BUN und ALB wurden unter Verwendung eines automatischen biochemischen Analysegeräts von Roche nachgewiesen.

Morphologische Untersuchungen (HE-, SDH-Färbung). Die transversal gelähmten Muskelschnitte (6 mm) wurden standardkonform mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Die Muskelfaser-Querschnittsfläche (CSA) wurde dann auf die Weise gemessen, wie wir zuvor berichtet haben37. Die Faserquerschnittsfläche wurde für ungefähr 100 benachbarte Muskelfasern in jedem Abschnitt für jede Maus unter Verwendung der Software Image J 1.32 j (NIH, Bethesda, MD, USA) gemessen.

Die Gefrierschnitte des TA-Muskels wurden mit Succinatdehydrogenase (SDH, Komplex II der Atmungskette) gefärbt, um die SDH-Aktivität zu messen und den Fasertyp in I (langsam oxidativ), IIa (schnell oxidativ glykolytisch) oder IIb (schnell) zu klassifizieren glykolytisch) in Übereinstimmung mit einem zuvor beschriebenen Protokoll41. Kurz gesagt ließ man die Schnitte zuerst Raumtemperatur erreichen und wurden mit PBS (pH 7,4) rehydriert. Abschnitte waren

dann in einer Lösung inkubiert, die Nitroblau-Tetrazolium (1,5 mM), Natriumsuccinat (130 mM), Phenazinmethosulfat (0,2 mM) und Natriumazid (0,1 mM) enthält ) für 6{{30}} min. Die Querschnitte wurden dann dreimal in PBS gewaschen, in 75 Prozent (30 s), 90 Prozent (30 s) und 100 Prozent (10 min) Ethanol dehydriert und mit einer Mischung aus 50 Prozent (v/v) Glycerin und 2,5 abgedeckt Prozent (w/v) Triethylendiamin in 0,01 M PBS. Muskelbilder wurden mit einem Mikroskop (Nikon Eclipse Ti-SR, Japan) aufgenommen und als Graustufenbilder auf einer computergestützten NIS-Elements-Bildgebungssoftware Version 4.10 (Eclipse Ti-SR, Nikon Corporation, Tokio, Japan) digitalisiert. . Ein Graustufenwert von null entsprach 100 Prozent Lichtdurchlässigkeit (Prozent T), und der von 255 entsprach 0 Prozent T. Der optische Dichtewert aller Muskelfasern wurde basierend auf den Graustufenbildern bestimmt (Scion Image, Scion, Frederick, MD) und in drei Gruppen eingeteilt, I (Prozent T: 100–80 Prozent), IIa (Prozent T: 60–40 Prozent) und IIb (Prozent T: 20–0 Prozent).

Ultrastrukturanalyse (Transmissionselektronenmikroskopie, TEM).

Die detaillierten TEM-Verfahren für Muskeln entsprachen unseren zuvor berichteten55. Kurz gesagt, Abschnitte des TA-Muskels mit einem Volumen von 1 mm 3 wurden in 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von einer Nachfixierung in 1 % Osminsäure für die Assays der Elektronenmikroskopie. Die Image J-Software wurde verwendet, um Bilder zu analysieren, die von EM (JEM-1400, JEOL Ltd., Tokio, Japan) unter 12-facher 000-Vergrößerung gesammelt wurden. Der Mitochondriengehalt wurde bestimmt, indem die Anzahl und die Größe (Mindestdurchmesser) jedes Mitochondriums pro Feld quantifiziert wurden. Insgesamt 20 Felder pro Bedingung wurden analysiert, indem die Vorteile der Image J-Software genutzt wurden56.

Proteinsynthese und Proteinabbau.

Die Proteinsynthese und der Proteinabbau wurden in vitro unter Verwendung des Einbaus von 14-C-Phenylalanin (Phe) und der Freisetzung von Tyrosin, wie zuvor beschrieben, gemessen57–59.

Messung von Proteasom-Aktivitäten.

Die Chymotrypsin- und die Trypsin-ähnliche Aktivität des 20 S-Proteasoms wurden in vitro im Gastrocnemius-Muskel gemessen, wie von uns zuvor beschrieben36.

Western-Blotting.

Schnellgefrorenes Quadrizeps-Muskelgewebe wurde in Lysepuffer homogenisiert, wie von uns zuvor berichtet36. Zytosolische Proteine ​​wurden auf einem 10-prozentigen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und dann auf eine PVDF-Membran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, US) übertragen. Die unspezifischen Bindungsstellen der Membran wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 5 % fettfreiem Milchpulver in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween (TBST) blockiert und dann über Nacht bei 4 Grad mit primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Membranen mit sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach dem Waschen wurden Proteinbanden nachgewiesen und unter Verwendung eines ChemiDoc TM MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, CA, US) analysiert. Die Ergebnisse wurden als integrierte optische Dichte relativ zu GAPDH ausgedrückt. p-AMPK (1:1000, Nr. 2535), p-FoxO3a (1:1000, Nr. 13129), SQSTM1/p62 (1:1000, Nr. 5114), Mitofusin-2 (1:1000, Nr. 9482) , FoxO3a (1:1000, Nr. 2497), DRP1 (1:1000, Nr. 8570), Cox IV (1:1000, Nr. 4844), BNIP3L/Nix (1:1000, Nr. 12396) Beclin-1( 1:1000, #3495T) und AMPK (1:1000, #5831) Antikörper stammten von Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, US). LC3 I/II (1:1000, ab58610), Parkin (1:1000, ab77924) und PINK1 (1:1000, ab23707) Antikörper stammten von Abcam (Cambridge, UK). ATP5B (1:1000, ARP48185_T100)-Antikörper stammte von Aviva Systems Biology (San Diego, CA, US). Der Antikörper MuRF1 (1:1000, GTX110475) stammte von Gene Tex (San Antonio, TX, US). Fis1 (1:100, sc-98900) und NRF-1 (1:100, sc-33771) Antikörper stammten von Santa Cruz Biotechnology (CA, US). OPA1 (1:1000, 612606) war von BD Biosciences (San Jose, CA, US). Atrogin-1 (1:1000, AP2041) war von ECM Biosciences (Versailles, KY, US). PGC-1 (1:2000, NBP1-04676) war von Novus Biological (Colorado, USA). GAPDH (1:1000, 60004-1-Ig) war von Proteintech (Chicago, IL, US).

Statistisch Analyse.

Die Daten wurden mit SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Normalverteilte Daten wurden durch einfache ANOVA analysiert, gefolgt vom Test der kleinsten signifikanten Differenz (LSD), während Daten ohne Normalverteilung unter Verwendung des Games-Howell-Tests analysiert wurden. Unterschiede wurden für P < 0,05="" als="" statistisch="" signifikant="">

Cistanchekann verbessernNierenfunktion

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