Jujube-Polysaccharide mildern Anämie bei Ratten mit chronischer Nierenerkrankung

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Shiying Huanget al

Abstrakt

Jujube-Polysaccharide (JP) sind eines der aktiven Glykane aus der Nahrung in der diätetischen Frucht von Ziziphus jujuba, das zur Behandlung von Blutmangel in Betracht gezogen wurde. In dieser Studie, achronischNiereErkrankung(CKD) Rattenmodell wurde verwendet, um die Wirkung von JP und seinen Mechanismus auf CKD-assoziierte Anämie zu bewerten. Bei CNE-Ratten verbesserte sich die JP-Behandlung signifikantNiereFunktion, NierepathologischVerletzungund hämatologische Parameter, einschließlich steigender roter Blutkörperchen, Hämoglobin, Hämatokrit und Blutplättchenzahl. Darüber hinaus zeigten LC-MS/MS-gezielte Metabolomics-Ergebnisse, dass JP die Freisetzung von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) bei CNE-Ratten förderte. Außerdem wechselte JP den Serum-Erythropoietin (EPO)-Spiegel, Nieren-EPO-mRNA undNiereEPO-Protein über HIF-Signalisierung. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass die Wirkung von JP auf CNE-assoziierte Anämie an der Regulation der SCFA-Freisetzung und Erythropoetin-Produktion beteiligt sein könnte, was die weitere Entwicklung von JP als Nahrungsergänzungsmittel bei der Behandlung von CNE-assoziierter Anämie unterstützt.

Schlüsselwörter: Jujube-PolysaccharideChronischNiere ErkrankungAnämie Erythropoietin Hypoxie-induzierbarer Faktor – Kurzkettige Fettsäuren

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1. Einleitung

ChronischNiere Erkrankung(CKD) ist definiert als ein klinisches Syndrom von Nierenstrukturanomalien oder funktionellen Beeinträchtigungen und wird weltweit zunehmend zu einer Belastung für die öffentliche Gesundheit (Webster, Nagler, Morton & Masson, 2017). Die renale Anämie gehört zu den häufigsten Komplikationen der CKD, die zu einem erhöhten Sterberisiko beitragen (Locatelli et al., 2019). Die Insuffizienz der Erythropoetin (EPO)-Produktion ist ein anerkannter wichtiger treibender Faktor der Anämie bei CKD (Pappa, Dounousi, Duni & Katopodis, 2015). EPO wird in der Leber produziert undNiere, das für die Erythrozytenproduktion unerlässlich ist (Lappin & Lee, 2019). Unter hypoxischen Bedingungen kann der Hypoxie-induzierbare Faktor (HIF) die Expression von EPO aktivieren (Schodel & Ratcliffe, 2019). Das Targeting von HIF zur Induktion der EPO-Produktion wurde daher als neue therapeutische Strategie zur Behandlung von CKD-assoziierter Anämie angesehen.

Jujube ist die Frucht der Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), auch bekannt als chinesische Dattel. Jujube hat eine jahrtausendealte traditionelle Verwendung als Heilkraut und Nahrungsergänzungsmittel. Jujube wird als Nahrungsergänzungsmittel für Menschen mit hämatogener oder chronischer Unterernährung verwendet. Jujube-Polysaccharide (JP), eine wasserlösliche Komponente, die mit unterschiedlichen Verhältnissen von Monosaccharid und Uronsäure zusammengesetzt ist (Ji, Hou, Yan, Shi, & Liu, 2020), ist einer der Wirkstoffe in Jujube (Ji et al., 2017 ), das bekanntermaßen eine hepatoprotektive Wirkung und immunmodulatorische Aktivität aufweist und die intestinale Barrierefunktion verbessert (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Tatsächlich wird allgemein angenommen, dass JP auch potenzielle Auswirkungen auf Anämie hat. Der molekulare Mechanismus von JP bei der Behandlung von Anämie ist jedoch noch weniger bekannt.

In den letzten Jahren wurde die Metabolomik weit verbreitet, um potenzielle Faktoren zu verstehen, die zum Fortschreiten der Krankheit beitragen. Gezielte Metabolomik wird häufig zur Identifizierung molekularer Marker komplexer menschlicher Erkrankungen wie CKD eingesetzt. Indoxylsulfat (IS) und p-Cresylsulfat (PCS) wurden als Biomarker für das Fortschreiten einer chronischen Nierenerkrankung nachgewiesen (Meijers & Evenepoel, 2011), und ein erhöhter Trimethylamin-N-oxid (TMAO)-Gehalt könnte direkt zu renaler tubulointerstitieller Fibrose und Dysfunktion führen (Tang et al., 2015). Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), die von Darmmikroben abhängigen Metaboliten, sind die Energiesubstrate mit der Fähigkeit, verschiedene physiologische Prozesse zu beeinflussen (LeBlanc et al., 2017), und es wurde berichtet, dass die Reduktion von SCFAs zum Fortschreiten der CKD beiträgt (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & Beckhed, 2016, Wang et al., 2019). Darüber hinaus konnten SCFAs die Nierenstruktur durch die Hemmung von oxidativem Stress vor Schäden schützen (Li, Ma, & Fu, 2017). Gleichzeitig wurde festgestellt, dass SCFAs eine positive Wirkung auf die Eisenabsorption zeigen und die embryonale/fötale Globin-Genexpression hochregulieren, was die Erythropoese induziert und Anämie korrigiert (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Der Mechanismus von SCFAs bei renaler Anämie muss jedoch noch aufgeklärt werden.

In dieser Studie stellen wir die Hypothese auf, dass JP die Freisetzung von SCFAs regulieren und die HIF-vermittelte EPO-Produktion stimulieren könnte, wodurch die renale Anämie korrigiert wird. Hier werden wir die Wirkung von JP bei der Verbesserung der renalen Anämie bei 5/6 nephrektomierten CNE-induzierten Ratten untersuchen, einschließlich der Nierenfunktionen und hämatologischen Parameter. Ein gezielter Metabolomik-Ansatz mit LC-MS/MS wird entwickelt, um acht SCFAs zu bestimmen, darunter Essigsäure, Propansäure, Isobuttersäure, Buttersäure, 2-Methylbuttersäure, Isovaleriansäure, Valeriansäure und Hexansäure in Fäkalien und Nierenproben, und die Konzentrationen von zielgerichteten SCFAs werden bei gesunden und CNE-Ratten bewertet. Darüber hinaus wird auch die Beteiligung der HIF-Signalgebung bei mit JP behandelten Ratten offenbart.

