Teil 2 Echinacosid erhöht die Spermienmenge bei Ratten, indem es auf den Androgenrezeptor des Hypothalamus abzielt

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Diskussion

Ethnopharmakologische Aufzeichnungen und unsere vorherige Studie13 bestätigten diesCistanche tubulosaExtrakte erhöhen effektiv den Sexualhormonspiegel und verbessern die Spermienqualität.EMals eine der Hauptverbindungen inCistanche tubulosa19,20, können die Anzahl der Spermien erhöhen und die Sekretion von LH und T erhöhen (Abb. 1). In dieser Studie haben wir das gezeigtEMstatt auf die Hoden im Hypothalamus verteilt wurde, was auf eine indirekte Wirkung von ECH auf die Hoden hindeutet. Tatsächlich hemmte ECH direkt die hypothalamische AR-Aktivität, die AR-Translokation zum Kern und die HPG-Achsen-bezogene Genexpression und bot auch Schutz vor BPA-induzierten reproduktiven Schäden.

In Studien zur Produktion von menschlichem Gonadotropin werden die Sexualhormonspiegel streng durch die HPG-Achse und eine negative Rückkopplungsschleife reguliert21. Die T-Sekretion wird nämlich als Reaktion auf konsistente und anhaltende Erhöhungen der Blut-LH-Spiegel als Reaktion auf einen Mangel an negativer androgener Rückkopplung an die Hypophyse und den Hypothalamus deutlich erhöht. In dieser Studie,EMerhöhte die Sekretion von LH im Gehirn plus Hypophyse und die Produktion von Testosteron im Hoden und die mRNA-Spiegel von LHR und Gnrhr im Gehirn plus Hypophyse (Abb. 1 und Abb. 4), was darauf hindeutetEMkann das negative Feedback der HPG-Achse beeinflussen. Es überrascht nicht, dass AR selbst eine wichtige Rolle bei der Rückkopplungsregulierung von T- und LH-Spiegeln spielt22,23. Das Paradigma der männlichen HPG-Achse konzentriert sich auf Testosteron, das eine Unterdrückung der negativen Rückkopplung sowohl auf der Ebene des Hypothalamus als auch der Hypophyse bewirkt24,25. Frühere Studien verwendeten Foxg1-Cre, um interessierende Gene in der Hypophyse, aber nicht im Hypothalamus abzutragen, um die relative Bedeutung der beiden Regionen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die AR-Signalgebung in der Hypophyse der männlichen Maus im Hinblick auf die testosteronabhängige Regulation der LH-Sekretion entbehrlich ist26. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, uns für weitere Studien auf hypothalamische AR zu konzentrieren.

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Als Steroid-Kernhormonrezeptor wird die Aktivität von AR durch den Steroidliganden T reguliert, dessen Bindung die Kerntranslokation und die Transkriptionsregulationsfunktion von AR27 initiiert. In dieser Studie haben wir das gezeigtEMDie Behandlung hemmte die AR-Translokation aus dem Zytoplasma in die Kerne im Hypothalamus (Abb. 3). Darüber hinaus zeigte die PK-Studie diesEMdeutlich in den Hypothalamus statt in die Hoden eindringen kann, was darauf hindeutet, dass mehr ECH die Blut-Hirn-Schranke passiert, möglicherweise über Endozytose, als die Blut-Hoden-Schranke. Darüber hinaus haben wir durch indirekten ELISA die Kombinationsfähigkeit von ECH und AR demonstriert, was darauf hindeutet, dass ECH direkt an AR binden kann. Dies wurde weiter durch Ergebnisse des Molekül-Docking-Assays gestützt, die darauf hindeuteten, dass mutmaßliche Bindungsstellen für ECH bei Met-894 und Val-713 in der AR-Tasche existieren (Fig. 5D). Dies unterstützt die Erkenntnisse anderer, dass AR an der Regulierung einer negativen Feed-Schleife beteiligt ist und dass eine Verringerung der AR-T-Wechselwirkungen im Gehirn zu einer erhöhten LH-Sekretion führt23,28,29

Die Steroidogenese ist ein streng kontrollierter, wesentlicher Prozess für die Entwicklung der Spermatogenese unter Beteiligung des steroidogenen Proteins (StAR)30 und steroidogener Enzyme wie CYP11A1, CYP17A1, 3 -Hydroxysteroiddehydrogenase (HSD3) und 17 -Hydroxysteroid Dehydrogenase (HSD17), die Cholesterin in Testosteron umwandelt31. Wir haben gezeigt, dass die mRNA-Spiegel der Gene, die diese Enzyme kodieren, signifikant mit angestiegen sindEMBehandlung, während sich die Expression von StAR-mRNA nicht veränderte. Das deutet darauf hinEMhatte keinen Einfluss auf die Übertragung von Cholesterin auf die innere Membran der Mitochondrien, während es möglicherweise eine Rolle bei der Förderung der Cholesterinumwandlung in Testosteron spielt. Daraus kann dann der Schluss gezogen werdenEMDie Behandlung erhöht die Spermienzahl signifikant, indem sie die Testosteronsynthese und -sekretion steigert.