Abb. 1. Typische GC-MS-Chromatographie von JP. (A) Monosaccharid-Strukturformeln nach Aldononitrilacetat-Derivatisierung; (B) Die repräsentativen GC-MS-Profile der gemischten Ionenchromatographie (MIC) der Standard-Monosaccharidmischung und der hydrolysierten JP-Monosaccharide. Die Peaks in Chromatographieprofilen entsprachen den in (A) gezeigten chemischen Markern: 1. Rhamnose, 2. Arabinose, 3. Fucose, 4. Xylose, 5. Mannose, 6. Glucose, 7. Galactose, 8. Inosit (ISTD ).

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung von Jujube-Polysaccharid

Die Früchte von Z. jujuba wurden von Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. bezogen. Die Materialien wurden von Dr. Jianping Chen gemäß dem Arzneibuch der Volksrepublik China, Ausgabe 2015, authentifiziert. Die Belegexemplare wurden im Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital unter der Nummer 18100601 aufbewahrt.

Das rohe JP wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen aus der Jujube extrahiert (Ji et al., 2020). Kurz gesagt, Jujuben wurden mit 10 Vol. Wasser (v/w) in einem Wasserbad bei 80 °C für 3 h inkubiert und dreimal extrahiert. Nach der Filtration vereinige die Filtrate und kondensiere diese Kombination in einem Rotationsverdampfer unter kontrolliertem Vakuum. Die konzentrierte Lösung wurde durch Zugabe des vierfachen Ethanols (v/v) bei 4°C für 12 h weiter ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und unter reduziertem Druck zur Trockne getrocknet, um das rohe JP zu erhalten. Die Reinheit von JP wurde unter Verwendung von Kalorimetrie zu 80 Prozent bestimmt.

2.2. Charakterisierung der Monosaccharidzusammensetzung von Jujube-Polysaccharid

Ein Shimadzu GC-MS-System (Shimadzu GC-MS TQ8040 mit Schnittstelle zu Shimadzu GC 2010 plus), ausgestattet mit EI-Quelle, SH-Rxi-5Sil MS-Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 µm Filmdicke, Shimadzu) wurde verwendet, um die Derivatisierung hydrolysierter Monosaccharide mit einem Teilungsverhältnis von 10:1 zu bestimmen. Die Temperatur der Injektion, der Ionenquelle und der Schnittstelle betrug 250 °C, 200 °C und 250 °C. Die Anfangstemperatur der Säule wurde 1 min bei 120 °C gehalten, dann mit 15 °C/min auf 160 °C erhöht und 4 min gehalten, 2 °C/min auf 165 °C und 2 min gehalten, 20 °C /

min auf 195 ◦C, 5 ◦C/min auf 250 ◦C und 3 min gehalten. Die Strömungsgeschwindigkeit des Helium-Trägergases wurde bei 46 cm/s gehalten und 2 &mgr;l jeder Probe wurden in das Instrument injiziert. Die Analyten wurden im Selected-Ion-Monitoring-Modus (SIM) quantifiziert, Zielion: Rhamnose (m/z 129,00), Arabinose (m/z 115,00), Fucose (m/ z 103.00), Xylose (m/z 115.00), Mannose (m/z 115.00), Glucose (m/z 115.00 ), Galactose (m/z 115,00), Inositol (m/z 126,00). Die Monosaccharidstandards wurden wie folgt aufgelistet: L ( plus )-Arabinose (1506–200202), Fucose (112014–201902), D-Xylose (111508–201605), D-Glucose (110833–201908), Rhamnose (111683–201502). ), Galactose (100226–201807), D-Mannose (140651–201805) wurden von den National Institutes for Food and Drug Control bezogen. Inositol wurde von Sigma erhalten (I7508-50 g).

Das extrahierte JP (10 mg) wurde mit 10 ml 2 mol/l Trifluoressigsäure (TFA) bei 105 °C für 3 h zu Monosacchariden hydrolysiert, und die hydrolysierten Monosaccharide aus JP wurden konzentriert und unter reduziertem Druck bei 60 °C gewaschen TFA entfernen, und die Rückstände wurden mit 2 ml Wasser rekonstituiert. 250 &mgr;l einer 20 mg/ml Hydroxylaminhydrochlorid/Pyridin-Lösung wurden zu 100 &mgr;l hydrolysierter Monosaccharidlösung hinzugefügt und 45 min in einem 90°C warmen Wasserbad gehalten. Dann wurden 250 µl Essigsäureanhydrid zugegeben und weitere 45 min in einem 90 °C warmen Wasserbad gehalten. Am Ende der Reaktion wurde das Gemisch fünfmal mit 1 ml Cyclohexan extrahiert und die Cyclohexanschicht wurde auf 1 ml eingeengt. Injektion von 1 µl Überstand in GC-MS zur Analyse (Li & Shi, 2013).

2.3. Tiere

Alle Experimente wurden mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care Use Committee der Guangzhou University of Chinese Medicine genehmigt wurden. Sprague-Dawley-Ratten, männlich und weiblich, mit einem Gewicht von 180–220 g, wurden vom Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, China, Genehmigung Nr. SCXK (Yue) 2008–0002) bezogen und in einem spezifischen pathogenfreien (SPF ) Tierhaltung unter 12 h Hell-Dunkel-Wechsel, mit Futter und Wasser frei.

Bei induziertem Nierenversagen wurde eine 5/6-Nephrektomie gemäß der vorherigen Beschreibung durchgeführt (Chen et al., 2019). Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Anästhesie mit 10 Prozent Chloralhydrat durchgeführt. Die Scheinoperationsgruppe (n=6) unternahm die gleichen Schritte, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Niere freizulegen. Die 5/6-Nephrektomie-Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt. Ratten ohne Behandlung (CKD-Gruppe, n=6) und Ratten, die JP (CKD plus JP-Gruppe, n=6) ​​oral per Schlundsonde in einer Dosis von 1,2 g/kg/Tag erhalten. Nach 90 Tagen Betrieb begannen 90 Tage Verabreichung. Der 90. Tag war der letzte Verabreichungszeitpunkt von JP an Ratten, und nach 24 h wurden die Tiere durch Entnahme von Blut aus der abdominalen Aorta getötet, und die Urin-, Kot-, Serum- und Nierenproben wurden von jeder Ratte gesammelt. Alle Proben wurden vor der weiteren Analyse bei −80 °C gelagert.