Um die Schutzwirkung von zu untersuchenEMBei Spermienverletzungen wurde Bisphenol A (BPA), ein typischer exogener endokriner Disruptor, als Modell für männliche Reproduktionsschäden bei Mäusen verwendet32.EMDie Behandlung stellte effektiv die Anzahl der Spermien, die Beweglichkeit der Spermien und die durch BPA verringerten T- und LH-Spiegel wieder her (Abb. 6A, B), was darauf hindeutet, dass ECH die Schädigung der Spermien abschwächen kann.

Im Vergleich zu den künstlich synthetisierten Chemikalien für die Hormonersatztherapie,EMist eine natürliche nicht-hormonelle Verbindung, die eine negative Rückkopplung auf die HPG-Achse beeinflusst und dadurch die Sekretion von LH, T und die Spermienqualität erhöht. Dieser mechanistische Weg kann das männliche Fortpflanzungssystem schützen und somitEMkann als potentieller natürlicher Reproduktionsschutz angesehen werden. Hormonregulationen sind jedoch komplex und führen oft zu systemischen Effekten. Wie in Abb. 7 angegeben, erhöhte ECH die T- und LH-Sekretion und hemmte die AR-Aktivierung, was auch zu Folgen für andere gesundheits- oder krankheitsassoziierte Signalwege wie Osteoporose33 und Depressionen bei Männern34 führen kann. Daher sollten die umfassenden Wirkungen von ECH weiter reichen untersucht.

Zusammengenommen weisen unsere Ergebnisse darauf hinEMbindet an den AR im Hypothalamus und hemmt den Transfer des AR aus dem Zytoplasma in den Zellkern. Unsere Daten legen nahe, dass ECH an Stellen in der AR-Tasche an den Aminosäuren Met-894 und Val-713 bindet. Dies kann den Anstieg der T- und AR-Spiegel als systemische Reaktion auf den Ausgleich der Hormonspiegel erklären, indem die LH-Sekretion und ein anschließender Anstieg der T-Produktion und der Spermienzahl gefördert werden (Abb. 8).

Methoden

Ethik-Erklärung.

Diese Studie wurde unter strikter Einhaltung der vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Peking, China) festgelegten Richtlinien für Versuchstiere durchgeführt. Alle experimentellen Protokolle wurden von der Ethikkommission des Anyang Institute of Technology überprüft und genehmigt.

Versuchstiere.

Vier Wochen alte ingezüchtete Kunming-Mäuse (22 g–25 g) wurden vom Tierzentrum der vierten militärischen medizinischen Universität (Xi'an, China) erhalten. Die Tiere wurden unter kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur von 22 Grad ± 2 Grad, 70 Prozent ± 4 Prozent Luftfeuchtigkeit mit 12 h Hell-Dunkel-Wechsel und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten.

Versuchsbehandlung.

Experiment 1. Mäuse wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt, sieben Mäuse in jeder Gruppe (n=7).EM(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, China) wurde unter Verwendung einer Magensonde verabreicht, und Testosteronpropionat (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, China) wurde verabreicht durch intramuskuläre Injektion einmal täglich für 14 Tage gemäß dem folgenden experimentellen Design: Kontrollgruppe: normale Kochsalzlösung (10 ml/kg), ECH(L)-Gruppe (5 mg/kg), ECH(M)-Gruppe (20 mg/kg),EM(H)-Gruppe (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) und Enzalutamid (AR-Hemmer, einmal täglich jeden zweiten Tag für 14 Tage; 20 mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Shanghai, China).

Nach 2-wöchiger Behandlung wurden die Mäuse mit Diethylether anästhesiert, um Blutproben für die Analyse der Hormonspiegel zu sammeln. Die Mäuse wurden dann seziert, um den Hypothalamus, das Enzephalon plus die Hypophyse, die Hoden und die Cauda epididymis zu trennen. Proben der Cauda epididymis wurden zur Beurteilung der Spermienqualität in normale Kochsalzlösung mit 5 Prozent BSA gegeben, und der Hypothalamus, das Enzephalon plus die Hypophyse und die Hoden wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und für weitere Untersuchungen bei –80 Grad gelagert.

Experiment 2. Mäuse wurden zufällig in 10 Gruppen eingeteilt, fünf Tiere pro Gruppe.EM(20 mg/kg) wurde oral verabreicht und die Mäuse in jeder Gruppe wurden mit Diethylether zu den Zeitpunkten 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h anästhesiert, und 12 h nach Verabreichung zur Probenentnahme. Plasma wurde gesammelt und das Herz freigelegt. Perfusion von normaler Kochsalzlösung in die linken Ventrikel wurde durch eine Infusionsvorrichtung durchgeführt, bis die Leber und Lungen blanchiert waren. Zehn Hypothalami und Hoden wurden gesammelt, um die Gewebekonzentrationen von ECH zu bestimmen.

Experiment 3. Mäuse wurden zufällig in 4 Gruppen eingeteilt, sieben in jeder Gruppe.EMund BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, China) wurden unter Verwendung einer intragastrischen Sonde einmal täglich für 6 Wochen gemäß dem folgenden experimentellen Design verabreicht: Normalgruppe (Maisöl, 10 ml/kg, bw/d) , Modellgruppe: BPA-Gruppe (BPA 200 mg/kg, bw/d, Maisöl) und experimentelle Gruppe: BPA plus ECH-Gruppe (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg). Nach 42 Behandlungstagen wurden die Mäuse mit Diethylether anästhesiert und die Blutproben für Hormonspiegelanalysen gesammelt. Te Hoden und Cauda Epididymis wurden getrennt und gesammelt. Die Cauda epididymis wurde zur Beurteilung der Spermienqualität verwendet und die Hoden wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur weiteren Untersuchung bei –80 Grad gelagert.

Bestimmung der Spermienqualität. Vorbereitung der Spermiensuspension. Cauda-Epididymide wurden in 5 ml normaler Kochsalzlösung mit 5 Prozent BSA zerkleinert und für 5 Minuten bei 37 Grad inkubiert, um zu ermöglichen, dass sich ihr Inhalt im Medium ausbreitet. Spermienzahl: Nach dem von Yokoi (2003) beschriebenen Verfahren wurde die verdünnte Spermiensuspension (1:10; v/v; Spermiensuspension/10 Prozent Methanol) in jede Zählkammer eines Hämozytometers überführt und 5 min stehengelassen und dann unter einem Lichtmikroskop (Nikon, Instruments Inc., Japan) bei 200-facher Vergrößerung gezählt. Lebensfähigkeit der Spermien: Insgesamt 20 μl Spermiensuspension wurden mit einem gleichen Volumen Eosin-Nigrosin-Färbemittel für 2 Minuten gemischt; die ungefärbten Spermien wurden unter einem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung gezählt. Spermienbeweglichkeit: Insgesamt 10 μl Spermiensuspension wurden auf einen Glasobjektträger gegeben und unter einem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung entweder als mobil oder immobil aufgezeichnet.

Bestimmung des Hormonspiegels. Testosteron (T)- und LH-Spiegel wurden in Serum, Enzephalon plus Hypophyse und Hodenhomogenaten unter Verwendung von Radioimmunoassay (RIA)-Kits (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, China) quantifiziert. Kurz gesagt, Anti-Testosteron- oder Anti-LH-IgG-Antikörper (100 μl) und 125-I-konjugierter Anti-Maus-Antikörper wurden zu Proben oder dem Standard (100 μl) gegeben und über Nacht bei 4 Grad auf einem Schüttler gemischt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Tween 20 (500 &mgr;l) wurden die Mischungen 15 Minuten lang bei 4 Grad zentrifugiert (3500 U/min). Die CPM-Werte der Präzipitate wurden mit einem Radioimmunoassay-Instrument (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, China) bewertet und die Konzentrationen von T und LH wurden gemäß der Formel eines Standards berechnet Kurve. Der T- und LH-Variationskoeffizient beträgt 2,8 % bzw. 3,2 % in Probengruppen und 2,1 % bzw. 2,8 % in Standardgruppen.