2.4. Biochemische Analyse

Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Serum-Kreatinin (Scr) mit dem Kreatininserum-Nachweiskit und dem BUN-Nachweiskit (WAKO, Ginza, Japan) gemessen, und das Urinprotein wurde mit dem Elisa-Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanking, China). Rote Blutkörperchen (RBC), Hämoglobin (Hb), Hämatokrit (HCT) und Thrombozytenzahl (PLT) wurden von Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

2.5. Histologische Untersuchung

Periodsäure-Schiff (PAS) und Masson-Färbung wurden verwendet, um die pathologische Nierenschädigung zu beurteilen, darunter PAS-Färbung, um die renale tubuläre Atrophie und den glomerulären Bereich sichtbar zu machen, und Masson-Färbung für die renale interstitielle Fibrose (Xie et al. , 2020). Die quantitative Analysemethode wurde gemäß früheren Studien durchgeführt (Chen et al., 2019). Kurz gesagt wurde die Bewertung der tubulären Atrophie bei der PAS-Färbung wie folgt definiert: 1. seltener einzelner atrophischer Tubulus; 2. mehrere Cluster von atrophischen Tubuli; 3. massive Atrophie. Der glomeruläre Bereich wurde mit der Software ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Deutschland) gemessen. Der fibrotische Bereich in der Masson-Färbung wurde unter Verwendung der Image J-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) gemessen. Mindestens zehn mikroskopische Felder (200 ×) von 6 Ratten pro Gruppe wurden zufällig eingefangen, um den Atrophie-Score, die glomeruläre Fläche und die fibrotische Fläche zu messen, mit mindestens einem Glomerulus in jedem mikroskopischen Feld.

2.6. Immunhistochemische Analyse

Der renale Paraffinschnitt (4 μm) von jeder Probe wurde schrittweise mit Xylol zweimal dehydriert, und Gradienten-Ethanol (100–95–90–80–70 Prozent), Antigen wurde mit Zitronensäurepuffer (pH 6,0 ) für 30 min, blockiert durch 3-prozentiges Wasserstoffperoxid für 10 min und Ziegenserum für 30 min bei Raumtemperatur. Die Gewebeschnitte wurden separat mit Primärantikörper HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, Lot: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1:500, Lot: BJ2044786) bei 4°C für 10 h und HRP-konjugierter sekundärer Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (Abcam, ab6712, 1:1000) bei Raumtemperatur für 30 min, DAB (Diaminobezid in) wurde dazu verwendet Um die HRP-Aktivität nachzuweisen, wurde der Zellkern mit Hämatoxylin gegengefärbt. das. Die Immunhistochemie wurde unter mikroskopischen Feldern 400× von jeder Gruppe analysiert und der Skalenbalken=20 μm durch Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Deutschland fixiert. Der Kern war durch Hämatoxylin blau gefärbt und die Immunpositivität von DAB war braun, die tiefere DAB-Färbung bedeutet stärkeres immunhistochemisches Positiv.

2.7. EPO-Erkennung

Der Serum-EPO-Gehalt wurde durch das ELISA-Kit (Abcam, ab274398) nachgewiesen, und das Experiment bezog sich auf das ELISA-Kit-Protokoll. Wie zusammengefasst, EPO-Antikörpercocktail in die Probe gegeben und 1 h inkubiert. nach dem Inkubieren wurde jede Vertiefung dreimal mit Waschpuffer gewaschen, TMB zu der zweiten gegeben, für 15 min inkubiert und die Reaktion gestoppt.

Nieren-Gesamt-mRNA wurde aus gefrorenem Nierengewebe unter Verwendung von Trizol extrahiert und die mRNA in cDNA translatiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Das grüne SYBR-Signal wurde mit dem ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) erfasst und gemessen. Die Primer waren: 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ und 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ für Ratten EPO (214 bps, NM_017001. 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ und 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ für GAPDH (181 bps, NM_017008.3), die Housekeeping Gens als interne Kontrolle in allen Fällen. Und die relative Quantifizierung der Genexpression wurde durch das normalisierte Genexpressionsverfahren (2 – ΔΔCT) berechnet.

Eine gleiche Menge an Protein aus Nierenrindenlysaten wurde geladen und durch 10 %iges SDS-Gel getrennt und dann auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Nachdem sie 2 h lang bei Raumtemperatur in 5-prozentiger Magermilch blockiert worden waren, wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper inkubiert. Dann wurden die Membranen mit HRP (Meerrettichperoxidase)-konjugiertem Anti-Maus-IgG (Life Technologies) bei Raumtemperatur für 45 min inkubiert. Die HRP-Aktivität wurde unter Verwendung von Clarity Western ECL-Substrat visualisiert und durch das Tanon-Bildgebungssystem analysiert. Der folgende primäre Antikörper wurde in dieser Studie verwendet: monoklonales EPO (B- 4) aus Mäusen (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, Verdünnung 1/500), monoklonales -Actin aus Mäusen (Cell Signaling Technology, 8H10D10, 1/1000 Verdünnung).

2.8. Analyse kurzkettiger Fettsäuren

Ein Shimadzu UHPLC-LCMS/MS-System (Shimadzu LC-MS 8045 mit Schnittstelle zu Shimadzu LC-20AD), ausgestattet mit einer ESI-Quelle.

Chromatographische Trennungen wurden auf einer Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) Säule unter Verwendung von {{10}},1 Prozent Ameisensäure in Wasser ( Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min durch Gradientenelution: 0–9 min, 25–30 Prozent B; 9–11 min, 30–40 Prozent B; 11–20 min, 40–50 % B; 20–20,1 min, 50–100 Prozent B; 20,1–23 min, 100 Prozent B; 23,1 min – 25 Prozent B zur Reäquilibrierung. Die Säulentemperatur betrug 35 ◦C und der Autosampler wurde während der Analyse auf 4 ◦C gehalten, 1 μl jeder Probe wurde in das Instrument injiziert. Der Analytnachweis wurde im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus (MRM) durchgeführt, der im Positivionenmodus betrieben wurde. Die MS-Parameter: Vernebelungsgasfluss: 3,0 l/min; Trocknungsgasfluss: 10 l/min; Heizgasfluss: 10 l/min; DL-Temperatur: 250 ◦C; Schnittstellentemperatur: 300 ◦C; Heizblock: 400 ◦C. MRM-Übergänge und Kollisionsenergie (CE) wurden durch direkte Infusion jedes Standardderivats ausgewählt und optimiert. Die Analytmengen MRM-Übergänge wurden in Tabelle S1 zusammengefasst.

Fäkale SCFAs: 100 μl 50-prozentiges Acetonitril zu 3 mg des lyophilisierten Stuhls gegeben und 2 min gevortext. Dann wurde die Mischung bei 12000 U/min für 10 min bei 4 ◦C zentrifugiert und der Überstand pipettiert.

Nieren-SCFAs: 100 mg Nierengewebe abgewogen und auf Eis mit 4-facher normaler Kochsalzlösung (100 mg/400 μl) gevortext, um Gewebehomogenat herzustellen. 3 mal kaltes Methanol in 300 μL Gewebehomogenat gegeben und 2 min gevortext, dann wurde die Mischung bei 12000 U/min für 10 min bei 4 ◦C zentrifugiert und der Überstand pipettiert. Der Überstand wurde mit N2 getrocknet und mit 100 μl 50-prozentigem Acetonitril rekonstituiert.

Zugesetzt 500 mmol/l N-(3-dimethylaminopropyl)-Ń-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC, Aladdin, Shanghai, China), 50 mmol/l 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] Pyridin-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghai, China) und 50 mg/mL 12C-Dansylhydrazin ( 12C-DnsHz, J&K, Beijing, China) in 20 μL der Probenextraktion ein Sequenz mit gleichem Volumen. Das EDC und HOAT wurden mit frischen 500 mmol/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES, Macklin, Shanghai, China) hergestellt. Nach 90-minütiger Inkubation bei 20 °C wurden 20 μl 50 mmol/l CuCl2 (Macklin, Shanghai, China) zu der Mischung gegeben, um die Derivatisierungsreaktion bei 40 °C für 30 min zu löschen (Zhao & Li, 2018). Am Ende der Derivatisierung wurde die Mischung zehnmal mit 25 % Acetonitril verdünnt. Vor der Analyse wurden 100 μl Überstand mit 100 μl interner Standardlösung gemischt. Die 13C-DnsHz-Markierung wurde gemäß derselben Derivatisierungsreaktion als interner Standard (ISTD1-8) verwendet. Der SCFA-Standard: Essigsäure (AA, A116173), Propansäure (PA, P110446), Isobuttersäure (IBA, I103524), Buttersäure (BA, B110438), 2-Methylbuttersäure (2- BA, M107377), Isovaleriansäure (IVA, I108280), Valeriansäure (VA, V108271), Hexansäure (HA, H103632) wurden von Aladdin (Shanghai, China) geliefert.

2.9. statistische Analyse

Die Daten jeder Gruppe wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde durch einfache ANOVA und Post-hoc-Analyse mit dem Student-Newman-Keuls (SNK)-Test oder dem Dunnett-T3-Test durchgeführt. Der Wert von P < 0.05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="" betrachtet.="" alle="" daten="" wurden="" mit="" spss-statistiksoftware="" (version="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="" usa)="">

3. Ergebnisse

3.1. JP verbesserte die Nierenfunktion von CNI-Ratten

Das Monosaccharid von JP wurde vor der Behandlung an Tieren charakterisiert. Das in der vorliegenden Studie verwendete JP bestand aus sieben Monosacchariden, nämlich Rhamnose (1,62 Prozent), Arabinose (15,79 Prozent), Fucose (0,21 Prozent), Xylose (4,56 Prozent), Mannose (3. 00 Prozent), Glukose (73,44 Prozent) und Galaktose (4,99 Prozent) (Abb. 1). Unsere Analysemethode wurde durch Linearität, Präzision, Wiederholbarkeit, Stabilität und Wiederfindung validiert (Tabellen S2–S3). Es wurde bestätigt, dass die Analyten bei Raumtemperatur für 24 h stabil waren. Die Ausbeute an JP sollte höher als 8,63 % sein und die Reinheit sollte nicht weniger als 77,16 % betragen . Die vorgenannte chemische Analyse von JP diente als Qualitätskontrollansatz, um die Reproduzierbarkeit der nachstehenden Tierversuche sicherzustellen.

Scr, BUN und Urinprotein waren am repräsentativsten für Nierenfunktionen. Scr, BUN und Proteinspiegel im Urin waren bei CNE-Ratten signifikant höher als bei der Scheingruppe (P < {{0}},01).="" nach="" 90-tägiger="" behandlung="" mit="" jp="" waren="" die="" werte="" von="" scr,="" bun="" und="" protein="" im="" urin="" im="" vergleich="" zur="" ckd-gruppe="" verringert="" (p="">< 0,01)="" (abb.="">

3.2. JP verbesserte die pathologische Nierenschädigung bei CNI-Ratten

Das Gewicht der ganzen rechten Niere für die Schein-Gruppe und die verbleibende rechte Niere für die CNI- und CNI-plus-JP-Gruppe wurden für die Beurteilung der Nierenmorphologie anhand des Nierengewichts (KW) und des Nierengewichts/Körpergewichts (KW/KG) verwendet. Am Ende der Experimente waren die KW und KW/BW der CKD-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe erhöht (alle P < {{0}}.05).="" in="" dem="" 5/6-nephrektomie-induzierten="" ckd-modell="" verursachte="" die="" verringerung="" der="" renalen="" proteinaseaktivität="" ein="" kompensatorisches="" nierenwachstum,="" unternehmen="" mit="" renaler="" hypertrophie="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" und="" unsere="" bestätigten="" diese="" aussage.="" nach="" jp-behandlung="" war="" kw="" signifikant="" erniedrigt="" (p="">< 0.05)="" und="" schloss="" zu="" einer="" scheingruppe="" (p="" ˃="" 0,05);="" während="" das="" kw/bw="" leicht="" erniedrigt="" war="" (p="" ˃="" 0,05).="" (abb.="">