Bestimmung der Genexpression durch quantitative Echtzeit-PCR. Gesamt-RNA wurde aus gefrorenem Hoden- und Enzephalon plus Hypophysengewebe unter Verwendung eines RNA Simple Total RNA-Kits (Tiangen, Peking, China) isoliert. Für die Applikation von cDNA wurde eine quantitative real-time PCR (q RT-PCR) mit 2 x SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) durchgeführt. Das PCR-Verfahren bestand aus 95 Grad für 30 Sekunden, gefolgt von 35 Zyklen von 95 Grad für 15 Sekunden, 58 Grad für 30 Sekunden und 72 Grad für 30 Sekunden. Die Schmelzkurvenanalyse wurde an den PCR-Produkten durchgeführt, um die Primerspezifität und Produktreinheit zu verifizieren. Für jede Platte wurde eine Dissoziationskurve erstellt, um die Herstellung eines einzigen Produkts zu bestätigen. Die relative Häufigkeit jeder mRNA wurde berechnet. Die für die Studie verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Westlicher Fleck. Für die AR-Expressionsanalyse wurden die Extraktion und Isolierung von zytoplasmatischem und nuklearem Protein unter Verwendung eines Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit (Beyotime, Nanjing, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Konzentrationen von zytoplasmatischen und Kernproteinen wurden unter Verwendung eines Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, China) bewertet. Proteinproben (80 ug) wurden auf einem 12-prozentigen und 5-prozentigen SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und auf PVDF-Membranen übertragen. Nach dem Blockieren wurden die Membranen mit Anti-AR-IgG-Antikörpern (1:1, 000; Bioss; Peking, China) und polyklonalen Maus-Anti-GAPDH-Antikörpern (1:1, 000; Wuhan Boster) inkubiert Biologisch

Technology, Wuhan, China) oder polyklonale Maus-Anti-Lamin b1-Antikörper für 2 h. Die Membran wurde dreimal mit TBST gewaschen und mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1:5, 000; Bioss; Peking, China) inkubiert. Das Signal wurde mit dem ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Shanghai, China) visualisiert.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Assay.

Blut wurde in heparinisierten Glasröhrchen gesammelt. Das Plasma wurde durch sofortiges Zentrifugieren bei 6,000 U/min für 10 min abgetrennt und für weitere Experimente bei -20 Grad gelagert. Die Hypothalamus- und Hodenproben von jedem Zeitpunkt wurden gepoolt und mit Methanol homogenisiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 10 000rpm bei 4 Grad wurde der Überstand durch N2 konzentriert und der Rückstand in 50 μl Methanol gelöst und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Zehn μl der filtrierten Probeflüssigkeit wurden zur Analyse in das HPLC-System injiziert. Die Standardkurve bestand aus Proben mit 50, 100, 250, 500 und 750 ng/ml ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, China). Plasma-Qualitätskontrollproben, die mit 75 ng/ml (niedrig), 150 ng/ml (mittel) und 300 ng/ml (hoch) des ECH versetzt wurden, wurden entsprechend vorbereitet, um die Genauigkeit und Präzision der Methode zu messen.

Die Chromatographie wurde mit einem HPLC-System (D2{{10}}00 Elite series, Hitachi, Japan) durchgeführt, das mit einem UV-Detektor (L-2400, Hitachi, Japan) gekoppelt war. Die Trennung wurde auf einer Termo-C18-Säule (250 mm × 4,6 mm ID, 4,6 μm Partikel) durchgeführt, die bei 25 Grad gehalten wurde. Die mobile Phase war ein Gradient, hergestellt aus 0,1 % Phosphorsäure, enthaltend 0,04 % Trimethylamin (Komponente A) und Methanol (Komponente B). Der lineare Gradient war wie folgt: 70–90 % A über 0-2 min, 60–70 % A über 2–6 min, 55–60 % B über 6–8 min und dann zurück zu 90 % A bei 8 Minuten sofort. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,8 ml/min. Der UV-Detektor wurde bei 332 nm betrieben. Als analytisches Maß wurde die Peakfläche ausgewertet.

Pharmakokinetische Studien an Mäusen. Das Eindringen von ECH in den Hypothalamus und die Hoden wurde einer pharmakokinetischen Analyse mit einer Arzneimittel- und Statistiksoftware (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China) unterzogen. Die pharmakokinetischen Parameter wurden mit der Nicht-Kompartiment-Methode basierend auf der statistischen Momententheorie bestimmt. Die vorläufigen pharmakokinetischen Parameter einschließlich der Zeit bis zur Peak-Konstante (Tmax), der Peak-Konzentration (Cmax), der Eliminationsgeschwindigkeitskonstante (Ke), der Eliminationshalbwertszeit (T0,5), der Fläche unter der Kurve (AUC{ {4}}–12), das scheinbare Verteilungsvolumen (Vc) und die Clearance (CL) wurden für die weitere Analyse erhalten. Gehirn/Plasma-Verhältnisse wurden basierend auf AUC0-t-Werten für Plasma und Gehirn berechnet.