Abb. 2. JP schützte die Nierenfunktion bei CNE-Ratten. Der Spiegel von Scr (A), BUN (B) und Protein im Urin (C) in verschiedenen Gruppen. (D) Nierengewicht, (E) KW/KG. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung, n=6 pro Gruppe (**P < 0.01="" verglichen="" mit="" der="" scheingruppe;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" verglichen="" mit="" der="">

In der CNI-Gruppe zeigte die tubuläre Niere eine massive Atrophie im Vergleich zur Scheingruppe (P < {{0}}.01),="" und="" der="" glomerulusbereich="" und="" die="" interstitielle="" nierenfibrose="" waren="" fast="" doppelt="" so="" groß="" wie="" die="" die="" der="" scheingruppe="" in="" der="" quantitativen="" analyse="" (p="">< 0.01).="" nach="" der="" jp-behandlung="" war="" die="" punktzahl="" der="" tubulären="" atrophie="" um="" fast="" das="" doppelte="" zurückgegangen="" (p="">< 0,01),="" der="" glomerulusbereich="" wurde="" fast="" wieder="" auf="" eine="" scheingruppe="" zurückgeführt="" (p="">< 0,01)="" und="" die="" interstitielle="" nierenfibrose="" wurde="" um="" ein="" drittel="" verringert="" (p="">< 0,01).="" im="" vergleich="" zur="" ckd-gruppe="" (abb.="">

Abb. 3. JP schützte die Nierenstruktur bei CNE-Ratten. (A) PAS-Färbung. (B) Masson-Färbung. (C) Punktzahl der tubulären Atrophie. (D) Glomerulärer Bereich (E) Fibrotischer Bereich. Alle Bilder werden mit identischer Vergrößerung dargestellt, 200×, Maßstabsleiste=100 μm. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung, n=6 pro Gruppe (**P < 0,01="" im="" vergleich="" zur="" scheingruppe;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" im="" vergleich="" zur="" ckd-gruppe)="" dargestellt="">

3.3. JP modulierte die hämatologischen Parameter bei CNE-Ratten

Für hämatologische Parameter wurden biochemische Analysen, RBC, Hb, HCT und PLT gemessen. Bei CNE-Ratten war der RBC-Spiegel von 9,06 auf 7,20 × 1012/L, Hb von 15,28 auf 13,22 g/dL, HCT von 47,1 auf 40,4 Prozent und PLT erhöht von 1012 auf 1526 × 109 /L im Vergleich zu einer Scheingruppe (P < 0,01),="" was="" darauf="" hinweist,="" dass="" bei="" cni-ratten="" anzeichen="" einer="" anämie="" beobachtet="" wurden.="" die="" verringerten="" werte="" von="" rbc,="" hb,="" hct="" und="" plt="" bei="" mit="" jps="" behandelten="" cni-ratten="" wurden="" wiederhergestellt="" (p="">< 0,01)="" (abb.="">

Abb. 4. JP rehabilitierte die hämatologischen Parameter bei CNE-Ratten. Das Niveau von PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung, n=6 pro Gruppe (**P < 0.01="" verglichen="" mit="" der="" scheingruppe;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" verglichen="" mit="" der="">

3.4. JP stimulierte die EPO-Expression

Im Vergleich zur Scheingruppe waren der Serum-EPO-Spiegel und die EPO-mRNA-Menge in der Niere bei Ratten mit CNE-Anämie signifikant verringert (P < 0.01).="" die="" western-blot-analyse="" ergab,="" dass="" der="" epo-proteinspiegel="" in="" der="" ckd-gruppe="" ohne="" signifikanten="" unterschied="" leicht="" abnahm.="" nach="" der="" jp-behandlung="" waren="" der="" serum-epo-spiegel,="" die="" nieren-epo-mrna="" und="" das="" protein="" im="" vergleich="" zur="" ckd-gruppe="" signifikant="" erhöht="" (p="">< 0,01="" oder="" p="">< 0,05)="" (abb.="">

In der Nierenrinde wurde HIF-1 hauptsächlich von renalen tubulären Epithelzellen produziert, HIF-2 wurde hauptsächlich in Endothelzellen und interstitiellen Nierenfibroblasten exprimiert (Schodel & Ratcliffe, 2019). Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass, wie bei HIF-1, bei CNI-Ratten die Tubuli stärker gefärbt waren als bei der Scheingruppe. Nach der JP-Behandlung wies der Nierentubulus im Vergleich zur CKD-Gruppe eine stärkere und größere Flächenfärbung auf, wie der rote Pfeil in Fig. 5E anzeigt. HIF-2 zeigte in der Sham-Gruppe eine relativ schwache positive Immunhistochemie am Niereninterstitial. In der CKD-Gruppe zeigte HIF-2 eine positive Immunhistochemie. Nach der JP-Behandlung zeigte HIF-2 eine stärkere Immunhistochemie im Vergleich zur CKD-Gruppe (Abb. 5F).

Abb. 5. JP stimulierte die EPO-Expression. (A) Serum-EPO-Gehalt. (B)NiereEPO-relative mRNA. GAPDH galt als Haushaltsgen. (C) Die repräsentativen Western-Blot-Bilder der EPO-Proteinexpression. (D) Densitometrische Analyse von EPO. (E) Immunhistochemie von HIF{{0}}. (F) Immunhistochemie von HIF- 2 normalisiert auf -Actin-Gehalt. Die immunhistochemischen Bilder werden mit identischer Vergrößerung, 400×, Skalenbalken=20 μm dargestellt. Der Kern war durch Hämatoxylin blau gefärbt und die Immunpositivität von DAB war braun, die tiefere DAB-Färbung bedeutet stärkeres immunhistochemisches Positiv. Der rote Pfeil zeigt auf Immunhistochemie positiv. Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD, n=6 pro Gruppe dargestellt (*P < 0,05="" im="" vergleich="" zur="" scheingruppe;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" im="" vergleich="" zur="">

3.5. JP induzierte die Freisetzung von SCFAs

Ein LC-MS-basierter zielgerichteter Metabolomik-Ansatz wurde entwickelt, um die Freisetzung von acht SCFAs in Stuhlproben zu quantifizieren. Die etablierte Methode wurde validiert, indem Linearität, Empfindlichkeit, Präzision, Matrixeffekt, Genauigkeit und Stabilität bewertet wurden. Qualitätskontrollproben mit niedriger, mittlerer und hoher Konzentration (LQC, QMC, HQC) für die Sensitivitäts-, Präzisions-, Richtigkeits- und Stabilitätsvalidierung wurden gemäß den niedrigsten, mittleren und höchsten Konzentrationspunkten der Matrix-Standardkurve und den Ergebnissen ausgewählt wurden in den Tabellen S4–S6 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass die Analyten bei 4 ◦C für 48 h stabil sind. Das LC-MS/MS-Chromatogramm von SCFAs ist in Abb. 6 dargestellt.

Abb. 6. UHPLC-MS/MS-Chromatographie von SCFAs. (A) Die obere war die chemische Gleichung der SCFAs-Derivatisierung; die untere war die SCFAs-Strukturformel nach Dansylhydrazin-Derivatisierung; (B) Das UHPLC/MRM-MS-Chromatogramm der Mischstandards und der Stuhlprobe, die chromatographischen Peaks in (B) entsprachen dem in (A) gezeigten chemischen Marker:1. 12C-Essigsäure; 2. 13C-Essigsäure (ISTD1); 3. 12C-Propansäure; 4. 13C-Propansäure (ISTD2); 5. 12C-Isobuttersäure; 6. 12C-Buttersäure; 7. 13C-Isobuttersäure (ISTD3); 8. 13C-Buttersäure (ISTD4); 9. 12C-2-Methylbuttersäure; 10. 12C-Isovaleriansäure; 11. 12C Valeriansäure; 12. 13C-2-Methylbuttersäure (ISTD5); 13. 13C-Isovaleriansäure (ISTD6); 14. 13C-Valeriansäure (ISTD7); 15. 12C-Hexansäure; 16. 13C-Hexansäure (ISTD8).

In Bezug auf die Stuhlprobe waren in der CNI-Gruppe die AA- und PA-Spiegel im Vergleich zu einer Scheingruppe fast 4-mal und 5-mal deutlich verringert (P < 0.01);="" während="" nach="" der="" jp-behandlung="" die="" mengen="" an="" aa="" und="" pa="" auf="" 4/5="" der="" scheingruppe="" wiederhergestellt="" wurden="" (p="">< {{10}}.01).="" in="" ähnlicher="" weise="" waren="" die="" ba-="" und="" va-spiegel="" in="" der="" ckd-gruppe="" im="" vergleich="" zu="" einer="" scheingruppe="" fast="" 30-mal="" und="" 4-mal="" stark="" verringert="" (p="">< 0.01).="" die="" jp-behandlung="" zeigte="" einen="" steigenden="" trend,="" aber="" keine="" signifikante="" verbesserung.="" der="" inhalt="" von="" iba,="" iva="" und="" 2-ba="" zeigte="" keine="" nennenswerte="" veränderung="" zwischen="" der="" cne-="" und="" der="" scheingruppe.="" nach="" der="" jp-behandlung="" waren="" die="" iba-,="" iva-="" und="" 2-ba-werte="" erhöht="" (p="">< 0,01).="" ha="" zeigte="" jedoch="" keine="" offensichtliche="" veränderung="" zwischen="" den="" drei="" gruppen="" (fig.="" 7a).="" darüber="" hinaus="" waren,="" was="" das="" nierengewebe="" betrifft,="" in="" der="" ckd-gruppe="" die="" mengen="" von="" acht="" scfas="" alle="" signifikant="" verringert="" (p="">< 0,01),="" während="" nach="" der="" jp-behandlung="" die="" scfa-spiegel="" mit="" ausnahme="" von="" ba="" und="" ha="" erhöht="" waren="" (p="">< 0,01="" oder="" p="">< 0,5).="" ba="" war="" leicht="" erhöht,="" ohne="" signifikant,="" und="" ha="" zeigte="" keine="" veränderung="" nach="" der="" jp-behandlung="" (fig.="">

Abb. 7. Gehalt an SCFAs in verschiedenen Gruppen. (A) Fäkale SCFAs. (B) Nieren-SCFAs. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung, n=6 pro Gruppe (**P < 0.01="" verglichen="" mit="" der="" scheingruppe;="" ##p="">< 0)="" dargestellt.="" 01,="" #p="">< 0,05="" verglichen="" mit="" der="">

4. Diskussion

Im vorliegenden 5/6-Nephrektomie-CKD-Rattenmodell ist dieNiereFunktionIndikatoren (Scr, BUN und Urinprotein) waren signifikant erhöht, die verbleibende Nierenhypertrophie und die pathologische Nierenschädigung traten auf, begleitet von veränderten hämatologischen Parametern. Diese Daten stimmten mit früheren Studien überein (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Die obigen Indikatoren zeigten, dass Ratten mit CNE-Anämie, die durch die 5/6-Nephrektomie induziert wurden, erfolgreich etabliert wurden und auf die vorteilhafte Wirkung von JP bei der Behandlung von Ratten mit CNE-Anämie verifiziert werden konnten. Mit demNiereFunktionBei einer weiteren Verschlechterung wurde Anämie als bekannte opportunistische CKD-Komplikation erkannt, die sich negativ auf die Lebensqualität der Patienten auswirkte (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Das Verständnis der Risikofaktoren im Zusammenhang mit dem Fortschreiten der renalen Anämie hilft bei der Entwicklung therapeutischer Ansätze. Heutzutage hat der Zusammenhang zwischen Krankheiten und dem Stoffwechsel der Darmmikrobiota zunehmend Aufmerksamkeit erregt, während die Beziehung zwischen SCFAs und renaler Anämie noch weniger bekannt ist. SCFAs, die hauptsächlich von Clostridium, Coprococcus und Bacteroides metabolisiert werden (Koh et al., 2016), zielen auf spezifische membrangebundene Rezeptoren ab, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Darmumgebung und der Gesundheit des ganzen Körpers spielen. Es wurde bereits nachgewiesen, dass SCFAs eine untrennbare Beziehung zu CNE haben, und die Konzentrationen von Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure waren bei CNE reduziert (Wang et al., 2019). Bei Adenin-induzierten CNE-Ratten waren die Häufigkeit und Vielfalt der Darmmikrobiota signifikant verändert, Unternehmen reduzierten den Gehalt an Propansäure, Buttersäure und Valeriansäure (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Basierend auf unserer vorherigen Studie zeigte die 16S-rDNA-Sequenzierung, dass eine Dysbiose der Darmmikrobiota bei 5/6 nephrektomierten CNI-Ratten im Vergleich zur Scheingruppe auftrat. Einige SCFAs, die Gattungen produzieren, insbesondere Buttersäure aus Clostridium, Coprococcus, zeigten Unterschiede bei CNI-Ratten (Zheng et al., 2020). In Übereinstimmung damit zeigten unsere Ergebnisse, dass die Mengen an Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und Valeriansäure bei CNE-Ratten um etwa 60 Prozent, 80 Prozent, 85 Prozent und 60 Prozent verringert waren, was darauf hinweist, dass die Verringerung der SCFAs entsprechend war mit dem Darmmilieu Ungleichgewicht. Bemerkenswert ist, dass eine CKD-induzierte Darmmilieustörung den abnormalen Stoffwechsel der Darmmikrobiota auslöste (Feng et al., 2019). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass bei Ratten mit CNE-Anämie acht Arten von SCFA-Spiegeln verringert waren. Beispielsweise kann die Anomalie von metabolischen Endprodukten, dh SCFAs, aus dem Fortschreiten einer chronischen Nierenerkrankung resultieren.