Synthese und Identifizierung von ECH-Ovalbumin (ECH-OVA). Insgesamt 9,8 mg ECH und 1,0 mg Butandiolanhydrid wurden in 2 ml Pyridin gelöst und 12 h unter Rühren bei Raumtemperatur gemischt. Das Gemisch wurde durch N 2 konzentriert und der Rückstand wurde mit 10,8 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 19,3 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) kombiniert und in 4 ml N-Dimethylformamid (DMF) für 12 h unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zentrifugation bei 2, 000 g für 5 Minuten bei 4 Grad wurde der Überstand zu 5 ml PBS gegeben, in dem 14,4 mg Ovalbumin (OVA) gelöst waren. Die neue Mischung wurde 24 h bei 4 Grad gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann drei Tage lang gegen PBS dialysiert. Das Vorhandensein von ECH-OVA wurde durch UV-Spektren (Shimadzu Scientific Instruments, Inc. Columbia, MD USA) bei einer Wellenlänge im Bereich von 190 bis 400 nm sowie durch denaturierende PAGE bestätigt.

Indirekter ELISA (iELISA). Eine Mikrotiterplatte wurde mit dem ECH-OVA (2 ug/100 ul) beschichtet und über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen, und 5 Prozent PBSM (PBS mit 5 Prozent Magermilch) wurde zugegeben, um die ungebundenen Stellen bei 37 Grad für 2 Stunden zu blockieren. Nachdem die Platten mit PBST und PBS gewaschen worden waren, wurden die Vertiefungen in 4 Gruppen eingeteilt; experimentelle Gruppe, 1 ug AR-Gesamtprotein/100 μl; positive Gruppe, Kaninchen-Anti-OVA-Antikörper (1:1, 000); negative Gruppe, 1 ug Rinderserumalbumin; und eine leere Gruppe, die PBS enthält. Nach 1,5-stündiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und 100 μl/Vertiefung Kaninchen-HRP-konjugiertes IgG (1:1, 000) wurden zur positiven Gruppe hinzugefügt, 100 μl/Vertiefung Anti-AR wurden hinzugefügt ( 1:1,000) zu den anderen Gruppen. Nach 1,5-stündiger Inkubation wurde Kaninchen-HRP-konjugiertes IgG (1:5, 000)-Verdünnung zu den Platten gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37 Grad wurden die Platten dreimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen. TMB wurde dann hinzugefügt und für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und 2 M H 2 SO 4 wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm abgelesen.

Molekulares Andocken. Eine molekulare Docking-Studie wurde durchgeführt, um den Bindungsmodus der Verbindung ECH an den menschlichen Androgenrezeptor (AR) unter Verwendung von Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu) zu untersuchen. Die dreidimensionale (3D) Struktur von AR (PDB ID: 2YHD) wurde von der Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do) heruntergeladen. Die 3D-Struktur von ECH wurde mit der Software ChemBioDraw Ultra 14.0 und ChemBio 3D Ultra 14.0 erhalten. Das Paket AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) wurde verwendet, um die Docking-Eingabedateien zu generieren. Das Suchraster von AR wurde als Mitte x: 36.141, Mitte y: 8.513 und Mitte z: 21.304 mit den Dimensionen Größe x: 15, Größe y: 15 und Größe z: 15 identifiziert. Der Wert der Vollständigkeit wurde auf 20 gesetzt. Für das Andocken von Vina wurden die Standardparameter verwendet, wenn dies nicht erwähnt wurde. Die am besten bewertete Pose, beurteilt anhand des Vina-Docking-Scores, wurde ausgewählt und mit der Software PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org) visuell analysiert. Datenanalyse und statistische Methoden.

Datenanalyse und statistische Methoden. Die Daten wurden mit der Statistiksoftware SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) analysiert. Zum Vergleich zwischen den Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. Tukey-Vergleichstests für signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) unter Verwendung der Graph Pad Prism-Software v.7 (GraphPad Sofware, Inc, Kalifornien, USA) ausgedrückt.

Ethik-Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme. Die ethische Genehmigung für diese Studie wurde von der Ethikkommission des Anyang Institute of Technology eingeholt