Polysaccharide, einer der Wirkstoffe, wurden in verschiedenen Kräutern wie Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix und Jujubae Fructus gefunden. Polysaccharide können von Darmmikrobiota fermentiert und abgebaut werden. Infolgedessen werden Polysaccharide als Substrat für die Darmmikrobiota zur Metabolisierung in SCFAs präsentiert oder es wird angenommen, dass sie eine präbiotische Wirkung besitzen, um die Zusammensetzung der Darmmikrobiota zu verbessern und die Produktion von SCFAs zu erleichtern (Cai et al., 2019). In dieser Studie zeigten unsere Ergebnisse, dass Polysaccharide aus Jujube die Freisetzung von SCFAs wie Essigsäure, Propansäure, Isobuttersäure, 2-Methylbuttersäure in CNE-Ratten durch die Darmmikrobiota stimulierten. Darüber hinaus war nach der JP-Behandlung der SCFA-Spiegel in den Rattennieren mit CKD-Anämie verbessert, und die Veränderungstendenz stimmte mit der Kotprobe überein. Basierend auf der bestehenden Forschung wurde die Beziehung zwischen SCFAs und CNE allmählich klar. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Essigsäure das Immunsystem moduliert und akute Beschwerden lindertNiereVerletzungdurch Hemmung der NADPH-Oxidase-Signalübertragung in T-Zellen (Al-Harbi et al., 2018). Propansäure verhindert nachweislich das Fortschreiten der Adenin-induzierten CKD über den freien Fettsäurerezeptor 2 (FFA2) und FFA3 (Mikami et al., 2020). Daher schlossen wir, dass die Wiedererlangung des SCFA-Spiegels in den Nieren für eine erkrankte Niere von Vorteil war. Es wurde berichtet, dass JP die Diversität der Darmmikrobiota und die relative Häufigkeit der aktiven Mikrobiota (Bacteroides) von SCFAs bei Darmkrebsmäusen erhöht (Ji et al., 2020). Außerdem erhöhte JP die Konzentration der gesamten SCFAs in Stuhlproben (Ji et al., 2019). Daher schlossen wir, dass JP die Produktion von SCFAs stimulieren könnte, um den Zweck der Verzögerung des Fortschreitens von CKD zu erreichen. JP könnte auch ein Stoffwechselsubstrat für SCFAs-dominante Mikrobiota sein, um die SCFAs-Produktion bei CNI zu stimulieren, oder eine präbiotikaähnliche Komponente, um die Darmumgebung wiederherzustellen, insbesondere die Diversität der SCFAs-dominanten Mikrobiota, und die Freisetzung von SCFAs weiter zu fördern das Fortschreiten der CKD verhindern.

Im Allgemeinen sind SCFAs (kohlenstofffrei als 6) mit geringem Molekulargewicht und hoher chemischer Polarität schwierig direkt durch Chromatographieansätze zu analysieren. Eine Strategie zur isotopenmarkierten chemischen Derivatisierung von SCFAs könnte die Instrumentenempfindlichkeit verbessern und Analysefehler reduzieren, was eine nützliche Strategie für die Bestimmung von SCFAs in der LC-MS/MS-Analyse darstellt (Higashi & Ogawa, 2016). Kürzlich wurden mit Dansylhydrazin markierte Ansätze zufriedenstellend zum Nachweis von Ziel-Metaboliten im menschlichen Plasma, die Carbonsäure enthalten, eingesetzt (Chen & Zhang, 2020). Um dies zu unterstützen, haben wir in dieser Studie die chemische Derivatisierung basierend auf dem LC-MS/MS-Ansatz zur Bestimmung von 8 SCFAs im Rattenkot weiterentwickelt. SCFAs werden von der Darmmikrobiota produziert und fast 10 Prozent der SCFAs werden über den Kot ausgeschieden (Boets et al., 2015). Daher kann eine Stuhlprobenanalyse von SCFAs die Veränderungen in der Darmumgebung direkt widerspiegeln und hat mehr Referenz in der Multi-Omics-Gemeinschaftsanalyse zwischen SCFAs und Darmmikrobiota. Insbesondere stellten wir bei der Instabilitätsvalidierung fest, dass die mit Dansylhydrazin markierten SCFAs bei Raumtemperatur instabil waren und ihre Intensität im Massenspektrum mit der Zeit eine Abwärtstendenz zeigte, aber bei 4 °C 48 h lang stabil bleiben konnte. Daher sollten die Analyten nach der Derivatisierung der SCFAs vor der Analyse bei 4 ◦C aufbewahrt werden.

In den fortgeschrittenen CKD-Stadien 4–5 schränkt ein Mangel an EPO-Produktion die Erythropoese ein, die zum kritischsten Faktor bei der Entwicklung einer renalen Anämie beiträgt (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Die routinemäßige Behandlung mit Erythropoese-stimulierenden Wirkstoffen (ESAs) für Anämie wird von Leitlinien für die klinische Praxis empfohlen. Allerdings muss die Sicherheit von ESS, die mit einem erhöhten Todesrisiko und kardiovaskulären Ereignissen verbunden ist, befürchtet werden (Thavarajah & Choi, 2019). Bei Patienten mit renaler Anämie sollte die EPO-Expression im Vergleich zu den gesunden Körpern konsistent oder deutlich erhöht sein (Babitt & Lin, 2012). In einem frühen Stadium zeigte das EPO-Niveau den Aufwertungstrend, während das EPO-Niveau im späten Stadium einen Abwärtstrend im Vergleich zum frühen Stadium zeigte, sogar niedriger als normal (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´Cori's, & Derviˇsevi c, 2017). Entsprechend früheren Experimenten (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020) zeigten unsere Ergebnisse, dass der Serum-EPO-Spiegel bei Ratten mit CNE-Anämie verringert war. Wir haben jeweils die Nieren-EPO-mRNA und den Proteinspiegel bei CNE-Ratten nachgewiesen, und die Nieren-EPO-Proteinspiegel waren im Vergleich zur Scheingruppe leicht verringert, während die Nieren-EPO-mRNA-Menge abgebaut war und ihr Ausmaß größer war als der Serum-EPO-Spiegel. Die Niere ist die Hauptquelle der EPO-Synthese bei Erwachsenen und ERSD-Patienten.Nierenbehält jedoch die Fähigkeit, Erythropoetin zu produzieren (Bernhardt et al., 2010). Um die endogenen Serum-EPO-Spiegel zu korrigieren und sich an die renale Anämie anzupassen, wurde die EPO-Produktion der Niere jedoch aktiviertNiereVerletzungreduzierte EPO-mRNA-Expression (Schodel & Ratcliffe, 2019). Nach der JP-Behandlung war der Serum-EPO-Spiegel erhöht, ebenso wie die Nieren-EPO-mRNA- und -Proteinspiegel waren beide erhöht. In unserer vorherigen Studie konnte JP die HRE-Transkriptionsaktivität stimulieren und das EPO-Gen verstärken (Chen et al., 2014). Daher spekulierten wir, dass JP den CKD-Rattenserum-EPO-Spiegel auf eine regulierte renale Anämie zurückführen könnte, was möglicherweise durch eine stimulierte Nieren-EPO-Genexpression auf mRNA-Ebene beigetragen wird.

Im Kortex wurde HIF-1 hauptsächlich im tubulären und HIF-2 im renalen Interstitium gefunden. Da EPO hauptsächlich von Fibroblasten produziert wird, in denen HIF-2 kolokalisiert ist, spricht dies dafür, dass HIF-2 für die Regulierung der EPO-Produktion verantwortlich sein könnte (Maxwell, 2003). In unserer Studie fanden wir heraus, dass HIF-1 und HIF-2 durch CNE aktiviert werden konnten und die JP-Behandlung die HIF-1- und HIF-2-Aktivität im Vergleich zu CNE-Ratten stimulieren konnte . Es wurde nachgewiesen, dass HIF-2 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der EPO-Produktion spielt (Kapitsinou et al., 2010), während die Hochregulierung von HIF-1 eine Nierenschutzwirkung in der Niere ausüben kann (Jiang et al., 2020), was indirekt die EPO-Produktion verbessert. Die EPO-Produktion der Niere wurde zunächst auf mRNA-Ebene reguliert, unter Anämie oder Hypoxie konnte die EPO-mRNA-Expression durch HIF-Proteinstimulation erhöht werden. Zuvor zeigte die pharmakologische Forschung, dass Jujube die EPO-Expression über die Regulierung des HIF-Proteinspiegels im Zellmodell stimuliert (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Daher schlossen wir, dass JP die EPO-mRNA-Expression über das HIF-Protein hochregulieren kann, um den Zweck der Linderung der renalen Anämie zu erreichen.

Darüber hinaus spekulieren wir auf der Grundlage aktueller Ergebnisse, dass die Reduktion von SCFAs eine entscheidende Rolle bei der HIF-vermittelten EPO-Expression spielen könnte, die zur CKD-Anämie beiträgt. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass der erhöhte Essigsäurespiegel für die HIF-2-Acetylierung und die Bildung des CREB-bindenden Protein-HIF 2 -Komplexes vorteilhaft war und die EPO-Expression weiter induzierte (Xu et al., 2014). Propionsäure dämpfte mitochondriale Störungen, hippocampale Apoptose und neurologische Defizite über den HIF-1 /ERK-Weg (Cheng et al., 2019). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Buttersäure HIF-1, aktive HIF-Zielgene auf Dickdarmzellen, stabilisiert und die entzündliche Reaktion des Dickdarms abschwächt (Kelly et al., 2015). In unserer Studie fanden wir heraus, dass die Konzentrationen von Essigsäure, Propansäure und Buttersäure signifikant verringert waren, begleitet von einer abnormalen Expression von HIF-Protein bei CNE-Ratten, was darauf hindeutet, dass die Stabilität von HIF- mit der Abnahme von SCFAs zusammenhängen könnte und SCFAs haben könnten die Wirkung der Stabilisierung von HIF zur Regulierung der EPO-Expression.

5. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir bewiesen, dass JP die CKD und die damit verbundene Anämie, deren Mechanismus an der Regulierung der Freisetzung von SCFAs und der EPO-Produktion beteiligt war, verbesserte. Und JP könnte der bioaktive Inhaltsstoff von Jujube zur Behandlung von Anämie sein. Diese Ergebnisse könnten Hinweise für die Weiterentwicklung von JP als Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung von CKD-assoziierter Anämie liefern.

Ethische Aussage

Alle Tierversuche in unserer Forschung wurden mit Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission der Guangzhou University of Chinese Medicine genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit der Richtlinie des National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichungen Nr. 80-23, überarbeitet 1996). Es gibt keinen Verstoß gegen die oben genannten Richtlinien in unserer Forschung.

Danksagungen

Diese Arbeit wird von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (2018A030313305), der Natural Science Foundation of China (81804052, 81973577 und 82004248), dem Shenzhen Science and Technology Plan Project (JSGG20191129102216637 und ZDSYS201606081515458), dem Traditional Chinese Medicine Bureau of Guangdong Province ( 20201320).

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